一種保存尿液樣本中核酸的方法及其裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體而言涉及生物樣本中核酸的收集、保存方法及 其裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 20世紀(jì)90年代后期，科學(xué)家們提出生物樣本庫的概念，即標(biāo)準(zhǔn)化收集、處理、儲存 和應(yīng)用健康和疾病生物體的生物大分子、細(xì)胞、組織和器官等樣本，包括人體器官組織、全 血、血漿、血清、生物體液或經(jīng)處理過的生物樣本，并用于疾病的臨床治療和生命科學(xué)研究 的生物應(yīng)用系統(tǒng)。
[0003] 尿液由腎臟產(chǎn)生，且可以無創(chuàng)連續(xù)獲得。然而，目前生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的主要研究對象 血液，由于受穩(wěn)態(tài)機(jī)制的影響不易容納變化。而尿液沒有任何穩(wěn)定的機(jī)制，所以尿液也可能 是比血液更好的生物標(biāo)志物來源[1]。人體內(nèi)各種體液與器官的關(guān)系中很少有像尿液與腎 臟這般密切聯(lián)系且容易獲得的。除此之外，尿液不僅能夠動態(tài)的反映腎臟和泌尿系統(tǒng)的變 化，也能夠反映身體其它部位的異?；蚣膊⌒畔ⅰＲ虼嗽谀蛞褐袑ふ壹膊〉纳飿?biāo)志物可 能是生物標(biāo)志物研究領(lǐng)域中最易突破的方向之一。
[0004] 綜上所述，尿液是體內(nèi)的一種重要的生物樣本，而其中的尿液核酸應(yīng)該隨著病程 的發(fā)展被保存下來。大量尿液核酸的保存將促進(jìn)以后核酸生物標(biāo)志物的臨床樣本驗(yàn)證，利 于生物標(biāo)志物的研究以及最終向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。利用此方法，將尿液核酸樣本作為生物 樣本庫中的一員被保存變成了可能。
[0005] 目前，尿液的保存一般是凍存在-80°C的冰箱里，往往需要很大的空間。尿液由于 具有濃度稀，體積大，含鹽高，不適合直接大規(guī)模的原液保存。因此要以液體凍存的方式保 存如此眾多的尿液臨床樣本是非常耗費(fèi)人力物力的工作。
[0006] 鑒于此，人們?nèi)匀恍枰环N簡單廉價(jià)的保存尿液核酸的方法，可以作為全面保存 生物樣本的一部分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 因此，根據(jù)本公開的一些實(shí)施方式提供了一種收集尿液樣本中核酸的方法，其包 括如下步驟：
[0008] a)提供尿液樣本，b)去除尿液樣本中的雜質(zhì)，c)在存在壓差的情況下，使尿液樣 本依次通過吸附核酸的膜和濾紙，d)任選地，干燥吸附核酸的膜。如此得到的吸附核酸的 膜上便吸附有尿液樣本中的核酸。在一些實(shí)施方式中，吸附核酸的膜的干燥可以通過選自 如下的方式進(jìn)行：室溫自然干燥、在40°C至60°C下在烘箱中干燥。
[0009] 本公開還提供了一種保存尿液樣本中核酸的方法，其包括如下步驟：a)提供尿液 樣本，b)去除尿液樣本中的雜質(zhì)，c)在存在壓差的情況下，使尿液樣本依次通過吸附核酸 的膜和濾紙，d)干燥吸附核酸的膜，以及e)將吸附核酸的膜置于真空密封袋中于室溫、 4°C、_20°C或 _80°C保存。
[0010] 在本公開中，核酸是指DNA或RNA。在具體的實(shí)施方式中，尤其涉及保存尿液中的 RNA，因?yàn)镽NA極為容易被廣泛存在的RNA酶所降解。
