一種極地適冷耐鹽褐藻酸裂解酶及其編碼基因c3與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種極地適冷耐鹽褐藻酸裂解酶及其編碼基因 c3與應(yīng)用，屬于生物技 術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 褐藻酸(alginate,alginic acid)又名褐藻膠、海藻膠，是一種主要來源于海產(chǎn)褐 藻的酸性多糖。褐藻酸是由β-D-甘露糖醒酸（0-D-mannu;ronate，M)與其差向異構(gòu)體日寸-古 羅糖醒酸(a-L-guluronate，G)兩種單體通過1，4糖巧鍵連接而成的非支鏈多糖。目前商品 化的褐藻酸多W褐藻酸鹽的形式存在。褐藻酸鹽具有良好的親水性、成凝膠、粘稠性W及生 物相容性，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工等多個領(lǐng)域。而褐藻酸降解產(chǎn)物-褐藻低聚糖/褐藻 寡糖具有抗腫瘤、促進生長、增強免疫活性、抗氧化、抗炎等多種生物學(xué)活性和藥用價值，近 年來受到廣泛的關(guān)注，成為新的研究熱點。
[0003] 褐藻酸裂解酶能夠催化褐藻酸的降解，通過β-消除機制作用于含有古洛糖和甘露 糖的C-0糖巧鍵，在產(chǎn)物的非還原末端C4,5間生成不飽和糖醒酸4-deo wA-eirthro-hex- 4-enopyranosylu;ronic acid。該酶根據(jù)作用底物的不同可分為β-D-l，4-甘露糖醒酸裂解 酶化C4.2.2.3，PM型）和αΑ-1，4-古洛糖醒酸裂解酶化C4.2.2.11，PG型）。聚甘露糖醒酸和 聚古羅糖酸酸片段是褐藻酸分子所特有的，賦予了褐藻低聚糖和褐藻寡糖多樣的生物學(xué)活 性，在醫(yī)藥、保健品領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景，其需求量也越來越大。相對于傳統(tǒng)的酸 解生產(chǎn)方式，用褐藻酸裂解酶酶法制備褐藻低聚糖/寡糖具有反應(yīng)條件溫和、可操控性強、 產(chǎn)率高等優(yōu)點，因而成為褐藻資源生物高值化應(yīng)用的強有利的工具。
[0004] 褐藻酸裂解酶在自然界中廣泛分布，主要來源于微生物，海洋藻類、海洋軟體動物 和棘皮動物等。細菌來源的褐藻酸裂解酶種類多，來源廣，便于生產(chǎn)，便于異源表達等特點 具有很好的應(yīng)用潛力。微生物產(chǎn)生的褐藻酸裂解酶大多是中溫酶，而低溫和適冷的耐鹽褐 藻酸裂解酶則鮮有報導(dǎo)。適冷耐鹽褐藻酸裂解酶在低溫高鹽條件下具有很高的活性，在食 品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。新型適冷耐鹽褐藻酸裂解酶的發(fā)現(xiàn)對于該酶的研究及 應(yīng)用都具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種海洋褐藻酸裂解酶及其編碼基因 c3與應(yīng) 用。
[0006] 一株冷單胞菌(Psychromonas sp. )C-3,2015年12月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物 保藏中屯、，地址湖北省武漢市武昌區(qū)八一路塔挪山，保藏號CCTCC Μ 2015748。
[0007] 一種海洋褐藻酸裂解酶基因 c3,核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[000引上述基因編碼的海洋褐藻酸裂解酶C3,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009] -種重組表達載體，該表達載體包含有如SEQ ID NO. 1所示核巧酸序列的功能片 段。
[0010] -種重組細胞，該宿主菌包含有上述重組表達載體或表達上述海洋褐藻酸裂解酶 C3。
[0011] 上述海洋褐藻酸裂解酶C3和/或上述海洋褐藻酸裂解酶基因 c3在褐藻酸裂解中的 應(yīng)用。
[0012] 褐藻酸裂解酶基因 c3是從分離自北極黃河站海帶樣品的Psychromonas SP.C3的 基因組DNA中克隆得到的。對具備褐藻酸降解能力的該菌株全基因測序，得到可能編碼褐藻 酸裂解酶的基因 c3,在信號膚預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測其信號膚長度，并根據(jù)其序列設(shè)計特異性引物， 利用PCR技術(shù)從Psychromonas SP.C3的基因組DNA中克隆了編碼褐藻酸裂解酶的基因 c3,構(gòu) 建了含褐藻酸裂解酶基因 c3的表達載體W及含有該表達載體的大腸桿菌重組細胞對該基 因的核酸序列進行了測定。測序結(jié)果表明褐藻酸裂解酶基因 c3為一個含有861個核巧酸的 開放閱讀框架，該開放閱讀框架共編碼286個氨基酸。運用在線信號膚預(yù)測網(wǎng)站SignalP預(yù) 測褐藻酸裂解酶C3的信號膚由20個氨基酸組成，因此褐藻酸裂解酶C3是一個含有20個氨基 酸的信號膚，共編碼286個氨基酸的多膚。序列分析表明，褐藻酸裂解酶C3屬于多糖裂解酶 第屯家族。對切去信號膚的純化的褐藻酸裂解酶C3進行性質(zhì)測定。結(jié)果表明該酶對甘露糖 醒酸段表現(xiàn)出特異性降解。最適pH為8.0，且在抑6.0~10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定存在。最適酶活溫 度為20°C，且在0°C仍保持超過40%的活力，表現(xiàn)出良好適冷性。C3對高濃度的化C1也表現(xiàn) 出很好的耐受性。
