一種馬鈴薯干腐病的分子檢測方法
【專利說明】-種馬鈴善干腐病的分子檢測方法 所屬技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明專利涉及一種檢測馬鈴墓干腐病致病菌的分子檢測方法，屬于分子生物學(xué) 方法對病原菌進(jìn)行分子檢測的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物病原真菌的分類鑒定主要依據(jù)其營養(yǎng)體和子實體的形態(tài)特征（方中達(dá)， 1998)，由于形態(tài)特征容易受到培養(yǎng)條件和其它因素的影響，而且許多子實體類型經(jīng)常難W 獲得，故給鑒定工作帶來困難。然而真菌DNA的堿基組成具有遺傳穩(wěn)定，不易受環(huán)境影響， 在生活史任何階段均可獲得等優(yōu)點。ITS區(qū)域在不同菌株間存在豐富的變異，對ITS區(qū)進(jìn)行 序列分析不僅豐富了真核生物核糖體基因 ITS的序列信息，為病原菌的分類鑒定及系統(tǒng)發(fā) 育等研究提供了十分重要的資料和依據(jù)，同時也為建立病原菌的分子檢測提供了一個準(zhǔn)確 和簡便的方式，因而越來越受到植物病理學(xué)家們的重視。利用病原菌在rDNA-ITS區(qū)段既具 保守性又在科、屬、種水平上具有特異性序列的特性，對ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序及序列 分析后再設(shè)計特異性引物來檢測和診斷植物病原菌，尤其是在植物病原真菌的分子檢測中 已越來越被廣泛應(yīng)用（王繼華，2004 ;俞大級，1997)。
[0003] 在我國對馬鈴墓干腐病的病原體的鑒定和檢測技術(shù)，相對而言還相對落后。大多 數(shù)病原體的鑒定和檢測還是停留在傳統(tǒng)生物學(xué)的水平上，甚至有些病原菌的監(jiān)測技術(shù)在免 疫學(xué)和電鏡技術(shù)上還沒有涉足，雖然送些傳統(tǒng)生物學(xué)檢測技術(shù)準(zhǔn)確、直觀、易于操作。但是， 在檢測特定病原菌時，需要的特定鑒別寄主不易獲得，且耗時費力，已經(jīng)不能適應(yīng)生產(chǎn)上快 速檢測的需求，送對于馬鈴墓干腐病防治是一個致命的弱點。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的 發(fā)展，除了傳統(tǒng)的檢測方法W外，分子生物學(xué)的檢測方法也得到了發(fā)展，由于PCR技術(shù)已經(jīng) 廣泛被應(yīng)用，大大地提高了植物病害的病原菌的檢出率，送對于馬鈴墓干腐病的病原菌的 快速檢測提供了一個有效的方法。本文對馬鈴墓干腐病的主要致病菌的rDNA-ITS序列進(jìn) 行分析設(shè)計了特異引物，利用常規(guī)PCR方法，建立馬鈴墓干腐病主要致病菌的分子檢測體 系。
[0004] 馬鈴墓是世界性的高產(chǎn)作物，其經(jīng)濟(jì)價值在世界作物中占第四位，中國是世界上 馬鈴墓種植面積最大的國家。對于我國北方大部分地區(qū)，特別是黑龍江省，由于氣候和±壤 更適合馬鈴墓的生長，馬鈴墓產(chǎn)業(yè)快速的發(fā)展起來，已經(jīng)成為黑龍江省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重 要特色產(chǎn)業(yè)之一，年產(chǎn)量占全國的10%左右。隨著馬鈴墓產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，鮮墓的膽藏數(shù)量 迅猛增加，膽藏周期進(jìn)一步延長，對替藏質(zhì)量要求越來越高。
[0005] 鑲刀菌干腐病是影響馬鈴墓膽藏質(zhì)量的重要真菌病害，被鑲刀菌侵染的墓塊會出 現(xiàn)腐爛變質(zhì)。在替藏過程中，由于替溫較高、濕度較大，鑲刀菌病會大面積發(fā)生，往往會導(dǎo)致 "爛替"，一般年份損失率約15% -35%，重災(zāi)年高達(dá)50%左右，已經(jīng)給我國馬鈴墓產(chǎn)業(yè)造成 了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，鑲刀菌在侵染馬鈴墓的時候，還會產(chǎn)生大量單端抱霉帰毒素，女口 果大量食用攜帶有毒素的墓塊會造成人畜中毒。因此，馬鈴墓的鑲刀菌病已經(jīng)成為影響我 國馬鈴墓儲藏和商品品質(zhì)的重大障礙。因此，開展黑龍江省馬鈴墓鑲刀菌干腐病病原菌分 離鑒定和分子檢測技術(shù)的研究，建立靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、實用的鑲刀菌檢測體 系對于早期預(yù)報和預(yù)防馬鈴墓干腐病的發(fā)生，對于馬鈴墓種墓的儲藏及商品種墓品種的保 證具有重要的現(xiàn)實意義。
[0006] 本發(fā)明專利依據(jù)鑲刀菌的rDNA區(qū)域保守序列設(shè)計特異性引物，建立了馬鈴墓干 腐病主要病原菌的常規(guī)PCR檢測體系，從而確立一套馬鈴墓干腐病的快速、靈敏、準(zhǔn)確的分 子檢測體系，并在田間進(jìn)行應(yīng)用，本專利建立的檢測方法靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、實 用的鑲刀菌分子鑒定方法對于早期預(yù)報和預(yù)防馬鈴墓干腐病的發(fā)生，對于馬鈴墓種墓的儲 藏及商品種墓品種的保證是必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明根據(jù)鑲刀菌高度保守的rDNA序列設(shè)計分子檢測的特異引物，建立馬鈴 墓干腐病致病菌的分子檢測體系，確定了該檢測體系的擴(kuò)增特異性、靈敏度，并在田間 進(jìn)行應(yīng)用；專用引物的序列為；上游引物；5' -GTAAAAGTCGTAACAAGGTC-3';下游引物： 5' -AAGTTCAGCGGGTATTC-3';擴(kuò)增目的片段為56化P，擴(kuò)增特異性專一，檢測靈敏度可W達(dá) 到Ipg/UL用于替藏馬鈴墓干腐病的檢測，檢出率為100%。
