一種高含量西索霉素發(fā)酵液的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明公開了一種高含量西索霉素發(fā)酵液的制備方法，屬于藥物合成領域。
【背景技術】
[0002]氨基糖苷類抗生素是繼青霉素之后發(fā)現(xiàn)較早的一類抗生素。西索米星(sisomicin，簡稱SIS0)是小單孢菌生物合成的一種氨基糖苷類抗生素，不但能直接用于生產(chǎn)西索米星針劑，而且是半合成抗生素奈替米星(Netilmicin)的原料。西索米星和奈替米星均列入中國國家基本藥物名錄，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌和陰性菌有很強的抗菌作用。
[0003]現(xiàn)有生產(chǎn)西索霉素發(fā)酵液的方法是以玉米淀粉、黃豆餅粉等為原材料，在微生物伊尼奧小單孢放線菌的作用下，多采用三級發(fā)酵，在發(fā)酵過程中進行適時補料生產(chǎn)西索霉素發(fā)酵液，利用薄層層析生物顯影測定西索霉素效價，西索霉素的生物效價一般在700?1200ug/mL，西索霉素主組份在70?80%，提取純化收率只能達到50?60%。
[0004]現(xiàn)有生產(chǎn)西索霉素發(fā)酵液的方法，其不足之處在于:西索霉素生產(chǎn)過程中發(fā)酵液生物效價較低，高低懸殊較大，生產(chǎn)不穩(wěn)定，西索霉素的主組份不高，提取純化收率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明主要解決的技術問題:針對目前西索霉素發(fā)酵液生物效價較低，高低懸殊較大，生產(chǎn)不穩(wěn)定，西索霉素的主組份不高，提取純化收率低的問題，本發(fā)明首先通過伊尼奧小單孢菌進行活化，再將活化后的菌種在甲磺酸乙酯及微波狀態(tài)下誘導變異，再將變異菌種放入發(fā)酵罐中，在氯化鈷溶液催進西索霉素的產(chǎn)生，同時在針對菌液的引發(fā)下，產(chǎn)生西索霉素，再通過過濾分離，從而制備得高含量西索霉素發(fā)酵液，純化收率高。
[0006]為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是:
(1)按重量百份比計，取30?35份蔗糖、22?25份瓊脂、13?15份質(zhì)量分數(shù)為10%的硝酸鉀溶液、10?12份質(zhì)量分數(shù)為12%的氯化鈉溶液及18?20份葡萄糖，攪拌均勻后使用質(zhì)量分數(shù)為5 %的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，在120?130°C下，消毒殺菌30?40min，得斜面培養(yǎng)基；
(2)使用接種環(huán)將伊尼奧小單孢菌接種至上述斜面培養(yǎng)基，接種I?3次，將接種后的斜面培養(yǎng)基置于32?35°C，無菌環(huán)境下，培養(yǎng)7?9天后，將培養(yǎng)基移至O?4°C的冰箱中儲存4?6天，得斜面培養(yǎng)后的菌種，備用；
(3)按重量份數(shù)計，取35?42份淀粉、15?18粉豆腐渣、30?32份牛肉膏、3?4份L-脯氨酸、8?10份質(zhì)量分數(shù)為10%的硫酸鎂溶液、0.6?1.2份磷酸氫二鉀及0.4?0.8份磷酸二氫鉀，攪拌均勻后使用質(zhì)量分數(shù)為5%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，在110?120°C下，消毒殺菌30?40min，得種子培養(yǎng)基；
(4)按照種子培養(yǎng)基體積8?12%的接種量，將步驟(2)中備用的斜面培養(yǎng)后的菌種接種至種子培養(yǎng)基上，隨后將種子培養(yǎng)基移至搖床培養(yǎng)箱中，在30?35°C，190?220r/min下，培養(yǎng)50?60h，在培養(yǎng)過程中，每8?1h向其中加入種子培養(yǎng)基體積0.8?1.4 %的甲磺酸乙酷；
(5)待上述培養(yǎng)結束后將種子培養(yǎng)基取出，放置于微波振蕩器中，在500?800MHz下振蕩2?3h，再將振蕩后的種子培養(yǎng)基按照15?18 %的接種量，放入發(fā)酵瓶中，分別向其中加入種子培養(yǎng)基質(zhì)量4?6%的麥芽糖、種子培養(yǎng)基質(zhì)量I?3%的質(zhì)量分數(shù)為10%的氯化鈷溶液，攪拌均勻，溫度設定為30?35°C，轉(zhuǎn)速設定為160?190r/min，通氣量1: 1.3?1.9，發(fā)酵5?7天，在發(fā)酵過程中每5?7h，向其中加入氯化鈷溶液等體積的1.3 X 105CFU/mL的銅綠假單胞菌菌液；
(6)待上述發(fā)酵結束后收集發(fā)酵液進行過濾，收集過濾液，將所得的過濾液放入離心機中，在9000?10000r/min下離心分離5?8min后，收集上清液，在紫外燈下殺菌，即可得到高含量西索霉素發(fā)酵液。
