與日本囊對(duì)蝦耐熱性相關(guān)的snp標(biāo)記及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖中的蝦類耐熱群體的檢測(cè)，尤其是涉及一種與日本囊對(duì)蝦耐 熱性相關(guān)的SNP標(biāo)記及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 日本囊對(duì)it!下(Marsupenaeus japonicus)的英文名為Kuruma shrimp，俗稱斑節(jié)!ti下、 竹節(jié)蝦、花尾蝦、藍(lán)尾蝦，是中國(guó)海水蝦類養(yǎng)殖的重要種類。日本囊對(duì)蝦屬亞熱帶種類，最適 溫度范圍為25~30°C，在8~10°C停止攝食，5°C以下死亡，高于32°C生活不正常。日本囊對(duì) 蝦的養(yǎng)殖受溫度影響明顯，超過一定的水溫臨界值，會(huì)造成較大面積死亡，在南方地區(qū)夏季 高溫養(yǎng)殖受限。近年來，為了提高日本囊對(duì)蝦的生長(zhǎng)速度和養(yǎng)殖效率，已有養(yǎng)殖戶嘗試在高 溫后期適當(dāng)提前放苗，但目前缺少耐高溫性狀的評(píng)價(jià)方法以及高溫養(yǎng)殖的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，提前 放苗的養(yǎng)殖結(jié)果很不穩(wěn)定。因此亟需深入了解日本囊對(duì)蝦的耐高溫性狀，為南方地區(qū)的高 溫季節(jié)養(yǎng)殖和耐高溫品系的選育積累生物學(xué)資料。
[0003] 國(guó)內(nèi)外關(guān)于蝦類的耐溫研究見于南極磷蝦、羅氏沼蝦、中國(guó)對(duì)蝦等，開展了溫度對(duì) 蝦類代謝率、臨界溫度、耗氧率等影響的研究。在日本囊對(duì)蝦方面，有學(xué)者報(bào)道了溫度對(duì)消 化酶活性、生長(zhǎng)和成活率(江敏，臧維玲.溫度對(duì)日本對(duì)蝦幼蝦生長(zhǎng)與耗氧的影響[J].漁業(yè) 現(xiàn)代化，2002(3) :14-16.)的影響以及成蝦和仔蝦(李潤(rùn)寅，陳介康，姜洪亮，等.日本對(duì)蝦仔 蝦的溫度適宜性實(shí)驗(yàn)研究[J].水產(chǎn)科學(xué)，2001，20(3): 17-18)對(duì)溫度適應(yīng)性的差異。單核苷 酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)即指基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變 異所引起的DNA序列多態(tài)性，作為第三代分子標(biāo)記，具有數(shù)量眾多、分布廣泛、遺傳穩(wěn)定性更 高、分型方法簡(jiǎn)易等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)在育種領(lǐng)域具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。在水產(chǎn)動(dòng)物中研究人 員篩選了一系列跟生長(zhǎng)、抗病、抗逆相關(guān)的SNP分子標(biāo)記。在日本囊對(duì)蝦耐熱方面的研究中， 很少有耐熱相關(guān)SNP篩選與檢測(cè)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種與日本囊對(duì)蝦耐熱性相關(guān)的SNP標(biāo)記及其檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明首先利用直接測(cè)序法提供一種與日本囊對(duì)蝦熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記，所 述與日本囊對(duì)蝦耐熱性相關(guān)的SNP標(biāo)記是核酸序列為SEQ ID NO. 1的HSP60基因的第3289位 點(diǎn)，其堿基為A或G。
[0006] 本發(fā)明還提供一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)檢測(cè)方法，對(duì)直接測(cè) 序法得到的MjHSP60基因 3289A/G進(jìn)行檢測(cè)，確定該位點(diǎn)與熱耐受性狀的相關(guān)性。
[0007] 用于PCR-RFLP檢測(cè)的引物，其上下游序列分別為：
[0008] HSP60NF5：CCGTGGCTACATCTCGC；
[0009] HSP60NR5:TCTTCAAGCGGTTCACTACA。
[0010] 與日本囊對(duì)蝦耐熱性相關(guān)的SNP標(biāo)記的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0011 ] 1)日本囊對(duì)蝦耐熱性實(shí)驗(yàn)步驟；
[0012] 2)熱耐受值(Upper thermal tolerance，UTT)的計(jì)算步驟；
