系列甲基化兒茶素單體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種利用吸附柱層析法W及Akta半制備高效液相色譜儀，純化茶葉 中的甲基化兒茶素成分，制備系列甲基化兒茶素單體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 很久W來，茶葉一直受到人們的喜愛。除了臉炙人口的的色、香、味之外，目前流行 病學(xué)與預(yù)防醫(yī)學(xué)研究表明喝茶可W降低患腫瘤和屯、腦血管等疾病的風(fēng)險(xiǎn)。茶還具有抗氧 化、抗炎癥、抗過敏和抗肥胖的生理功效。研究發(fā)現(xiàn)茶的風(fēng)味與保健功能正是茶葉所特有的 茶多酪等具有生物活性的成分所賦予的。
[0003] 茶多酪是兒茶素(黃燒醇類）、花色素類(花青素和花白素）、花黃素類(黃酬與黃酬 類)等集于茶葉中的一群多酪復(fù)合物的總稱。其中兒茶素占60-80%，分為醋型兒茶素和游 離型兒茶素，醋型兒茶素占兒茶素的70%左右。酪類物質(zhì)早就被報(bào)道具有多種生理活性，尤 其是表沒食子兒茶素沒食子酸醋化GCG)。近幾年研究發(fā)現(xiàn)一些特定的烏龍茶中含有另一種 兒茶素，即兒茶素的甲基化衍生物，W(-)-表沒食子兒茶素3-0(3-0-甲基）沒食子酸醋 化GCG3"Me)和(-)-表沒食子兒茶素3-0(4-0-甲基)沒食子酸醋化GCG4"Me)為主。目前關(guān)于 甲基化兒茶素生理功能的研究主要集中在對甲基化EGCG的抗過敏作用的研究方面，尤其是 對最常見的花粉過敏癥具有顯著的預(yù)防和抑制作用。在日本，部分富含甲基化EGCG的產(chǎn)品 已經(jīng)進(jìn)入商業(yè)發(fā)展階段，在食品行業(yè)，餅干、口香糖、茶飲料等添加甲基化EGCG給食品行業(yè) 注入了新的賣點(diǎn)，得到了更多消費(fèi)者的青睞。因此，甲基化兒茶素的研究至關(guān)重要，在學(xué)術(shù)、 生物學(xué)方面都具有非常重要的意義。
[0004] 目前，研究報(bào)道的甲基化兒茶素的體外合成主要有化學(xué)法和生物酶法。但是，化學(xué) 合成法中需要使用大量有機(jī)溶劑和各種基團(tuán)保護(hù)劑，合成反應(yīng)條件較為苛刻，專一性差，畐U 產(chǎn)物多，因此，化學(xué)合成不宜作為甲基化兒茶素的體外合成方法。體外酶法合成雖然專一性 強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、安全性高，但目前甲基化兒茶素的體外轉(zhuǎn)化研究均沒有對合成反應(yīng)物進(jìn) 行分離純化與結(jié)構(gòu)解析，沒有實(shí)現(xiàn)酶法合成產(chǎn)物的大量制備。
[0005] 從茶葉中直接提取甲基化兒茶素，由于其來源于天然產(chǎn)物，有著較好的安全性。從 食品工業(yè)角度看，必須考慮原料充足、方便、易得、無毒性、生產(chǎn)成本低等問題，因此，合理的 方法是從茶葉中直接提取甲基化兒茶素。一些中國產(chǎn)烏龍茶中甲基化兒茶素含量較高，結(jié) 合吸附柱層析法W及AKTA半制備高效液相色譜儀，可W制備系列甲基化兒茶素單體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的要解決的技術(shù)問題是W中國產(chǎn)烏龍茶作為原料，制備系列甲基化兒茶素 單體的方法，能夠保證提取的產(chǎn)品純度高、成本低、效率高、環(huán)境友好，且易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生 產(chǎn)。為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種從烏龍茶中制備系列甲基化兒茶素單體的方法，包 括如下工藝步驟：
[0007] 1)茶葉經(jīng)熱水提取，干燥得到粗提取物；
[0008] 2)采用特定的大孔樹脂A處理粗提取物，先用水充分洗脫，去除色素和咖啡堿；
[0009] 3)接著用80%濃度的乙醇溶液洗脫大孔樹脂A，收集洗脫液，經(jīng)濃縮和干燥，得到 甲基化兒茶素含量> 20 %的組分1;
