白喉棒狀桿菌熒光pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 在本發(fā)明涉及一種采用實時熒光PCR方法特異性檢測樣品中白喉棒狀桿菌核酸的 試劑盒，屬于白喉棒狀桿菌的體外診斷領域。
【背景技術】
[0002] 白喉棒狀桿菌(C. diphtheriae)是引起小兒白喉的病原菌，棒狀桿菌屬。白喉棒狀 桿菌可存在于假膜、鼻及鼻咽分泌物中，主要通過呼吸道傳播，也可通過污染的物品如玩具 等傳播。白喉棒狀桿菌侵入易感者上呼吸道，在鼻咽部等處黏膜上繁殖，產(chǎn)生外毒素，引起 感染的局部黏膜上皮細胞壞死、血管擴張、白細胞和纖維蛋白滲出形成灰白色假膜，導致白 喉病。在檢測中，PCR法由于其快速簡便的特點逐漸呈現(xiàn)出要替代以細菌培養(yǎng)和血清學檢測 為主的傳統(tǒng)檢測方法的趨勢。而對于PCR方法來說，引物的特異性是其檢測的特異性和敏感 性的基礎。
[0003] 本發(fā)明針對白喉棒狀桿菌基因序列的保守區(qū)域特異的靶序列設計引物和Taqman 探針，利用real-time PCR的方法，用來快速檢測樣品中是否存在白喉棒狀桿菌的核酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 在本發(fā)明主要解決的技術問題是快速準確地檢測樣品中是否存在白喉棒狀桿菌， 提供一種特異性檢測白喉棒狀桿菌的熒光PCR試劑盒。
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現(xiàn)的： 一種特異性檢測樣品中白喉棒狀桿菌核酸的試劑盒，其組分包括PCR反應液、酶混合 液、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，其中PCR反應液主要含有相關的引物和探針、反應緩沖液、 Mg2+和dNTP等，酶混合液主要含有熱啟動Taq酶，陰性質(zhì)控品為無 RNase和DNase水，陽性質(zhì)控 品為含有白喉棒狀桿菌檢測靶序列的重組質(zhì)粒。
[0006] 其中PCR反應液中用于核酸擴增的引物為P1和P2，P1和P2為針對白喉棒狀桿菌基 因組群特異性保守序列設計并經(jīng)預實驗篩選出的特異性引物;PCR反應液中用于熒光信號 監(jiān)測的寡核苷酸探針為ProbeUProbel為針對白喉棒狀桿菌基因組群特異性保守序列設計 并經(jīng)預實驗篩選出的特異性探針，其中熒光報告基團XiSFAM，熒光淬滅基團YiSEclipse (見表1)。
[0007 ]表1檢測白喉棒狀桿囷的引物和探針序列
本發(fā)明的另一個目的是提供本熒光PCR檢測試劑盒在檢測白喉棒狀桿菌的應用方法， 包括： 試劑盒選用的PCR反應體系為20 μL，包括2XPCR緩沖液10 yUlOmmol/L dNTP 1.0 μ 1、25_〇1/1引物各0.5 yUlOymol/L探針0.2 μL、熱啟動Taq酶混合液0.4 μL、樣品DNA 2 μL，加滅菌水至終體系20 μL。
[0008] 試劑盒的PCR反應循環(huán)參數(shù)為94°C，2min;進入循環(huán)階段:94°C變性10s，56°C退火 50s，72°C延伸15s，共反應40個循環(huán)。
[0009] 質(zhì)量控制:每次實驗應設立陰、陽性對照，陰性對照無 Ct值(或Ct值為0)，陽性對照 Ct值< 30，否則實驗結果不成立。
[0010] 結果判讀： 陽性：出現(xiàn)"S"型擴增曲線，Ct值< 35;可疑：出現(xiàn)"S"型擴增曲線，但Ct值> 35;陰性:沒 有出現(xiàn)"S"型擴增曲線，或者曲線雖然超過了閾值，但不呈"S"型;對可疑結果，應重復實驗， 如果重復實驗還是出現(xiàn)"S"型擴增曲線，陰性對照沒有污染，可判斷為陽性。
[0011] 樣本要求：臨床樣本類型包括咽拭子和培養(yǎng)物；臨床樣本采集后應帶冰運輸，-20 °C保存，不能反復凍融;從臨床樣本提取DNA，建議采用性能穩(wěn)定可靠的商品化試劑盒，具體 方法參見相應商品化試劑盒說明書，提取的DNA應立即檢測，否則，應將DNA分裝后-80°C~_ 20°C保存。