[0013 ] 3)利用PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行基因分型步驟；
[0014] 4)不同基因型日本囊對(duì)蝦個(gè)體熱耐受性分析步驟。
[0015] 在步驟1)中，所述日本囊對(duì)蝦耐熱性實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0016] 將日本囊對(duì)蝦在33°C水體中暫養(yǎng)Id后，以l°C/2h的速率升溫直至所有對(duì)蝦死亡， 找出38°C為死亡率較高拐點(diǎn)；以33°C為初始溫度，選取經(jīng)Id暫養(yǎng)正常的個(gè)體放入實(shí)驗(yàn)池，以 l°C/2h的速率升溫至38°C;38°C之后以0.5°C/4h的速率升溫直至所有日本囊對(duì)蝦死亡;實(shí) 驗(yàn)中保持充氣，以確保水池中各個(gè)部位溫度同步;對(duì)蝦死亡標(biāo)準(zhǔn)為對(duì)蝦背部朝下倒于水體 無法恢復(fù)正常的姿勢(shì)或軀體始終保持90°彎曲；記錄死亡時(shí)間、死亡溫度、體重，然后裝入封 口袋中，以供實(shí)驗(yàn)結(jié)束后保存樣品，保證每l〇min撈取一次死蝦并做好記錄，當(dāng)池子中對(duì)蝦 死亡總數(shù)達(dá)到100 %時(shí)結(jié)束耐熱實(shí)驗(yàn)。
[0017] 在步驟2)中，所述熱耐受值(Upper thermal tolerance,UTT)的計(jì)算按以下公式： [0018] ?-Ι
[0019]式中，i為分鐘數(shù)，Ti為在第i分鐘的溫度，To為實(shí)驗(yàn)初始溫度33°C，k為個(gè)體存活的 分鐘數(shù)。
[0020]在步驟3)中，所述利用PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行基因分型的具體方法可為：
[0021] a)隨機(jī)選取40~80尾體重在2.3~3.3g之間的已獲得熱耐受性狀評(píng)定指標(biāo)UTT值 的日本囊對(duì)蝦，取每尾蝦的背部肌肉，置于無水乙醇中，-20°C保存，用于基因組DNA的提取。 提取基因組DNA后，利用特異性引物HSP60F5和HSP60R5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi) 切酶Bstn酶切，根據(jù)酶切后電泳條帶確定不同的基因型。酶切體系如下：
[0022]
[0023] 反應(yīng)條件:37°C水浴，15min;
[0024] b)利用PCR-RFLP方法對(duì)SNP標(biāo)記3289A/G進(jìn)行分型，經(jīng)BstXI酶切后，3289A型等位 基因產(chǎn)生長(zhǎng)度分別為333bp和68bp的兩種片段，而3289G由于不能為酶所識(shí)別，基因片 段長(zhǎng)度仍為401bp;酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%電泳檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)存在2種基因型：3289AA基因型和 3289AG基因型。
[0025] 在步驟4)中，所述不同基因型日本囊對(duì)蝦個(gè)體熱耐受性分析的具體方法為：
[0026]對(duì)具不同基因型的日本囊對(duì)蝦個(gè)體(2.3~3.3g)進(jìn)行熱耐受性方差分析對(duì)比。 [0027] 本發(fā)明利用直接測(cè)序法、PCR-RFLP法給出MjHSP60基因多態(tài)性，并對(duì)SNP多態(tài)性與 日本囊對(duì)蝦熱耐受性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為篩選耐高溫的SNP分子標(biāo)記，開展日本囊對(duì)蝦耐熱品 系的分子育種提供理論參考。
【附圖說明】
[0028]圖1為日本囊對(duì)蝦及擬穴青蟹HSP60基因組織結(jié)構(gòu)圖對(duì)比。在圖1中，方框代表外顯 子，直線代表內(nèi)含子。
[0029]圖2為位點(diǎn)3289A/G不同基因型電泳結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 本發(fā)明根據(jù)日本囊對(duì)蝦MjHSP60mRNA(GenBank登錄號(hào)：JQ972715.1)和擬穴青蟹 (3〇711&口&瓜111&1]1〇8&;[11)批?60基因全序列(66111^111<:登錄號(hào):幾 262230.1)，在相鄰?fù)怙@子兩 端設(shè)計(jì)引物，最后利用交叉引物驗(yàn)證是否有未擴(kuò)出的內(nèi)含子。通過對(duì)所有擴(kuò)增片段的重疊 比對(duì)和拼接獲得MjHSP60基因。該基因 DNA全長(zhǎng)4637bp，共含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，其中 0RF長(zhǎng)度為1740bp，編碼579個(gè)氨基酸。