[OOU] 有益效果：
[0014] 1、本發(fā)明所述的褐藻酸裂解酶C3在低溫下有較高酶活性，中高溫下不穩(wěn)定，從而 保證了其使用的安全性；
[0015] 2、本發(fā)明所述的褐藻酸裂解酶C3表現(xiàn)出顯著高鹽高活性的特點，在3M化C1中的 酶活性仍超過100 %;
[0016] 3、本發(fā)明所述的褐藻酸裂解酶C3只降解PM的運一特性可用于從褐藻酸鋼中制備 甘露糖醒酸寡糖。
【附圖說明】
[0017] 圖1、通過PCR擴增克隆的編碼極地褐藻酸裂解酶C3的基因片段的電泳圖 [001引其中泳道2為擴增的DNA片段
[0019] 圖2、在大腸桿菌中異源表達純化得到的藻酸裂解酶C3電泳圖；
[0020] 圖3、極地褐藻酸裂解酶C3的酶活溫度曲線；
[0021 ]其中：（A)溫度對酶活性的影響，（B)溫度對酶穩(wěn)定性的影響；
[0022] 圖4、不同濃度的NaCl對極地褐藻酸裂解酶C3酶活性的影響曲線；
[0023] 圖5、極地褐藻酸裂解酶C3的酶活抑曲線；
[0024] 圖6、極地褐藻酸裂解酶C3的底物特異性分析。
【具體實施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。
[0026] 培養(yǎng)基：
[0027] 富集培養(yǎng)基:0.5wt %蛋白腺、0.1 wt %酵母粉、0.5wt %褐藻酸鋼，人工海水配制， pH6.5。
[002引分離培養(yǎng)基:0.5wt%蛋白腺、0.1 wt%酵母粉、0.5wt%褐藻酸鋼、1.5wt%瓊脂，人 工海水配制，P冊.5。
[0029] LB液體培養(yǎng)基:1 wt %蛋白腺，0.5wt %酵母粉，1 wt % NaCl，蒸饋水配制。
[0030] LB固體平板：Iwt%蛋白腺，0.5wt%酵母粉，Iwt%化C1，1.5wt%瓊脂，蒸饋水配 制。
[0031] 實施例1:極地褐藻酸裂解酶C3編碼基因序列的獲取及其序列分析
[0032] 菌種來源:菌株P(guān)sychromonas SP.C3分離自北極黃河站采集的海帶樣品。一株冷 單胞菌Psychromonas sp. C-3，2015年12月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，地址湖北 省武漢市武昌區(qū)八一路塔挪山，保藏號CCTCC Μ 2015748。
[0033] 具體步驟如下：
[0034] 1.1菌株的篩選
[0035] 將海帶樣品放入富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再用滅菌海水梯度稀釋涂布于分離培養(yǎng)基平 板。選取生長良好的菌落進行純培養(yǎng)。取純培養(yǎng)菌株，點種于分離培養(yǎng)基平板上，15°C培養(yǎng) 4她，測定菌株的直徑。然后加入5mL質(zhì)量濃度為10%的西化氯錠溶液，輕輕旋轉(zhuǎn)平板使溶液 均勻鋪滿整個平皿，靜置lOmin充分染色，然后用清水沖洗培養(yǎng)基表面去除西化氯錠溶液， 測定透明圈的直徑，并計算透明圈與菌落的直徑比。
[0036] 1.2極地褐藻酸裂解酶C3基因序列的確定
[0037] 選取固體平板上產(chǎn)生透明降解圈的菌株C3,大量提取其基因組DNA:
[0038] (1)培養(yǎng)100ml細菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài)，質(zhì)量濃度為3 %NaCl溶液洗菌體2次；
[0039] (2)沉淀物加入5ml質(zhì)量濃度為3%NaCl溶液，用吸管反復(fù)吹打使之重懸；
[0040] (3)加入10ml TE，輕晃混勻；
[0041 ] (4)加入溶菌酶，使其終濃度為lmg/ml，37°C作用1~化；
[0042] (5)加入質(zhì)量濃度為20 % SDS和20mg/mL蛋白酶K至終濃度0.1 mg/ml，55°C溫育化；
[0043] (6)向菌體中加入65°C預(yù)熱的CTAB/NaCl溶液4ml，65°C溫育20min;
[0044] (7)加等體積酪/氯仿/異戊醇(25:24:1)震蕩lOmin后離屯、，抽提1次，上清液再用 等體積氯仿抽提1次；
[0045] (8)向上清中加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，用玻璃棒將DNA攬絲；
[0046] (9)DNA用質(zhì)量濃度為70%乙醇和無水乙醇各洗涂1次，稍干后溶于適量0.1XSSC 中，用紫外分光光度計測定DNA濃度及純度后置于4°C冰箱保存(可于-20°C長期保存）。
[0047] 經(jīng)全基因測序后通過對其基因注釋，得到可能編碼褐藻酸裂解酶的基因 c3。該基 因86化P，其中含有一個861bp的開放閱讀框架，其編碼極地褐藻酸裂解酶C3,起始密碼子位 于化P，終止密碼子位于859bp，共編碼286個氨基酸的蛋白。獲得的基因 c3的核巧酸序列如 SEQ ID NO. 1所示。其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[004引實施例2:褐藻酸裂解酶C3的克隆、異源表達及分離純化 [00例 2.1利用PCR對極地褐藻酸裂解酶c3基因序列進行擴增
[0050] (1)根據(jù)極地褐藻酸裂解酶c3基因序列