用于培養(yǎng)樹突狀細胞的誘導劑及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及組織工程領域，特別涉及一種用于培養(yǎng)樹突狀細胞的誘導劑及其應 用。
【背景技術】
[0002] 細胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的全新的抗腫瘤治療方法，彌補了傳 統(tǒng)的手術、放療、化療的弊端，已經(jīng)被公認為二十一世紀腫瘤綜合治療模式中最活躍、最有 發(fā)展前途的一種治療手段，也是世界目前唯一有希望完全消滅腫瘤細胞的治療手段。
[0003] 細胞免疫治療療法是采集人體自身免疫細胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)，使其數(shù)量成千倍增 多，靶向性殺傷功能增強，然后再回輸?shù)饺梭w來殺滅血液及組織中的病原體、癌細胞、突變 的細胞，打破免疫耐受，激活和增強機體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功效。目前在 臨床中使用最多的細胞免疫治療療法主要是DC治療、CIK治療和DC-CIK聯(lián)合免疫治療。
[0004] DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強大的抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)， 一方面，其能夠刺激初始的T細胞增殖，啟動免疫應答;另一方面，樹突狀細胞還能夠呈遞抗 原給MHC-I類限制性CD8+和MHC-II類限制性CD4+T淋巴細胞，誘導特異性免疫反應，被稱為 "天然免疫佐劑"，因此，樹突狀細胞在誘導免疫應答中具有獨特的地位。
[0005] 近年來，以樹突狀細胞(dendritic cell，DC)為基礎的腫瘤免疫治療及DC疫苗已 取得較大進展，體外制備的DC疫苗顯示出明顯誘發(fā)抗腫瘤免疫應答的能力，具有良好的臨 床應用前景。目前，從外周血單個核細胞(PBMC)經(jīng)GM-CSF、IL-4體外誘導培養(yǎng)DC的方法已基 本得到公認，但DC體外促成熟的方案尚沒有統(tǒng)一的標準，國內(nèi)主要采用TNF-a因子，但該方 法活化的DC成熟度低下，不能分泌促炎因子IL-12,致使培養(yǎng)得到的DC功能缺陷，很大程度 上限制了DC疫苗的臨床應用工作的開展。因此，有必要對現(xiàn)有DC細胞培養(yǎng)方案進行進一步 完善，以有效提高DC疫苗在誘導抗炎或抗腫瘤免疫應答中的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題是，針對現(xiàn)有技術培養(yǎng)出的樹突狀細胞體外誘導成熟 率低，細胞增殖率低，且抗原提呈性能差等缺陷，提供一種能夠提高樹突狀細胞成熟率及抗 原提呈性能的用于培養(yǎng)樹突狀細胞的誘導劑及其應用。
[0007] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是:提供一種用于培養(yǎng)樹突狀細胞的誘 導劑，包括rhTNF-α和，番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物。
[0008] 在本發(fā)明提供的用于培養(yǎng)樹突狀細胞的誘導劑中，所述rhTNF-a的濃度為800~ 1200U/ml和，番茄脂溶性提取物的濃度為5~15μg/ml或所述番茄水溶性提取物的濃度為5 ~15μg/ml〇
[0009] 在本發(fā)明提供的用于培養(yǎng)樹突狀細胞的誘導劑中，所述rhTNF-a的濃度為1000U/ ml和，番茄脂溶性提取物的濃度為lOμg/ml或所述番茄水溶性提取物的濃度為10μg/ml。 [0010]在本發(fā)明提供的用于培養(yǎng)樹突狀細胞的誘導劑中，所述rhTNF-a的濃度為800U/ml 和，番茄脂溶性提取物的濃度為5μg/ml或所述番茄水溶性提取物的濃度為5μg/ml。
[0011]在本發(fā)明提供的用于培養(yǎng)樹突狀細胞的誘導劑中，所述rhTNF-α的濃度為1200U/ ml和，番茄脂溶性提取物的濃度為15μg/ml或所述番茄水溶性提取物的濃度為15μg/ml。本 發(fā)明還提供了上述用于培養(yǎng)樹突狀細胞的誘導劑在培養(yǎng)樹突狀細胞成熟過程中的應用。 [0012]實施本發(fā)明提供的用于培養(yǎng)樹突狀細胞的誘導劑及其應用，可以達到以下有益效 果:與現(xiàn)有培養(yǎng)樹突狀細胞的誘導劑相比，本發(fā)明提供的DC誘導活化劑，能夠促進提高樹突 狀細胞的細胞活性，提高樹突狀細胞的增值率及成熟率，進而提高樹突狀細胞的抗原提呈 性。
【具體實施方式】
[0013] 本發(fā)明提供的用于培養(yǎng)樹突狀細胞的誘導劑包括rhTNF-a(Recombinant human tumor necrosis factor-α，重組人腫瘤壞死因子α)和番前脂溶性提取物;其中，可采用番 茄水溶性提取物代替番茄脂溶性提取物。