[0031]本發(fā)明根據(jù)M jHSP60基因 SNP多態(tài)性與日本囊對(duì)蝦熱耐受性的相關(guān)性，初步篩選出 第3289位點(diǎn)，其堿基為A或G。并利用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)其驗(yàn)證，其結(jié)果可為日本囊對(duì)蝦耐熱遺 傳育種奠定基礎(chǔ)。
[0032]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0033] 實(shí)施例1:日本囊對(duì)蝦HSP60基因 cDNA和DNA序列克隆，包括以下步驟：
[0034] 1)日本囊對(duì)蝦肌肉DNA的提取；
[0035] 2)HSP60基因內(nèi)含子的擴(kuò)增；
[0036] 3)獲得MjHSP60目的基因全長(zhǎng)序列。
[0037]在步驟1)中，所述日本囊對(duì)蝦肌肉DNA的提取的具體方法可為:用酚/氯仿抽提，再 瓊脂糖TBE凝膠電泳檢測(cè)DNA。
[0038]在步驟2)中，所述HSP60基因內(nèi)含子的擴(kuò)增的具體方法可為：
[0039] a)引物設(shè)計(jì)
[0040] 根據(jù)日本囊對(duì)蝦MjHSP60mRNA(GenBank登錄號(hào)：JQ972715.1)和擬穴青蟹（Scylla paramamosain)HSP60基因全序列(GenBank登錄號(hào):JX262230.1)，在相鄰?fù)怙@子兩端設(shè)計(jì)引 物，最后利用交叉引物驗(yàn)證是否有未擴(kuò)出的內(nèi)含子。MjHSP60內(nèi)含子擴(kuò)增所用引物序列如表 1所示。
[0041]表1
[0042]
[0043] b)PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：
[0044]
[0045] c)PCR擴(kuò)增程序：①95°C5min;②30個(gè)循環(huán)：94°C30sec，退火溫度30sec，72°C 30sec;③72°C10min;④4°CPause。注:PCR擴(kuò)增根據(jù)不同的引物分別設(shè)置相應(yīng)的退火溫度。 取5yL PCR加樣于1.5%瓊脂糖凝膠，在0.5 X TBE的緩沖體系中以160V電壓進(jìn)行電泳，30min 后，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照，查看目的條帶。
[0046] d)PCR產(chǎn)物的回收和純化、感受態(tài)細(xì)胞的制備、目的片段與pMD 19-T Vector連接、 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化；
[0047] e)重組子的PCR鑒定與序列測(cè)定
[0048]每個(gè)目的片段的克隆平板隨機(jī)挑取8個(gè)菌落，分別置于含有Amp(100yg/mL)的700μ L LB液體培養(yǎng)基中，37°C、180rpm振蕩培養(yǎng)4h，以每管菌液作為模板，采用pMD19-T通用引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。反應(yīng)體系如下：
[0049]
[0050] f)PCR擴(kuò)增程序：①95。C5min;②30個(gè)循環(huán)：94。C30sec，55。C30sec，72。Clmin ;③72 °C10min;④4°CPauSe<3PCR檢測(cè)陽性菌液送交華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，通過對(duì)所有擴(kuò)增片段 和引物序列的重疊比對(duì)和拼接獲得MjHSP60基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列。
[0051] 在步驟3)中，所述獲得MjHSP60目的基因全長(zhǎng)序列的具體方法可為：
[0052]通過對(duì)所有擴(kuò)增片段的重疊比對(duì)、拼接獲得MjHSP60基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列（參見圖 1)。該基因共含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，其基因組織結(jié)構(gòu)圖與擬穴青蟹較為一致，從圖1中 可以看出，二者的外顯子分布和大小幾乎一致，對(duì)兩者外顯子進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)相似度達(dá) 94%，而內(nèi)含子差異較大。
[0053]實(shí)施例2:日本囊對(duì)蝦HSP60基因中與耐熱性相關(guān)SNP標(biāo)記的篩選，包括步驟如下：
[0054] 1)實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦
[0055] 基因組DNA的提?。ㄍ希?br>[0056] 2)不同群體日本囊對(duì)奸M jHSP60基因 SNP檢測(cè)
[0057] a)利用直接測(cè)序法進(jìn)行SNP的篩選