一對用于貝西滑刃線蟲pcr檢測的特異性引物及其使用方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及植物線蟲檢疫鑒定領域，提供了 1對用于貝西滑刃線蟲PCR檢測的特異 性引物及其使用方法，具體而言，所述方法通過組合使用新設計的貝西滑刃線蟲的特異性 引物W及已報道的植物寄生線蟲核糖體口 S區(qū)通用擴增引物，在1/10條線蟲DNA的靈敏度水 平上建立了一種新的用于檢測貝西滑刃線蟲的雙重PCR檢測方法，適用于口岸及農(nóng)林業(yè)相 關檢疫鑒定實驗室應用。
【背景技術】
[0002] 貝西滑刃線蟲(A地elenchoides besseyi Qiristie, 1942)是一種重要的遷移性 植物外寄生線蟲，其寄主范圍設及35個屬W上的高等植物，主要侵染水稻、谷子、草替等經(jīng) 濟作物，導致作物品質(zhì)下降并引起大面積減產(chǎn)。該線蟲抗逆性強，可長期潛伏于繁殖材料 中，主要通過帶病種子調(diào)運傳播擴散。自上世紀40年代傳入我國后，貝西滑刃線蟲現(xiàn)已在多 個省份發(fā)生危害，對國內(nèi)水稻和谷子生產(chǎn)造成了嚴重影響。
[0003] 傳統(tǒng)方法鑒定貝西滑刃線蟲主要基于形態(tài)學特征，由于滑刃屬線蟲種類繁多，形 態(tài)特征復雜多變，再加上貝西滑刃線蟲與其近似種菊花滑刃線蟲(A. ritzemabosi)、草替 滑刃線蟲(A.打agariae)形態(tài)特征十分相似，開展形態(tài)鑒定需要扎實的分類功底，具有一 定的局限性。在分子生物學技術快速發(fā)展的時代背景下，WPCR為基礎的分子檢測技術在植 物寄生線蟲分類鑒定中日漸成熟。
[0004] 本研究W貝西滑刃線蟲核糖體28S rRNA-D2/D3區(qū)核酸序列為祀標，設計其特異性 引物，同時引入核糖體ITS區(qū)通用引物作為內(nèi)標，嘗試建立一種高效、穩(wěn)定地貝西滑刃線蟲 雙重PCR檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題是克服貝西滑刃線蟲形態(tài)鑒定對技術人員素質(zhì)要求高 的難題，提供了一對新的貝西滑刃線蟲的特異性引物W及一種雙重PCR檢測方法，所述新的 貝西滑刃線蟲的特異性引物及雙重PCR檢測方法的步驟如下： 所述新的貝西滑刃線蟲的特異性引物，其特征在于，序列為：
上游引物GU-F: 下游引物GU-R: 所述新的貝西滑刃線蟲的特異性引物可與已報道的植物寄生線蟲核糖體ITS區(qū)通用引 物 F194: CGTAACAAGGTAGCTGTAG 和 AB28: ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT 組合建立雙重 PCR 檢測方 法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一、單條線蟲DNA的提??； 步驟二、雙重PCR擴增:PCR反應體系巧0yL):10X PCR BuffeKlS mmol/L Mg2+)5 化， dNTPs(2.5 mmol/L)2 yL，兩對引物F194/ AB28和GU-F/GU-R(10 ymol/L)每條引物I yL(共 化Ujhq DNA聚合酶巧U/yL)0.4化，模板DNA 10化，雙蒸水28.6化。除引物外，所用試 劑均購自寶生物(TAKARA)公司。PCR反應條件:95 °C預變性5 min;40個循環(huán)反應:95 °C變 性30 sec,55 °C退火30 sec,72 °C延伸1.5 min;最后72 °C保溫10 min,使反應物充分延 伸； 步驟=、結(jié)果判定:擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測若出現(xiàn)780 bp和245 bp兩個擴增條帶，陰性 對照（雙蒸水)無擴增條帶，則說明待檢線蟲為貝西滑刃線蟲，若只有780 bp擴增條帶，無 245 bp擴增條帶或出現(xiàn)大小不一致的條帶，則說明待檢線蟲不是貝西滑刃線蟲。
[0006] 所述雙蒸水即為經(jīng)過兩次蒸饋的無菌水，其通常用于分子生物學實驗。
[0007] 所述裂解液中的IOX PCR Buffer為TAKARA公司生產(chǎn)，商品編號分別為ROOlB和 9033； 優(yōu)選地，本申請的貝西滑刃線蟲的雙重PCR檢測方法中，步驟二中PCR反應條件要求退 火溫度為55 °C。
[000引本申請的方法適用于特異性檢測貝西滑刃線蟲(Aphelenchoides besseyi)。
