r>[0182] 雙重巧光定量PCR檢測方法的結(jié)果判定
[0183] 根據(jù)Ct值大小及擴增曲線的情況判定待檢樣品是否為陽性。當(dāng)Ct值。5.0且出現(xiàn) 典型的擴增曲線時，判定為陽性;若無 ct值且無典型的擴增曲線，則判定為陰性；當(dāng)ct值〉 35.0且出現(xiàn)典型擴增曲線時建議重復(fù)試驗，重復(fù)試驗結(jié)果Ct值含35.0且有典型擴增曲線者 判為陽性，否則為陰性。
[0184] 本發(fā)明建立的雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗型特異性的雙重巧光定量RT-PCR方 法，方法簡便快速、特異性強且靈敏度高，是公認的病原體快速檢測金標(biāo)準(zhǔn)。適用于所有的 雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗型特異性的鑒別。
[01化]實施例2:
[0186] 1.滅活出血熱病毒的電鏡觀察
[0187] 利用負染法將滅活純化的出血熱病毒液制備成電鏡標(biāo)本并在透射電子顯微鏡下 觀察。過程如下：將滅活出血熱病毒懸液滴加到銅網(wǎng)上，室溫吸附數(shù)分鐘，用濾紙吸干多余 的液體，2%醋酸軸負染1~2111；[]1后置于護7650型透射電子顯微鏡下觀察。
[018引 2.引物和探針的設(shè)計
[0189]漢坦病毒基因是分節(jié)段的單負鏈RNA，基因組分節(jié)段的特點使得病毒很容易發(fā)生 變異。因此，選擇合適的擴增區(qū)域十分重要，即所選擇的區(qū)域不僅要保守而且還應(yīng)具備較 好的型特異性。核蛋白是病毒進化過程中相對保守的蛋白質(zhì)，其編碼基因也相對保守，且研 究發(fā)現(xiàn)病毒核蛋白中存在許多型特異性的抗原位點，因此本實驗選擇核蛋白編碼基因所在 的S片段作為設(shè)計型特異性引物和探針的祀序列。根據(jù)GenBank中已公布的中國HFRS疫苗株 及其他國內(nèi)流行株S片段基因序列，利用DNAMAN軟件進行同源性比對分析，選出一段型內(nèi)相 對保守且型間相對差異的區(qū)域作為擴增的祀?yún)^(qū)域。然后根據(jù)巧光定量PCR引物和探針的設(shè) 計原則，利用Primer P;rimie;r5.0和PrimerE邱ress3.0軟件在祀序列的保守區(qū)設(shè)計各型特 異性的引物和探針，并利用化AST進行在線比對分析，最終確定為出血熱I型和Π 型特異的 引物和探針。
[0190] I型參考的毒株主要有ZIO株，84FLi株，LRl株及A16株等；Π 型參考的毒株主要有 Ζ37株，L99株及R22株等。
[0191] 共設(shè)計了4對引物和2條巧光探針，I型和Π 型各兩對引物和一條探針。序列如下：
[0192] I型引物及探針序列：
[0193] HTNF1:5 '-CAGAGGGAAATCAATGCC-3 '
[0194] HTNR1:5'-CTCATCTGGATCCTTTTCA-3 '
[01 巧]HTNF2:5 '-TATGGAGGAACTACAGAGG-3 '
[0196] HTNR2:5'-TCTGGATCCTTTTCATATTG-3 '
[0197] ΗΤΝΡ:5 '-FAM-TCTGCATCTCTCACCT-MGB-3 '
[0198] Π 型引物及探針序列：
[0199] 沈0F1:5 '-ATAGCACGCCAGAAAGTC-3 '
[0200] 沈0R1:5 '-ATCCTGTCGGCAAGTTGG-3 '
[0201] 沈0F2:5 '-AAGTCAAGGATGCAGAAAAG-3 '
[0202] 沈0R2:5 '-ATTGTATTGAAGCTGCGACA-3 '
[0203] SE0P:5，-HEX-CTTAAACAAGAGGACAC-MGB-3，
[0204] 3.滅活出血熱病毒RNA的提取
[0205] 3.1 TRIzol法
[0206] (1)取0.25ml滅活出血熱病毒液于1.5ml微量離屯、管中，加入0.75ml TRIzol LS試 劑，用移液槍吸打混勻，室溫靜置5min。
[0207] (2)按每0.75ml的TRIzol LS試劑加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋，劇烈震蕩15s后，室溫 靜置2~15miru4°C，12 OOOg離屯、15min。