[0012] 本發(fā)明提供的試劑盒具有很好的特異性，可以檢出白喉棒狀桿菌，但不能檢出非 白喉棒狀桿菌病原體的核酸;對白喉棒狀桿菌核酸的檢測下限為10拷貝每反應體系；只需 要2小時即可完成檢測，可為白喉棒狀桿菌的疾病監(jiān)測和臨床診斷提供實驗依據(jù)。
【附圖說明】
[0013] 圖1為單重實時熒光PCR檢測白喉棒狀桿菌陽性標準品的擴增曲線圖。從左至右的 每組曲線對應濃度依次為2X 106-2 X 102C〇pieSAil，試劑盒對白喉棒狀桿菌的檢測限均為 10拷貝每反應體系。橫坐標為反應循環(huán)數(shù)，縱坐標為不同循環(huán)數(shù)熒光檢測信號的A Rn值。
[0014] 圖2為單重實時熒光PCR檢測體系檢測10種細菌基因組DNA的擴增曲線圖。10種細 菌包括：白喉棒狀桿菌和9種陰性對照微生物。白喉棒狀桿菌出現(xiàn)S型擴增曲線，而其他9種 病原微生物未出現(xiàn)S型擴增曲線。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合具體實施例詳細說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。需要指出的是，這里列出 的實施例僅僅為示例性說明的目的，而不應將其解釋為對本發(fā)明范圍的任何限制。其中使 用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實施例中具體選擇的試劑，應理解，本領域技術人 員可根據(jù)需要選擇其他公司的相應試劑以實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0016] 引物和TaqMan探針的設計與合成 利用Blast工具對Genbank和國內(nèi)外文獻中的白喉棒狀桿菌基因組序列進行分析，分別 選擇其穩(wěn)定的保守區(qū)域作為檢測靶序列。白喉棒狀桿菌檢測靶序列來源于白喉毒素假基 因；并針對檢測靶序列設計和合成引物和探針(見表1)。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶 生物公司合成，白喉棒狀桿的檢測探針5 '端標記FAM熒光基團；3 '端標記Eel ipse熒光淬滅 基團。
[0017] 檢測菌種的準備 本實施例中所使用的白喉棒狀桿菌以及其他陰性對照菌株(潰瘍棒狀桿菌，假白喉棒 狀桿菌，溶血棒狀桿菌，金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌，大腸桿菌，微小棒狀桿菌，流感嗜血 桿菌，炭疽芽孢桿菌)均購買于中國藥品生物制品檢定所。
[0018] 菌株DNA的抽提 選用Qiagen公司QIAamp DNA Mini Kit(貨號：51306)提取菌株DNA。具體步驟試劑盒參 考操作說明書。
[0019] 引物和探針的篩選 采用設計的引物和探針檢測提取的白喉棒狀桿菌和陰性對照菌株的基因組DNA，經(jīng)反 復實驗，篩選出靈敏度、特異性和重復性最佳的引物探針組合。（見序列表，白喉棒狀桿菌 (正向引物P1、反向引物P2和探針Probe 1) 標準品的構建與制備 利用P1和P2引物擴增白喉棒狀桿菌基因組DNA，將PCR產(chǎn)物克隆至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化 DH5a大腸桿菌，利用堿裂解法提取陽性克隆質(zhì)粒，利用紫外可見分光光度計分別測定在波 長260nm處、280nm處DNA的吸光率，然后計算質(zhì)粒濃度與純度。然后10倍梯度稀釋至200拷貝 每微升，制備白喉棒狀桿菌的陽性標準品。
[0020] 反應條件優(yōu)化 對引物、探針、酶等要素逐一優(yōu)化，確定的反應體系為：2XPCR緩沖液10 μ1、10_〇?Α dNTP 1.0yl、25ymol/L引物各0.5 yl、10ymol/L 探針0.2 yl、Takara聚合酶混合物0.4 μL、 模板2 μL，加滅菌水至終體系20 μL。
[0021] 根據(jù)擴增片段長短、引物和探針的退火溫度以及酶的特性，主要對反應的退火溫 度和延伸時間進行了優(yōu)化，最終確定循環(huán)參數(shù)為:94°C，2min;進入循環(huán)階段:94°C變性10s， 56°C退火50s，72°C延伸15s，40個循環(huán)，每個循環(huán)在退火階段采集熒光信號。