[0014] 進一步地，rhTNF-α能夠刺激樹突狀細胞成熟，以提高樹突狀細胞抗原提呈能力； 優(yōu)選地，rhTNF-a的濃度為800~1200U/ml。
[0015] 番茄中有活性作用的主要脂溶性化合物為類胡蘿卜素等，類胡蘿卜素及其他番茄脂 溶性提取物能夠促進未成熟的樹突狀細胞的生長和增殖，抑制細胞代謝過程中產(chǎn)生的H 2〇2 對細胞膜的損傷，降低細胞R〇S、LPO含量，增加 SOD酶活性，減少DNA損傷，提高樹突狀細胞的 活性及存活率并促進其成熟。優(yōu)選地，番茄脂溶性提取物的終濃度為5~15μg/ml。
[0016] 番茄脂溶性提取物的提取方法為:取新鮮番茄處理成漿狀后，干燥成粉末備用。取 番茄粉末加入乙醇-正丁烷萃取液混勻，離心，收集上清液；向殘留物中添加正丁烷混勻，離 心，再次收集上清液；可重復該提取步驟2~3次，然后將收集的上清液混合，用蒸餾水和 NaCl溶液清洗后，用氮氣吹干即可;使用時，取番茄脂溶性提取物溶解于甲醇-甲基叔丁基 醚-水溶液，過濾備用；需要說明的是，該提取步驟全程均在避光條件下操作，以防止類胡蘿 卜素氧化。
[0017] 番茄中有活性作用的主要水溶性化合物為酚類化合物等，酚類化合物能夠清除細 胞代謝過程中產(chǎn)生的自由基，減少對細胞的損傷，提高樹突狀細胞的細胞活性，促進其增 殖。優(yōu)選地，番茄水溶性提取物的終濃度為5~15μg/ml。
[0018] 番茄水溶性提取物的提取方法為：取番茄粉末，加入乙醇提取液，加熱至40~70 °C、1~2小時，冷卻后離心;于相同條件下提取殘渣兩次，合并上清液，過濾備用。
[0019 ]本發(fā)明提供的用于培養(yǎng)樹突狀細胞的誘導劑，應用于培養(yǎng)樹突狀細胞的方法，包 括以下步驟：
[0020] S1、獲取樹突狀細胞前體單個核細胞；
[0021] S2、采用第一誘導劑將樹突狀前體細胞當個核細胞誘導分化成未成熟樹突狀細 胞；
[0022] S3、采用第二誘導劑將未成熟樹突狀細胞誘導分化成成熟的樹突狀細胞。
[0023] 具體地，步驟S1中，優(yōu)選地，樹突狀細胞前體單個核細胞來源于新鮮外周血，相比 經(jīng)過冷庫儲存或者培養(yǎng)傳代之后的樹突狀細胞，從新鮮血液中制備的樹突狀細胞前體單個 核細胞離體時間較短，其細胞活性和狀態(tài)的減弱或者形態(tài)改變程度都較少，更加利于保持 其免疫性能。在本發(fā)明中，樹突狀細胞前體單個核細胞的具體獲取過程為：
[0024]抽取外周靜脈血，稀釋，添加淋巴細胞分離液離心10~20分鐘后，分離獲取外周血 單個核細胞；
[0025] 用含有10%~15%的胎牛血清、50~150U/ml青霉素和50~150U/ml鏈霉素的完全 培養(yǎng)基懸浮細胞濃度至(2~6) X106個/ml，孵育1~3小時，更換新的完全培養(yǎng)基，收集細胞 懸液，即為樹突狀細胞前體單個核細胞懸液。
[0026] 步驟S2的具體過程為：
[0027] 取步驟S1獲得的樹突狀細胞前體單個核細胞懸液，離心洗滌后計數(shù)，使細胞濃度 達到（1~3) X106個/ml，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，并與培養(yǎng)當天添加第一誘導劑，培養(yǎng)4~7天， 每隔2~3天更換培養(yǎng)基。
[0028] 其中，第一誘導劑包括rhGM_CSF(Recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，重組人粒-巨細胞集落刺激因子）和rhIL_4(Recombinant human interleukin 4,重組人白細胞介素4);其中，rhGM-CSF的終濃度為800~1200U/ml和 rhIL-4的終濃度為800~1200U/ml;更為優(yōu)選地，rhGM-CSF的終濃度為1000U/ml，rhIL-4的 終濃度為l〇〇〇U/ml。
[0029] 第一誘導劑所含成分能夠誘導樹突狀細胞前體單個核細胞轉(zhuǎn)化為未成熟的樹突 狀細胞，增大細胞體積，并促進細胞的生長增殖和分化，促進細胞形成集落；同時，對已分化 的未成熟樹突狀細胞進行預刺激，使未成熟樹突狀細胞能夠快速成熟。
[0030] 步驟S3的具體過程為：
[0031 ]向步驟S2a獲得的未成熟樹突狀細胞中添加第二誘導劑培養(yǎng)2~4天至未成熟的樹 突狀細胞全部成熟;其中，第二誘導劑即為本發(fā)明提供的用于培養(yǎng)樹突狀細胞的誘導劑，該 第二誘導劑包括rhTNF-α(Recombinant human tumor necrosis factor-α，重組人腫瘤壞 死因子a)和番茄脂溶性提取物或番茄水溶性提取物;且rhTNF-a的終濃度為800~1200U/ ml、番茄脂溶性提取物的終濃度為5~15μg/ml或番茄水溶性提取物的濃度為5~15μg/ml; 更為優(yōu)選地，rhTNF-a的終濃度為l〇〇〇U/ml，番茄脂溶性提取物的終濃度為10μg/ml，番茄水 溶性提取物的終濃度為l〇μg/ml。
[0032]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明 進行