表達(dá)耐熱谷胺酰內(nèi)肽酶的工程菌、制備方法及應(yīng)用
【專利說(shuō)明】表達(dá)耐熱谷胺釀內(nèi)肽酶的工程菌、制備方法及應(yīng)用
[0001]發(fā)明所屬領(lǐng)域：
[0002] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體說(shuō)，本發(fā)明涉及表達(dá)耐熱谷胺酰內(nèi)肽酶的基因工 程菌的構(gòu)建，耐熱谷胺酰內(nèi)肽酶的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0003] 谷胺酰內(nèi)肽酶具有很強(qiáng)的底物特異性，它們特異性地水解蛋白質(zhì)或多肽底物中谷 氨酸或天冬氨酸羧基端所形成的肽鍵，而且這類酶水解谷氨酸α_羧基端所形成肽鍵的效 率是它們水解天冬氨酸α -羧基端所形成肽鍵的1 0 0 - 1 0 0 0倍（S ? r e n s e n e t al.1991.Fragmentation of proteins by S.aureus strain V8protease.FEBS Lett 294:195-197)。目前已知的谷胺酰內(nèi)肽酶大多數(shù)來(lái)源于中溫細(xì)菌，并已得到廣泛研究。早期 研究所發(fā)現(xiàn)的來(lái)自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的谷胺酰內(nèi)肽酶(也稱為V8 蛋白酶、Glu-C或SspA)分子量大小為29kDa，在pH 4 · 0-7 · 8條件下酶活性最高(Drapeau et al..1972.Purification and properties of an extracellular protease of Staphylococcus aureus.J Biol Chem 247:6720-6726)。隨后，人們陸續(xù)在芽抱桿菌屬、鏈 霉菌屬和腸球菌屬等中溫細(xì)菌中分離到谷胺酰內(nèi)肽酶。絕大部分的谷胺酰內(nèi)肽酶都是胞外 酶，在細(xì)胞內(nèi)以前體的形式合成，由信號(hào)肽引導(dǎo)分泌到胞外，并且大多數(shù)谷胺酰內(nèi)肽酶不能 自加工形成有活性的成熟酶，它們的活化依賴于其它蛋白酶對(duì)酶原的N端前肽進(jìn)行加工切 除。目前絕大多數(shù)谷胺酰內(nèi)肽酶是從原宿主的發(fā)酵液上清中純化獲得的，獲得率低，純化產(chǎn) 物中可能會(huì)含有中間體形式，而通過(guò)基因工程構(gòu)建的重組酶在大腸桿菌中不能自加工形成 成熟酶，不利于它們的應(yīng)用。
[0004] 谷胺酰內(nèi)肽酶對(duì)陰離子去垢劑SDS有一定的耐受性，在0.1 % -0.2 %的SDS存在的 條件下依然可以保持一定的活性，這也為其在質(zhì)譜測(cè)序領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。由于谷胺 酰內(nèi)肽酶具有高度的底物特異性，它們不僅作為工具酶在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和基于質(zhì)譜技 術(shù)的蛋白質(zhì)組研究中得到有效應(yīng)用（Gupta et al.2010.Analyzing protease specificity and detecting in vivo proteolytic events using tandem mass spectrometry · Proteomics 10:2833-2844)，而且在食品及飼料加工、多肽合成等領(lǐng)域也具 有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。但是，來(lái)源于中溫細(xì)菌的谷胺酰內(nèi)肽酶為嗜溫酶，最適反應(yīng)溫度在37-65 °C 之間（Leshchinskaya et al . 1997 . Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedius,strain 3-19.FEBS Lett 404:241-244)，穩(wěn)定性較差，在較高溫度條件下易 失活，因而在實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用中受到限制。特別是，蛋白質(zhì)底物在高溫條件變性后，原來(lái)埋 在分子內(nèi)部的肽鍵暴露而利于酶分子接近并水解，目前制備的谷胺酰內(nèi)肽酶在酶制劑的生 產(chǎn)、儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中穩(wěn)定性差，貨架期縮短，由于酶失活造成重大經(jīng)濟(jì)損失。
[0005] 迄今為止，只有Demidyuk等于1997年報(bào)道從高溫放線菌(Thermoactinomyces)中 分離到一種谷胺酰內(nèi)肽酶，但該酶最適反應(yīng)溫度僅為55°C，在65°C保溫30min后即失活，并 未顯不出耐熱酶的特性（Demidyuk et al.，1997.Purification and characterization of serine Glu-Asp-specif ic proteinase from Thermoactinomyces species.Biochemistry(Moscow)62:414-422)〇
[0006] 發(fā)明技術(shù)內(nèi)容：
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的基因工程菌株，該菌株高效表達(dá)的耐熱谷胺酰 內(nèi)肽酶耐高溫，熱穩(wěn)定性好，在生產(chǎn)、儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中穩(wěn)定，具有較長(zhǎng)的貨架期。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備表達(dá)耐熱谷胺酰內(nèi)肽酶的基因工程菌的方 法。