[0010] 4)采用Toyopearl HW-40S樹脂處理組分1，用80%濃度的乙醇溶液洗脫，收集不同 時(shí)間的洗脫液，經(jīng)濃縮和干燥，分別得到純度大于95 %的EGCG3"Me和ECG3 ' Me;
[0011] 5)純化后的EGCG3"Me和ECG3"Me經(jīng)過高溫高壓處理后，分別部分異構(gòu)化為對應(yīng)的 差向異構(gòu)體GCG3" Me和CG3" Me;
[0012] 6)處理后的樣品溶液，經(jīng)過ΑΚΤΑ半制備高效液相色譜儀進(jìn)行分離純化，經(jīng)濃縮 和干燥，分別得到66〔6滬]^、6〔6滬]^、6〔6滬]^和〔6滬]^的單體物質(zhì)。
[0013] 本發(fā)明所述工藝提取的甲基化兒茶素單體產(chǎn)品純度均達(dá)到99% W上，大孔吸附樹 脂的再生性能好，可W再生重復(fù)使用，洗脫劑乙醇無毒無害，也可W回收多次利用。本工藝 成本低、效率高、環(huán)境友好，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0014] 圖1為EGCG3"Me的核磁共振氨譜圖 [001引圖2為ECG3"Me的核磁共振氨譜圖
[0016] 圖 3 為EGCG3" Me、ECG3" Me、GCG3" Me 和 CG3" Me 的 HPLC 圖譜
【具體實(shí)施方式】
[0017] 1)粗提取物:茶葉經(jīng)磨碎后，用熱水浴浸提40min，液料比20:1，水浴溫度為95°C， 浸提之后在40-50°C下進(jìn)行減壓濃縮；
[0018] 2)大孔樹脂A處理:選取大孔樹脂A，用抑2.0-3.0的緩沖液平衡，上樣液也調(diào)整成 與緩沖液同樣的pH，兒茶素濃度為5mg/mL，上樣流速為每小時(shí)1-2個(gè)柱床體積；
[0019] 3)乙醇溶液洗脫:先用水沖大孔樹脂，至流出液無色為止，再換上80%濃度的乙醇 溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為每小時(shí)1 -2個(gè)柱床體積，收集洗脫液，在40-50°C下減壓濃縮，得 到甲基化兒茶素含量> 20 %的組分1;
[0020] 4)Toyopearl冊-40S樹脂處理:選取的Toyopearl冊-40S樹脂上樣組分1之后，用 80%的乙醇溶液洗脫樹脂，流速為每小時(shí)1-2個(gè)柱床體積，收集不同時(shí)間的洗脫液，在40-50 。(:下減壓濃縮，分別得到純度大于95 %的EGCG3"Me和ECG3"Me。
[0021] 5)高溫高壓處理:得到的純度大于95%的EGCG3"Me和ECG3"Me，溶解于適量去離子 水，在高溫（123°C ) W及高壓(0.09-0.1 IMpa)條件下加熱7分鐘，使其部分異構(gòu)化為對應(yīng)的 差向異構(gòu)體GCG3" Me和CG3" Me。
[0022] 6) AKTA半制備高效液相色譜儀進(jìn)行分離純化:得到的EGCG3" Me、ECG3" Me W及對 應(yīng)的差向異構(gòu)體GCG3"Me和CG3"Me，濃縮后上樣至ΑΚΤΑ半制備高效液相色譜儀，用40%的甲 醇溶液洗脫色譜柱，流速為2mL/min。收集不同時(shí)間的洗脫液，分別得到EGCG3" Me、ECG3" Me、 GCG3"Me和CG3"Me的單體物質(zhì)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從烏龍茶中制備系列甲基化兒茶素單體的方法，包括如下步驟： 1) 茶葉經(jīng)熱水提取，干燥得到粗提取物； 2) 采用特定的大孔樹脂A處理粗提取物，先用水充分洗脫，去除色素和咖啡堿； 3) 接著用80 %濃度的乙醇溶液洗脫大孔樹脂A，收集洗脫液，經(jīng)濃縮和干燥，得到甲基 化兒茶素含量>20%的組分1; 4) 采用Toyopearl HW-40S樹脂處理組分1，用80%濃度的乙醇溶液洗脫，收集不同時(shí)間 的洗脫液，經(jīng)濃縮和干燥，分別得到純度大于95 %的EGCG3" Me和ECG3" Me; 5) 純化后的EGCG3"Me和ECG3"Me經(jīng)過高溫高壓處理后，分別部分異構(gòu)化為對應(yīng)的差向 異構(gòu)體 GCG3" Me 和 CG3" Me; 6) 處理后的樣品溶液，經(jīng)過Akta半制備高效液相色譜儀進(jìn)行分離純化，經(jīng)濃縮和干 燥，分別得到66〔6滬]?6、6〔6滬]\16、6〔6滬]\16和〔6滬]\16的單體物質(zhì)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從烏龍茶中制備系列甲基化兒茶素單體的方法，其特征 在于步驟1)中茶葉經(jīng)磨碎后，用熱水浴浸提40min，液料比20:1，水浴溫度為95°C，浸提之后 在40-50°C下進(jìn)行減壓濃縮。