[000引 1.技術(shù)方案
[0009] 1. 1試驗材料與方法
[0010] 1. 1. 1菌株和質(zhì)粒
[0011] 馬鈴墓干腐病主要病原菌主要為6個菌株，分別為黃色鑲刀菌（F.culmorum)、 燕麥鑲刀菌（F. avenaceum)、擬絲抱鑲刀菌（F. trichothecioides)、擬枝鑲刀菌 (F. sporotrioides)、接骨木鑲刀菌（F. sambucinum)、腐皮鑲刀菌藍(lán)色變種（F. solani var. coeruleum(Sacc.))，各菌株保存在PDA斜面上，于25°C恒溫暗室中培養(yǎng)IOd后，置于4°C冰 箱保存?zhèn)溆?。所用大腸桿菌巧SChericha COli)菌株為D冊a，由本試驗室保存。
[0012] 1.1. 2試驗方法
[0013] 1. 1. 2. 1鑲刀菌rDNA區(qū)域保守序列片段的克隆與測序
[0014] (1)鑲刀菌的基因組DNA提取
[0015] 采用改良SDS法提取鑲刀菌的基因組DNA，各取3 U L DNA稀釋10倍，W稀釋所用 的超純水為對照，Lambda 35型分光光度計測其在260nm，280nm波長處的光吸收值、R值。 [001 引 DNA 濃度（y g/mL) = 0026。X 50 X 稀釋倍數(shù)；
[0017]總 DNA 的量（y g) = DNA 濃度（y g/mL) X 體積（mL);
[001引 R = Azee/Azs。表示DNA在波長為260皿和280皿處吸光值的比值。
[0019] (2)鑲刀菌rDNA的引物設(shè)計
[0020] 從GenBank中查找鑲刀菌rDNA序列的保守區(qū)域，應(yīng)用Primer Premie巧.0軟件設(shè) 計引物：
[00川 LDJl上游引物
[002引 UXJ2下游引物
[0023] 擴(kuò)增片段大小為560bp左右。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0024] (3) PCR 擴(kuò)增 [00巧]DPCR反應(yīng)
[0026] W鑲刀菌的基因組DM為模板，用特異性引物進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增。首先用 r-Taq酶進(jìn)行預(yù)試驗，擴(kuò)增出目的片段后，改用LA Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增完畢，取SuL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物用于回收，-2(TC保存。
[0027] r-Taq酶PCR反應(yīng)體系如下：
[0028] IOxBuffer 2.5\iL dNTP (各 2.5mM) 2.0陣 上游引物（IOpmol) I-O^L 下游引物（IOpmol) 1.0陣 模板DNA 2.0曲 MgCk (25mM) 1 單 r-Taq 酶（5u/pL) 0?仙L 姑2〇_14.6陣 Total 25)4,L
[0029] LA-Taq酶PCR反應(yīng)體系如下：
[0030] IOxLA PCRBufiferII S.O^iL dNTP (各 2.5mM) 8.0 咕 MgClz (25mM) 5.0陣
[0031] 上游引物（IOpmol) l.〇nL 下游引物（IOpmol) 1.0片L 模板 DNA l.OuL LATaq (SU/jiL) 0.5片L dHzO_28 單 Total 5〇iZ~
[003引 PCR反應(yīng)條件如下：
[0033] WC 3min 30sec 51.8°C 30sec 72 °C 45sec Goto 2 SOcircle 72 °C 5min 4°C 30min
[0034] 2) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測與鑒定
[0035] 擴(kuò)增完畢，取PCR產(chǎn)物5. 0 y L上樣于I. 0%的瓊脂糖凝膠上，同時用DNA DL2000 Marker作參照，IOOV恒壓電泳比，邸染色，在計算機(jī)凝膠成相系統(tǒng)上觀察，如果存在擴(kuò)增片 段大小與設(shè)計相符的條帶，即可進(jìn)行下一步的操作。
[0036] (4) PCR擴(kuò)增特異目的片段的純化回收
[0037] 使用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的凝膠回收試劑盒，取回收的產(chǎn)物2. Oy以 進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠檢測。
[0038] (5)目的片段與克隆載體的連接與轉(zhuǎn)化
[0039] 經(jīng)純化的DNA片段與pGEM-T Easy Vector載體建立W下的連接反應(yīng)體系，4°C連 接過夜。采用熱激法進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含Amp (IOOy L/L)培養(yǎng)基上， 37°C倒置培養(yǎng)12-1化。
[0040] (6)重組質(zhì)粒的鑒定
[0041] 采用PCR特異擴(kuò)增的方法對菌落