[0009] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供制備耐熱谷胺酰內(nèi)肽酶的方法。
[0010] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是耐熱谷胺酰內(nèi)肽酶在高溫條件下應(yīng)用于蛋白質(zhì)底物的水 解。
[0011] 本發(fā)明公開(kāi)了一株新的可高效表達(dá)耐熱谷胺酰內(nèi)肽酶的基因工程菌，其特征在 于：由嗜熱細(xì)菌Thermoactinomyces sp.CDF的基因組為模板經(jīng)克隆得到的耐熱谷胺酰內(nèi)肽 酶TS-GSE的基因插入載體pET-26b( + )中得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-26b-TS-GSE于大腸桿菌 BL21(DE3)中轉(zhuǎn)化得到的基因工程菌，該工程菌保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào) 是CCTCC N0:M2015771，菌株名稱為大腸桿菌BL21(DE3)/pET-26b-TS-GSE，Escherichia co 1 i BL21 (DE3)/pET-26b-TS-GSE，保藏日期是2015年12月23日。中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 位于湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)校內(nèi)，電話:027-68752319,EMAIL: cctcciwhu.edu.cn. 在本發(fā)明公開(kāi)后，第三方研究者可依法從保藏機(jī)構(gòu)獲取菌種再現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容。
[0012] 在本發(fā)明中，采用CTAB/NaCl法提取高溫放線菌⑶F(Thermoactinomyces sp.CDF) 的基因組DNA，以嗜熱細(xì)菌Thermoactinomyces sp.CDF的基因組為模板經(jīng)克隆得到的耐熱 谷胺酰內(nèi)肽酶TS-GSE基因插入載體pET-26b (+)中得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-26b-TS-GSE于大 腸桿菌BL21(DE3)中轉(zhuǎn)化得到的基因工程菌，該工程菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏編號(hào)CCTCC N0:M2015771，菌株名稱為大腸桿菌BL21(DE3)/pET-26b-TS-GSE， Escherichia coli BL21(DE3)/pET_26b-TS_GSE。高溫放線菌Thermoactinomyces sp.CDF 由本室分離，菌種保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC AB 206328。
[0013] 本發(fā)明還公開(kāi)了制備表達(dá)耐熱谷胺酰內(nèi)肽酶的基因工程菌的方法，包括引物設(shè) 計(jì)，重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)造和宿主菌株轉(zhuǎn)化，其特征在于：
[0014] 1)引物設(shè)計(jì)是根據(jù)嗜熱細(xì)菌Thermoactinomyces sp.CDF中的耐熱谷胺酰內(nèi)肽酶 TS-GSE的基因序列和表達(dá)載體pET-26b( + )的序列特征，設(shè)計(jì)含有Nde I酶切位點(diǎn)的上游引 物和含有BamH頂每切位點(diǎn)的下游引物，
[0015]上游引物SEQ ID N0:1核苷酸序列是：
[0016] 5 '-CGGCATATGAAAGCCGATGCAGTGTTTGCC-3 '
[0017]下游引物SEQ ID歡2核苷酸序列是：
[0018] 5 '-CGCGGATCCCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTGGTCTTTCCAAGTGTTCAG-3 '
[0019] 2)重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)造是以耐熱谷胺酰內(nèi)肽酶TS-GSE基因序列為模板，運(yùn)用PCR擴(kuò) 增技術(shù)，得到克隆產(chǎn)物，用Nde頂每和BamH頂每雙酶切，并將酶切產(chǎn)物連接到載體pET-26b (+ )的雙酶切位點(diǎn)上得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-26b-TS-GSE。
[0020] 3)宿主菌株轉(zhuǎn)化就是將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-26b-TS-GSE轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3) 中，經(jīng)卡那霉素篩選并驗(yàn)證后獲得表達(dá)耐熱谷胺酰內(nèi)肽酶的基因工程菌BL21(DE3)/pET-26b-TS-GSE。
[0021 ] 在本發(fā)明中，本發(fā)明人以嗜熱細(xì)菌Thermoactinomyces sp.CDF的基因組為模板經(jīng) 克隆得到的耐熱谷胺酰內(nèi)肽酶TS-GSE基因插入載體pET-26b( + )中得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-26b-TS-GSE于大腸桿菌BL21 (DE3)中轉(zhuǎn)化得到基因工程菌。