[0208] (3)將離屯、管傾斜45%用移液槍小屯、吸取上層水相并轉(zhuǎn)移至一個新的1.5ml微量 離屯、管中，盡量避免吸到中間層或下層有機相。
[0209] (4)按每0.75ml的TRIzol LS試劑加入0.5ml異丙醇，室溫靜置 10miru4°C，12 OOOg 離屯、15min。
[0210] (5)用移液槍小屯、吸去上清，保留沉淀。按每0.75ml的TRIzol LS試劑加入1ml 75 %的乙醇。滿旋混勻。4°C，7 500g離屯、5min。
[0211] (6)棄盡上清。真空或空氣干燥沉淀5~lOmin。加入20μ1的無 RNase水輕輕吸打溶 解沉淀。
[0別^ (7)在55~60C水浴中解育10~15min?，F(xiàn)憶0D值確定RNA濃度，一70C保存。
[0213] 4.陽性對照品的制備
[0214] 4.1目的片段的克隆
[0215] 4.1.1逆轉(zhuǎn)錄體系
[0216]
[0217] 反應(yīng)條件:室溫靜置10min，42°C保溫化后冰浴2min。
[021引4.1.2 PCR擴增體系及條件
[0219]
[0220] 反應(yīng)條件：
[0221] 預(yù)變性94°C 5min 變性94°C 80s 退火52°C 80s 延伸72°C 80s 72°C 10min32個 循環(huán)。
[0222] 4.1.3 PCR產(chǎn)物的回收
[0223] PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的片 段，具體過程見試劑盒說明書。
[0224] 4.1.4重組質(zhì)粒 PMD18-T/HTN 和 PMD18-T/SE0 的構(gòu)建
[0225] (1)取 1〇μ1 Solution I和化 1 PMD18-T載體混勻，瞬離。
[02%] (2)將上述混合物分裝成兩管，每管化1。標(biāo)號1和2。
[0227] (3)在1號和2號管中分別加入I型和Π 型膠回收產(chǎn)物各化1。
[022引（4)16°C水浴連接過夜。
[0229] 4.1.5 D冊α感受態(tài)細胞的制備
[0230] (1)將大腸桿菌D冊α保存菌液涂布于無抗性的LB固體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。
[0231] (2)挑取單菌落接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C，160巧m搖床振蕩培養(yǎng)過夜。
[0232] (3)取0.5ml菌液對接到100ml LB液體培養(yǎng)基中。37°C，leOrpm搖床振蕩培養(yǎng)約化， 至菌液OD值為0.5左右。
[0233] (4)將菌液分裝到50ml滅菌離屯、管中，冰浴10miru4°C，2 500rpm離屯、lOmin，棄去 上清。
[0234] (5)加入預(yù)冷的CaC12溶液10ml。冰上小屯、懸浮細胞。4°C，2 000巧m離屯、7min。
[0235] (6)重復(fù)步驟(5)-次。此步加完化C12溶液后需先冰浴30min再離屯、，棄取上清。
[0236] (7)加入預(yù)冷的化C12溶液2ml。小屯、懸浮細胞。分裝，一 70°C保存。
[0237] 4.1.6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞
[0238] 從一70°C冰箱中取出D冊α感受態(tài)細胞冰浴融化。加入扣1重組質(zhì)粒。冰浴30minc42 。(:熱擊1.5min。加入40化1 LB液體培養(yǎng)基，37°C，100巧m振蕩培養(yǎng)約化。然后涂布于含有氨 節(jié)抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37Γ倒置培養(yǎng)過夜。
[0239] 4.1.7重組質(zhì)粒的大量制備
[0240] 從過夜培養(yǎng)的平皿上挑取單個菌落并接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中。37°C，180巧m 振蕩培養(yǎng)約化。待重組菌生長至對數(shù)期后，利用化KaRa Mini邸ST Plasmid化rification Kit按照操作說明提取質(zhì)粒，并于一20°C保存。
[0241] 4.2目的片段的鑒定
[0242] 4.2.1 PCR 法鑒定
[0243] 分別W重組質(zhì)粒PMD18-T/HTN和PMD18-T/SE0為模板，擴增體系如下：