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從烏龍茶中制備系列甲基化兒茶素單體的方法，其特征 在于步驟2)中選取對兒茶素存在選擇性吸附的大孔樹脂A，用抑2.0-3.0的緩沖液平衡，上 樣液也調(diào)整成與緩沖液同樣的pH，兒茶素濃度為5mg/mL，上樣流速為每小時(shí)1-2個(gè)柱床體 積。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從一種從烏龍茶中制備系列甲基化兒茶素單體的方法，其特 征在于步驟3)先用水沖大孔樹脂，至流出液無色為止，再換上80%濃度的乙醇溶液進(jìn)行洗 脫，洗脫流速為每小時(shí)1-2個(gè)柱床體積，收集洗脫液，在40-50°C下減壓濃縮，得到甲基化兒 茶素含量>20%的組分1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從烏龍茶中制備系列甲基化兒茶素單體的方法，其特征 在于步驟4)中選取的Toyopearl HW-40S樹脂上樣組分1之后，用80%的乙醇溶液洗脫樹脂， 流速為每小時(shí)1 -2個(gè)柱床體積，收集不同時(shí)間的洗脫液，在40-50°C下減壓濃縮，分別得到純 度大于 95 % 的 EGCG3" Me 和 ECG3" Me。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從烏龍茶中制備系列甲基化兒茶素單體的方法，其特征 在于步驟5)中得到的純度大于95 %的EGCG3"Me和ECG3"Me，溶解于適量去離子水，在高溫 (123°C) W及高壓(0.09-0.1 lMpa)條件下加熱7分鐘，使其部分異構(gòu)化為對應(yīng)的差向異構(gòu)體 0〔6滬]?6和〔6滬]\16。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從烏龍茶中制備系列甲基化兒茶素單體的方法，其特征 在于步驟6)中得到的66〔63"]?6、6〔63"]\16^及對應(yīng)的差向異構(gòu)體0〔63"]\16和〔63"16，濃縮后 上樣至Akta半制備高效液相色譜儀，用40%的甲醇溶液洗脫色譜柱，流速為2mL/min，收 集不同時(shí)間的洗脫液，在40-50 °C下減壓濃縮，分別得到EGCG3" Me、ECG3" Me、GCG3"Me和CG3" Me的單體物質(zhì)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從烏龍茶中制備系列甲基化兒茶素單體的方法。包括如下步驟：以一種中國產(chǎn)烏龍茶為原料，經(jīng)熱水提取，干燥得到粗提取物。粗提取物經(jīng)過大孔樹脂A處理之后，得到甲基化兒茶素含量＞20％的組分1。組分1經(jīng)過Toyopearl？HW-40S樹脂處理之后，分別得到純度大于95％的EGCG3”Me和ECG3”Me；純化后的EGCG3”Me和ECG3”Me經(jīng)過高溫高壓處理后，分別部分異構(gòu)化為對應(yīng)的差向異構(gòu)體GCG3”Me和CG3”Me。處理后的樣品溶液，經(jīng)過半制備高效液相色譜儀進(jìn)行分離純化，分別得到EGCG3”Me、ECG3”Me、GCG3”Me和CG3”Me的單體物質(zhì)。作為一種成本低、效率高、環(huán)境友好的制備工藝，本發(fā)明易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C07D311/62
【公開號】CN105585550
【申請?zhí)枴緾N201610064213
【發(fā)明人】曾曉雄, 張鑫
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2016年1月28日