[0009]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的進步在于:新設計的貝西滑刃線蟲的特異性引物可與 已報道的植物寄生線蟲ITS區(qū)通用擴增引物組合建立雙重PCR檢測方法，通過PCR擴增快速 檢測貝西滑刃線蟲，克服了 W前形態(tài)鑒定對技術人員素質(zhì)要求高的難題。本發(fā)明中的方法 高效、穩(wěn)定，靈敏度達到1/10條線蟲DNA的水平，可在我國口岸及農(nóng)林部口檢疫鑒定中推廣 應用。
【附圖說明】
[0010]圖1單重PCR檢現(xiàn)巧法特異性現(xiàn)聯(lián)結(jié)果； 圖2雙重PCR檢測方法特異性測試結(jié)果； 圖3雙重PCR檢測方法靈敏度測試結(jié)果； 圖1中各字母含義如下:M: DNA marker DL2000;泳道1-2: ABJS;泳道3-4: ABYN;泳道 5-6: AB皿；泳道7-8: ABT;泳道9-16: 27456、36890、22913、53121、26064、10967、1304、 1406;泳道17:雙蒸水陰性對照。
[00川圖2中各字母的含義如下：M: DNA marker DL2000;泳道1-2: ABJS;泳道3-4: ABYN;泳道 5-6: ABHB;泳道 7-8: ABT;泳道 9-16: 27456、36890、22913、53121、26064、 10967、1304、1406;泳道17:雙蒸水陰性對照。
[001^ 圖3中各字母含義如下:M: DNA marker DL2000;泳道1-8:分別為單條線蟲未稀 釋、稀釋5 X、稀釋IOX、稀釋20 X、稀釋40 X、稀釋80 X、稀釋160 X、稀釋320 X ;泳道9:雙 蒸水陰性對照。
【具體實施方式】
[001引為能進一步了解本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
、特點及功效，茲舉W下實施例，并配合附圖詳 細說明如下： 標本來源 供試線蟲包括貝西滑刃線蟲、松材線蟲、擬松材線蟲等多種線蟲的12個群體，詳情見下 表： 表1供試線蟲來源
實施例1、單重PCR檢測方法特異性測試 1.單條線蟲DNA提取 用雙蒸水將線蟲清洗干凈，挑取單條線蟲放入含如L d地20的PCR管中，用小型解剖刀 將線蟲切為2-3段，瞬時離屯、，反復凍融2次(液氮處理Imin, 65°C水浴2min)后，加入化L裂解 液(所述裂解液為10 X PCR Buf f er、雙蒸水與20mg/mL蛋白酶K的混合液(體積比10:9:1)，10 X PCR Buf fer與20mg/mL蛋白酶K均購自TAKARA公司），56°C保溫化，95°C加熱IOmin，瞬時離 屯、后上清液可用于后續(xù)的分子檢測。
[0014] 單重PCR擴增 PCR反應體系50 化：線蟲DNA模板 10 yUlOX PCR Buffer(Mg2〇5 yL、dNTP 2 化、引 物(GU-F/GU-R)各 1 yLjTaq酶0.4 yL、d地2〇 30.6 化。PCR反應程序：95 °C預變性5 min; 39個循環(huán)反應:95 °C變性30 sec,55 °C退火30 sec,72 °C延伸1 min;最后72 °C保溫10 min，使反應物充分延伸。
[001引電泳檢測 每個樣品取化L擴增產(chǎn)物，使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，設置電壓160V，電泳30min后 將凝膠放入邸染液中染色15min，隨后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。
[0016] 單重PCR檢測方法特異性測試結(jié)果 根據(jù)特異性引物GU-F/GU-R對貝西滑刃線蟲及其近似種的檢測結(jié)果表明（圖1)，該引物 對貝西滑刃線蟲擴增獲得245 bp的特異性片段，其他線蟲群體與陰性對照(雙蒸水)則無條 帶出現(xiàn)，對特異性片段回收測序后，Blast比對證明PCR產(chǎn)物即為目的片段，說明新構建的多 重PCR檢測方法滿足特異性要求。
[0017] 實施例2、雙重PCR檢測方法特異性測試 1.單條線蟲DNA提取 同實施例1。
[001引雙重PCR擴增 PCR反應體系50 化：線蟲DNA模板 10 yUlOX PCR Buffer(Mg205 yL、dNTP 2 化、內(nèi) 標引物F194/AB28各1化、特異性引物GU-F/GU-R各1 yLjTaq酶0.4 yL、d地20 28.6化。 PCR反應程序:95 °C預變性5 min;39個循環(huán)反應:95 °C變性30 sec,55 °C退火30 sec,72 °C延伸1.5 min;最后72 °C保溫10 min 3.電泳檢測 同實施例1。