[0007]經(jīng)檢測本發(fā)明所得的高含量西索霉素發(fā)酵液得:西索霉素的生物效價為1200?2050ug/mL，西索霉素主組份為90?94.2%,提取純化收率達到76.5?83.8%,對環(huán)境無污染。
[0008]本發(fā)明的有益效果:
(1)本發(fā)明所得的高含量西索霉素發(fā)酵液純化收率高，且生物效價高；
(2)本發(fā)明所得的高含量西索霉素發(fā)酵液成本低，易于操作。
【具體實施方式】
[0009]按重量百份比計，取30?35份蔗糖、22?25份瓊脂、13?15份質(zhì)量分數(shù)為10%的硝酸鉀溶液、10?12份質(zhì)量分數(shù)為12%的氯化鈉溶液及18?20份葡萄糖，攪拌均勻后使用質(zhì)量分數(shù)為5 %的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，在120?130°C下，消毒殺菌30?40min，得斜面培養(yǎng)基;使用接種環(huán)將伊尼奧小單孢菌接種至上述斜面培養(yǎng)基，接種I?3次，將接種后的斜面培養(yǎng)基置于32?35°C，無菌環(huán)境下，培養(yǎng)7?9天后，將培養(yǎng)基移至O?4°C的冰箱中儲存4?6天，得斜面培養(yǎng)后的菌種，備用；按重量份數(shù)計，取35?42份淀粉、15?18粉豆腐渣、30?32份牛肉膏、3?4份L-脯氨酸、8?10份質(zhì)量分數(shù)為10%的硫酸鎂溶液、0.6?1.2份磷酸氫二鉀及0.4?0.8份磷酸二氫鉀，攪拌均勻后使用質(zhì)量分數(shù)為5 %的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，在110?120 °C下，消毒殺菌30?40min，得種子培養(yǎng)基;按照種子培養(yǎng)基體積8?12 %的接種量，將備用的斜面培養(yǎng)后的菌種接種至種子培養(yǎng)基上，隨后將種子培養(yǎng)基移至搖床培養(yǎng)箱中，在30?35°C，190?220r/min下，培養(yǎng)50?60h，在培養(yǎng)過程中，每8?1h向其中加入種子培養(yǎng)基體積0.8?1.4 %的甲磺酸乙酯;待上述培養(yǎng)結束后將種子培養(yǎng)基取出，放置于微波振蕩器中，在500?800MHz下振蕩2?3h，再將振蕩后的種子培養(yǎng)基按照15?18%的接種量，放入發(fā)酵瓶中，分別向其中加入種子培養(yǎng)基質(zhì)量4?6%的麥芽糖、種子培養(yǎng)基質(zhì)量I?3 %的質(zhì)量分數(shù)為10 %的氯化鈷溶液，攪拌均勻，溫度設定為30?35 0C，轉(zhuǎn)速設定為160?190r/min，通氣量1: 1.3?1.9，發(fā)酵5?7天，在發(fā)酵過程中每5?7h，向其中加入氯化鈷溶液等體積的1.3 X 105CFU/mL的銅綠假單胞菌菌液;待上述發(fā)酵結束后收集發(fā)酵液進行過濾，收集過濾液，將所得的過濾液放入離心機中，在9000?10000r/min下離心分離5?8min后，收集上清液，在紫外燈下殺菌，即可得到高含量西索霉素發(fā)酵液。
[0010]實例I
按重量百份比計，取30份蔗糖、25份瓊脂、15份質(zhì)量分數(shù)為10 %的硝酸鉀溶液、12份質(zhì)量分數(shù)為12%的氯化鈉溶液及18份葡萄糖，攪拌均勻后使用質(zhì)量分數(shù)為5%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7.0，在120°C下，消毒殺菌30min，得斜面培養(yǎng)基;使用接種環(huán)將伊尼奧小單孢菌接種至上述斜面培養(yǎng)基，接種I次，將接種后的斜面培養(yǎng)基置于32°C，無菌環(huán)境下，培養(yǎng)7天后，將培養(yǎng)基移至(TC的冰箱中儲存4天，得斜面培養(yǎng)后的菌種，備用;按重量份數(shù)計，取35份淀粉、18粉豆腐渣、32份牛肉膏、4份L-脯氨酸、10份質(zhì)量分數(shù)為10%的硫酸鎂溶液、1.2份磷酸氫二鉀及0.8份磷酸二氫鉀，攪拌均勻后使用質(zhì)量分數(shù)為5 %的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)P H至7.5，在110 °C下，消毒殺菌30min，得種子培養(yǎng)基;按照種子培養(yǎng)基體積8%的接種量，將備用的斜面培養(yǎng)后的菌種接種至種子培養(yǎng)基上，隨后將種子培養(yǎng)基移至搖床培養(yǎng)箱中，在30°C，190r/min下，培養(yǎng)50h，在培養(yǎng)過程中，每Sh向其中加入種子培養(yǎng)基體積0.8 %的甲磺酸乙酯；待上述培養(yǎng)結束后將種子培養(yǎng)基取出，放置于微波振蕩器中，在500MHz下振蕩2h，再將振蕩后的種子培養(yǎng)基按照15 %的接種量，放入發(fā)酵瓶中，分別向其中加入種子培養(yǎng)基質(zhì)量4