[0011] 在一些實(shí)施方式中，吸附核酸的膜的干燥可以通過選自如下的方式進(jìn)行：室溫自 然干燥、在40°C至60°C下在烘箱中干燥。
[0012] 在一些實(shí)施方式中，去除尿液樣本中的雜質(zhì)是指去除尿液樣本中的不溶性物質(zhì)， 包括但不限于細(xì)胞或細(xì)胞的碎片。適用于本公開方法的去除方式是通過離心進(jìn)行的。
[0013] 為了使核酸截留在吸附核酸的膜上，需要使尿液樣本通過吸附核酸的膜。然而，吸 附核酸的膜是柔軟的，因此，需要將吸附核酸的膜放置在一個(gè)剛性支撐物上以便截留核酸； 同時(shí)在支撐物的兩側(cè)提供壓差，便于尿液樣本通過吸附核酸的膜。在一個(gè)具體的實(shí)施方式 中，將漏斗用作剛性支撐物，將吸附核酸的膜和濾紙放置在漏斗中。在具體的實(shí)施方式中， 在尿液樣本通過之前，吸附核酸的膜和濾紙是浸濕的。技術(shù)人員理解浸濕的吸附核酸的膜 和濾紙可以更好地覆蓋漏斗的底面。
[0014] 在一些實(shí)施方式中，在漏斗的兩側(cè)（相當(dāng)于在吸附核酸的膜的兩側(cè)）提供壓差。技 術(shù)人員理解，可以在漏斗的桶形容器（即斗）入口上施加正壓，也可以在漏斗的出口處施加 負(fù)壓，使得尿液樣本在壓力的推動下通過吸附核酸的膜和濾紙。適用于本公開方法的壓差 選自 3KPa、4KPa、5KPa、lOKPa、15KPa、20KPa、30KPa、40KPa、50KPa 或上述任意兩個(gè)數(shù)值之間 的范圍。例如，在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，是5KPa至50KPa。
[0015] 在一些實(shí)施方式中，尿液樣本通過吸附核酸的膜和濾紙的速度在0. 5至3滴/秒 范圍內(nèi)，例如1至2滴/秒。在具體的實(shí)施方式中，尿液樣本通過吸附核酸的膜和濾紙的速 度為1至1. 5滴/秒，以確保核酸與吸附核酸的膜的相互作用。
[0016] 在一些實(shí)施方式中，任何能夠吸附核酸的膜均可以用于實(shí)施本公開的方法。因此， 吸附核酸的膜選自PVDF膜、硝酸纖維膜和尼龍膜，優(yōu)選尼龍膜。吸附核酸的膜的孔徑為 0. 1 μ m、0. 22 μ m、0. 3 μ m、0. 45 μ m、0. 65 μ m、或上述任意兩個(gè)數(shù)值之間的范圍。在具體的實(shí) 施方式中，是〇. 45 μ m。在具體的實(shí)施方式中，吸附核酸的膜的數(shù)目為單層。
[0017] 在一些實(shí)施方式中，濾紙為定性濾紙。在具體的實(shí)施方式中，可用的定性濾紙為快 速型、中速型和慢速型定性濾紙。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，為102型中速定性濾紙。在一 些實(shí)施方式中，所述濾紙的數(shù)目選自3、4、5、6、7和8層。在具體的實(shí)施方式中，濾紙的數(shù)目 是4、5或6層。
[0018] 在具體的實(shí)施方式中，漏斗是布氏漏斗。
[0019] 在一些實(shí)施方式中，濾紙和吸附核酸的膜的尺寸（或面積）是相同的。技術(shù)人員 理解，此處所述的"相同"并非是完全相同，包含了相近的含義。濾紙和吸附核酸的膜的尺 寸根據(jù)所用漏斗的底面面積而變化，其面積足以覆蓋漏斗的底面，而又不是過大以至于難 以安置在漏斗中。
[0020] 在一些實(shí)施方式中，所述尿液樣本為新鮮尿液樣本。本文所述"新鮮尿液"是指離 開人體后5小時(shí)內(nèi)收集的尿液。一個(gè)具體的實(shí)施方式中，尿液樣本為離開人體后3小時(shí)內(nèi)， 更優(yōu)選1小時(shí)內(nèi)收集的尿液。