[0019] 雙重PCR檢測方法特異性測試結(jié)果 在貝西滑刃線蟲特異性PCR反應體系中，加入通用引物F194/AB28作為內(nèi)標，構建一步 雙重PCR檢測方法。結(jié)果表明（圖2)，貝西滑刃線蟲群體均擴增出兩條清晰、穩(wěn)定的條帶，內(nèi) 標引物擴增產(chǎn)生780 bp的條帶，貝西滑刃線蟲特異性引物擴增產(chǎn)生245 bp的條帶;而其他 線蟲群體只有內(nèi)標引物擴增產(chǎn)生780 bp的條帶，無貝西滑刃線蟲特異性引物條帶出現(xiàn)，陰 性對照(雙蒸水)無條帶，說明雙重PCR檢測方法完全滿足特異性的要求。
[0020] 實施例3、雙重PCR檢測方法靈敏度測試 1.單條線蟲DNA提取 同實施例1。
[0021] 雙重PCR擴增 同實施例2。
[0022] 電泳檢測 同實施例1。
[0023] 雙重PCR檢測方法靈敏度測試結(jié)果 W單條線蟲DNA未稀釋、5 X稀釋、10 X稀釋、20 X稀釋、40 X稀釋、80 X稀釋、160 X稀 釋、320 X稀釋為梯度濃度的靈敏度測試結(jié)果顯示，單條貝西滑刃線蟲DNA的特異性條帶清 晰、明亮，稀釋至IOX時，特異性產(chǎn)物和內(nèi)標引物條帶均清晰可見，說明本研究建立的雙重 PCR檢測方法的靈敏度為1 /10條線蟲DNA，完全滿足靈敏度的要求。
【主權項】
1. 一對用于貝西滑刃線蟲PCR檢測的特異性引物，其特征在于，序列為： 上游引物⑶-F: 5 二GACACTGCAATCGCTTCGAC-3、 下游引物⑶-R: 5 二ATCCGCAACCACAACTCACA-3 \2. 根據(jù)權利要求1的特異性引物，其特征在于，該特異性引物可與已報道的植物寄生線 蟲核糖體 ITS區(qū)通用引物F194 : 5、CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3 L28 : 5、 ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-31且合建立雙重PCR檢測方法，該方法包括如下步驟： 步驟一、單條線蟲DNA的提?。? 步驟二、多重PCR擴增:PCR反應體系（50yL):10X PCR Buffer(15 mmol/L Mg2+)5 yL， dNTPs(2.5 mmol/L)2 yL，兩對引物F194/ AB28和⑶-F/GU-R(10 ymol/L)每條引物 1 yL(共 ^iLhrTaq DNA聚合酶(5 υ/μυ〇·4 yL，模板DNA 10 yL，雙蒸水28.6 yL;除引物外，所用試 劑均購自寶生物(TAKARA)公司；PCR反應條件:95 °C預變性5 min;40個循環(huán)反應:95 °C變 性30 sec，55 °C退火30 sec，72 °C延伸1.5 min;最后72 °C保溫10 min，使反應物充分延 伸； 步驟三、結(jié)果判定:擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測若出現(xiàn)780 bp和245 bp兩個擴增條帶，陰性 對照（雙蒸水)無擴增條帶，則說明待檢線蟲為貝西滑刃線蟲，若只有780 bp擴增條帶，無 245 bp擴增條帶或出現(xiàn)大小不一致的條帶，則說明待檢線蟲不是貝西滑刃線蟲。3. 根據(jù)權利要求2的檢測方法，其特征在于，步驟二的PCR反應條件中，退火溫度為55 Γ。4. 根據(jù)權利要求1的特異性引物和權利要求2的檢測方法，其特征在于:所述雙重PCR檢 測方法系用于特異性檢測貝西滑刃線蟲。
【專利摘要】本發(fā)明提供了1對用于貝西滑刃線蟲PCR檢測的特異性引物及其使用方法，所述方法的關鍵創(chuàng)新點為新設計的貝西滑刃線蟲的特異性引物可與已報道的植物寄生線蟲核糖體ITS區(qū)通用引物組合建立一種新的雙重PCR檢測方法，用于快速鑒定貝西滑刃線蟲。本發(fā)明中的方法高效、穩(wěn)定，靈敏度達到1/10條線蟲DNA的水平，可在我國口岸及農(nóng)林部門檢疫鑒定中推廣應用。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105603060
【申請?zhí)枴緾N201510900774
【發(fā)明人】林宇, 王金成, 張裕君, 劉躍庭, 馮潔, 顧建鋒, 陳先鋒
【申請人】天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2015年12月9日