[0022]在擴增結束后按同一條件分析數(shù)據(jù)，確定各樣品的Ct值。
[0023]檢測限的評價 以上述5中的陽性標準品評價本發(fā)明提供的試劑盒的檢測限，陽性標準品濃度為:2X lC^copies/yl、2 XlC^copies/yl、2 X104copies/yl、2 X lC^copies/yl、2 X 102copies/yl，本 發(fā)明提供的試劑盒對白喉棒狀桿菌核酸的檢測下限為10拷貝每反應體系。
[0024] 檢測特異性的評價 以上述菌株DNA為模板評價了本試劑盒的特異性。對白喉棒狀桿菌DNA進行檢測時均可 見明確擴增曲線，對上述9種其他咽部常見病原微生物DNA檢測時，未產(chǎn)生陽性擴增曲線，說 明我們使用的探針和引物與我們選定的其他菌株之間不存在交叉反應。
[0025] 盡管上文中以優(yōu)選的方式，通過具體實施例示例性說明了本發(fā)明的某些實施方 式，但是本領域技術人員應了解，本發(fā)明并不限于上面所公開的實施方式，而是可以根據(jù)本 發(fā)明所屬技術領域的知識對其進行修改，所作修改不會超出本發(fā)明要求保護的范圍。例如， 本發(fā)明所使用的熒光實時PCR也可以根據(jù)需要采用說明書中所列出的實施例中指出的熒光 報告基團和熒光淬滅基團以外的標記物質(zhì)，如 物;或使用Taqman技術之外的其他標記體系，例如MGB探針、分子信標MB探針、蝎形探針、熒 光雙雜交探針等熒光探針標記技術;或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不飽和染料與LC Green等飽和染料，只要其使用了本發(fā)明所述的特異性引物序列，即可定性或定量檢測目的 基因的存在，進而特異性地檢測白喉棒狀桿菌的存在。所以，這些本領域技術人員所了解的 改變和慣用手段的替換也落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。本發(fā)明的保護范圍應由所附的權利要 求書限定。
[0026] 序列表
【主權項】
1. 在一種用于特異性檢測樣品中白喉棒狀桿菌核酸的試劑盒，其中包括PCR反應液、酶 混合液、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品;PCR反應液中用于核酸擴增反應的引物序列如下： PI：5'- GCTCGGAGAAAATTCATTCTAATG -3', P2:5'_ TCCACTGTTTTCTGGTACCCAA -3'， PCR反應液中用于熒光信號監(jiān)測的寡核苷酸探針的序列如下： Probe：5'-Xi- TTTCGTCGGATTCCATAGGCGTTC -Υι -3', Probe熒光報告基團X^FAM，焚光淬滅基團Y^Eclipse。2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于PCR反應體系為20 μL，包括2 XPCR緩沖液 10 yl、10mmol/L dNTP 1.0yl、25ymol/L引物各0.5 yl、10ymol/L 探針0.2 μL、熱啟動Taq 酶混合液〇.4μ1、樣品DNA 2μ1，加滅菌水至終體系20 μL。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種采用實時熒光PCR方法特異性檢測樣品中白喉棒狀桿菌核酸存在的試劑盒。利用本發(fā)明的試劑盒，可快速檢測樣品中是否存在白喉棒狀桿菌核酸。該試劑盒對白喉棒狀桿菌核酸的檢測限為10拷貝每反應體系，整個反應可在2小時內(nèi)完成，在疾病監(jiān)測、臨床診斷等領域具有重要的應用價值。
【IPC分類】C12R1/16, C12Q1/68, C12Q1/04
【公開號】CN105524995
【申請?zhí)枴緾N201610019376
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請人】江蘇和創(chuàng)生物科技有限公司
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2016年1月13日