[0244]
[0245] 反應(yīng)條件同前。
[0246] 4.2.2酶切消化法鑒定
[0247] 選擇EcoR I、Hind III兩個酶切位點進行消化。其中，EcoR I酶切位點位于載體 456bp處，I型和Π 型重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I酶切后產(chǎn)生的片段分別為2 785bp和2 8"bpeHind III酶切位點位于載體399bp處，I型和Π 型重組質(zhì)粒經(jīng)化nd III和EcoR I雙酶切后各產(chǎn)生 兩條片段，I型重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)生的片段長度分別為15化P和2 63化ρ，Π 型重組質(zhì)粒酶切產(chǎn) 生的片段長度分別為20化Ρ和2 63化Ρ。酶切反應(yīng)體系如下：
[0248] (1化coR I單酶切反應(yīng)體系，反應(yīng)體系（2化1)如下：
[0249]
[0250] 混勻上述液體，37Γ水浴化。
[0巧1] (2化ind III和EcoR I雙酶切反應(yīng)體系，反應(yīng)體系（2化1)如下：
[0 巧 2]
[0253] 混勻上述液體，37°C水浴化。
[0巧4] 4.2.3測序鑒定
[0255] 將提取的質(zhì)粒送至吉林省庫美生物科技有限公司進行測序。并使用BLAST將測序 結(jié)果與PS-6株和L99株的基因序列進行比對分析。
[0256] 5.雙重巧光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的確立
[0257] 反應(yīng)總體積為20μ1，具體如下：
[ο巧引
[0259] 反應(yīng)條件如下：
[0260] 預(yù)變性94°C 2min 變性94°C 15s 退火60°Clmin 40個循環(huán) [Ο%1 ] 6.雙重巧光定量PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化
[0%2] 6.1引物和探針組合的選擇
[0263] 本實驗對I型和Π 型分別設(shè)計了2對引物及1條巧光探針，按照表中的組合來進行 巧光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)每組反應(yīng)的Ct值、巧光增幅W及擴增曲線形狀等結(jié)果來篩選出最佳 引物和探針組合。
[0264] 巧光定量PCR引物和探針組合設(shè)計
[02 化]
[0%6]
[0267] 6.2引物濃度的優(yōu)化
[026引巧光定量PCR反應(yīng)的引物濃度一般在Ο.ΙμΜ~ΙμΜ之間優(yōu)化。本實驗的引物濃度分 別設(shè)計為0.2μΜ，0.4μΜ，0.6μΜ和0.祉Μ，按表設(shè)立的組合進行巧光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)每組反 應(yīng)的Ct值、巧光增幅W及擴增曲線形狀等結(jié)果來確定最佳引物濃度。
[0269] 巧光定量PCR引物濃度優(yōu)化實驗設(shè)計表
[0270]
[0271] 6.3探針濃度的優(yōu)化
[0272] 巧光定量PCR反應(yīng)的探針最佳濃度一般在0.化Μ~0.扣Μ之間優(yōu)化。本實驗的探針 濃度分別設(shè)計為0.2μΜ，0.3μΜ，0.4μΜ，按表設(shè)立的組合進行巧光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)每組反 應(yīng)的Ct值、巧光增幅W及擴增曲線形狀等結(jié)果來確定最佳探針濃度。
[0273] 巧光定量PCR探針濃度優(yōu)化實驗設(shè)計表
[0274]
[02巧]6.4 Mg化濃度的優(yōu)化
[0276] Mg2+濃度大小對酶的催化活性影響很大，因此需要對Mg2+濃度進行優(yōu)化。本實驗 將Mg2+終濃度分別設(shè)定為W下6個濃度，見表。進行巧光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)每組反應(yīng)的Ct 值、巧光增幅w及擴增曲線形狀等結(jié)果來確定最佳^te化濃度。
[0277]巧光定量PCR反應(yīng)Mgh濃度優(yōu)化設(shè)計表 [027引
[0