[0021] 因?yàn)?，尿液在收集后放置過久，容易導(dǎo)致核酸在尚未保存之前就被降解了。
[0022] -個(gè)具體的實(shí)施方式中，提供了一種保存尿液樣本中核酸的方法，其由如下步驟 組成：
[0023] a)提供1小時(shí)內(nèi)收集的新鮮尿液樣本；
[0024] b)尿液樣本于4°C 5000 X g離心30分鐘，取上清尿液樣本；
[0025] c)在5KPa壓差下，使50ml至100ml上清尿液樣本按照1至1. 5滴/秒的速度依 次通過水浸濕的單層尼龍膜和水浸濕的4至6層濾紙，其中尼龍膜和濾紙的直徑為47_，尼 龍膜孔徑為〇.45μπι ;
[0026] d)在56°C下烘箱中干燥5分鐘或者在室溫自然干燥尼龍膜；以及
[0027] e)將尼龍膜置于真空密封袋中于室溫、4°C、-20°C或-80°C保存。
[0028] 根據(jù)本公開的另一方面，提供了一種用于實(shí)施上述方法的裝置，其包含或由如下 組件組成：吸附核酸的膜、濾紙、漏斗、收集器以及壓差產(chǎn)生裝置。
[0029] 在一些實(shí)施方式中，吸附核酸的膜和濾紙放置于漏斗中。在一些實(shí)施方式中，吸附 核酸的膜和濾紙放置于漏斗桶形容器（即斗）的底面上。
[0030] 在一些實(shí)施方式中，吸附核酸的膜以最大接觸面積的方式接觸濾紙，同時(shí)濾紙也 以其最大接觸面積接觸漏斗底面；因此濾紙介于吸附核酸的膜和漏斗底面之間，使得吸附 核酸的膜不直接地接觸漏斗底面。
[0031] 在一些實(shí)施方式中，收集器用于收集流穿吸附核酸的膜和濾紙的尿液樣本；同時(shí) 在本公開的方法中，也可以通過在收集器中產(chǎn)生負(fù)壓，使得尿液樣本在壓力作用下流穿吸 附核酸的膜和濾紙。因此，在具體的實(shí)施方式中，收集器包含兩個(gè)口，兩個(gè)口分別與漏斗出 口和壓差產(chǎn)生裝置密閉連接。在一些實(shí)施方式中，密閉連接方式可以通過有孔膠塞的方式 進(jìn)行，或者通過軟管連接。
[0032] 在一些實(shí)施方式中，吸附核酸的膜的孔徑為0. ΙμπκΟ. 22μπι、0. 3μπι、0. 45μπκ 0. 65 μ m、或上述任意兩個(gè)數(shù)值之間的范圍。在具體的實(shí)施方式中，是0. 45 μ m。在具體的實(shí) 施方式中，吸附核酸的膜的數(shù)目為單層。
[0033] 在一些實(shí)施方式中，濾紙為定性濾紙。在具體的實(shí)施方式中，可用的定性濾紙為快 速型、中速型和慢速型定性濾紙。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，為102型中速定性濾紙。在一 些實(shí)施方式中，所述濾紙的數(shù)目選自3、4、5、6、7和8層。在具體的實(shí)施方式中，濾紙的數(shù)目 是4、5或6層。
[0034] 在一些實(shí)施方式中，濾紙和吸附核酸的膜的尺寸（或面積）是相同的。技術(shù)人員 理解，此處所述的"相同"并非是完全相同，包含了相近的含義。濾紙和吸附核酸的膜的尺 寸根據(jù)所用漏斗的底面面積而變化，其面積足以覆蓋漏斗的底面，而又不是過大以至于難 以安置在漏斗中。
[0035] 在一些實(shí)施方式中，漏斗為布氏漏斗。在一些實(shí)施方式中，壓差產(chǎn)生裝置為真空 泵。在一些實(shí)施方式中，收集器為抽濾瓶。
【附圖說明】
[0036] 圖1 :收集尿液核酸的裝置圖。
【具體實(shí)施方式】
[