7444g>a突變檢測方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種非綜合征性耳聾相關(guān)的線粒體 tRNASei(_7444G>A突變檢測方法及試劑盒的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 耳聾是最常見殘疾之一，我國現(xiàn)有耳聾人數(shù)約2004萬，新生兒耳聾的發(fā)生率為 0.1%~0.3%，其中約50%屬遺傳性耳聾。而遺傳性耳聾具有高度的遺傳異質(zhì)性，多個基因 的突變都與之相關(guān)，常用的檢測技術(shù)如限制性內(nèi)切酶分析、基因測序等難以滿足篩查診斷 的需求。許多耳聾患者由于基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多態(tài)性造成對致聾環(huán)境因素 易感性增加而致病。因此，遺傳性耳聾的分子病因?qū)W研究非常重要。線粒體是細胞氧化磷酸 化的中心也是能量代謝的中心。線粒體DNA突變與氨基糖甙類藥物致聾和非綜合征型耳聾 有關(guān)。迄今為止，在耳聾基因的發(fā)現(xiàn)及診斷方面已有了階段性的成果，還遠不能解釋臨床中 出現(xiàn)的各種耳聾表型特征出現(xiàn)的原因，而且很大一部分還限于實驗室階段，檢測手段尚待 完善，簡便、可靠、經(jīng)濟并能夠提供給臨床應(yīng)用的基因檢測及治療方法還有待進一步研究及 改進。因此，迫切需要一種快速、準確、操作簡易的非綜合征性耳聾相關(guān)的線粒體突變篩查 方法及臨床突變篩查工具。
[0003] 中國專利CN201410728222.5公開了一種新的耳聾相關(guān)基因突變檢測體系，通過使 用多重PCR引物及檢測探針檢測耳聾基因突變位點中是否存在突變，所述耳聾基因突變位 點包括46個耳聾基因突變位點。但是該方法在操作過程中存在雜合突變、膠壓縮、GC富集區(qū) 的等問題，很難通過一次測序獲得精確的數(shù)據(jù)。
[0004] 中國專利CN201210300590.0公開了一種應(yīng)用于檢測線粒體DNA A1555G、C1494T突 變的混合液及試劑盒和檢測系統(tǒng)，是應(yīng)用一對特異性引物、4條攜帶不同熒光基團的LNA探 針在一個反應(yīng)體系里多重實時檢測線粒體DNA 1555位點、1494位點的野生型和突變型，該 試劑盒包括人體基因組DNA提取試劑、引物和探針的混合液、PCR反應(yīng)混合液、陰性對照DNA、 陽性對照DNA。但是該利用該結(jié)構(gòu)進行檢測時，操作復(fù)雜、耗時較長，且儀器設(shè)備昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為了解決上述不足，本發(fā)明提供一種線粒體tRNASef(UGN)基因 G7444A突變檢 測試劑盒，試劑盒包括:提取樣本全基因組DNA的試劑、PCR擴增反應(yīng)試劑、酶切反應(yīng)試劑、陽 性標準品、陰性標準品。
[0006] 進一步地，提取樣本全基因組DNA的試劑包括:裂解液、溶液I、酚-氯仿-異戊醇混 合液和溶液Π 。
[0007] 進一步地，PCR擴增反應(yīng)試劑包括:dNTP、10 X PCR緩沖液、MgCl2、引物、Taq酶和三 蒸水。
[0008] 進一步地，溶液I的主要成分為蛋白酶K，溶液Π 的主要成分為氫氧化鈉。
[0009] 本發(fā)明的另一目的，在于提供一種線粒體tRNASCT(LO)基因 G7444A突變檢測中使用 的引物，引物特異性的擴增包含7444位點的序列，并且擴增的序列中不含有其它TCTAGA回 文結(jié)構(gòu)。
[0010] 進一步地，引物序列為：
[0011] Ser(UCN)F 5'-ACGCCAAAATCCATTTCACT-3'
[0012] Ser(UCN)R 5，-CGGGAATTGCATCTGTTTTT-3，〇
[0013] 進一步地，引物中無連續(xù)出現(xiàn)的5個同一堿基，GC含量為40%，無引物二聚體和發(fā) 夾結(jié)構(gòu)，設(shè)計引物人工合成。
[0014] 本發(fā)明還有一目的，在于提供一種線粒體tRNASCT(UGN)基因 G7444A突變的檢測方法， 包括：
[0015] 步驟S01，提取全基因組DNA:運用蛋白酶K消化裂解蛋白質(zhì)，然后采用酚-氯仿-異 戊醇法從細胞/血液/組織樣本中提取全基因組DNA;
[0016] 步驟S02,特異性PCR擴增及酶切:采用專一性限制性內(nèi)切酶Xbal在一對Ser(UCN)F 和Ser (UCN) R引物的配合下，對樣本的全基因組DNA進行PCR擴增和酶切；
[0017] 步驟S03，突變鑒定，包括:將酶切后的產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)酶切后 產(chǎn)生的DNA片段大小不同，檢測線粒體tRNA SCT(_基因7444位點突變狀況。
[0018] 進一步地，步驟S02中，所述Ser(UCN)F和Ser(UCN)R引物的擴增包含7444位點的序 列，且擴增的序列中不含有其它TCTAGA回文結(jié)構(gòu)。
[0019]本發(fā)明還有一目的，在于提供一種線粒體tRNASCT(_基因 G7444A突變檢測中使用 的引物在制備檢測試劑盒中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明通過酶切法進行非綜合征性耳聾相關(guān)的線粒體tRNASeI(UGN)7444G>A突變檢 測，克服了現(xiàn)有方法耗時長、操作難、成本高等缺點，提供非綜合征性耳聾相關(guān)的線粒體 伐^^^ (1〇)7444(}^突變檢測試劑盒，以及上述方法或上述的試劑盒在檢測與非綜合征性耳 聾相關(guān)的線粒體tRNA Sel:(ueN)7444G>A突變檢測突變中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0022] 1.本發(fā)明的所用標本血液、尿液、組織等采集后仍可用于后續(xù)實驗研究，如血液樣 本可建立永生化類淋巴母細胞系、尿液細胞可用于成纖維細胞培養(yǎng)、組織可用于誘導(dǎo)多功 能干細胞的建立，可保存珍貴的遺傳資源。
[0023] 2.本試劑盒借助特異性PCR技術(shù)與專一性限制性內(nèi)切酶Xbal特異性的識別TCTAGA 回文結(jié)構(gòu)的特點，每份DNA樣本用1對特異性引物進行PCR擴增，然后用專一性限制性內(nèi)切酶 Xbal進行1次酶切即可在幾小時內(nèi)對非綜合征性耳聾相關(guān)的線粒體tRNASel:(ueN)基因 G7444A 突變進彳丁檢測。
[0024] 3.本試劑盒提供的陽性標準品和陰性標準品可以對應(yīng)用本試劑盒的檢測結(jié)果進 行對比分析，從而更直觀、更清晰的分析檢測結(jié)果。
[0025] 4.本發(fā)明提供的線粒體tRNASCT(ueN)7444G>A突變檢測試劑盒，提供了完整的監(jiān)測體 系及詳細的說明書，與其他檢測方法相比，本發(fā)明檢測方法操作簡便、易掌握;對儀器設(shè)備 及操作人員無特殊要求，適合在一般醫(yī)院、分子生物實驗室開展，為全國性開展非綜合征性 耳聾相關(guān)的線粒體tRNASe" (ueN)7444G>A突變的大規(guī)模篩查和預(yù)防性檢查提供條件，有效減少 非綜合征性耳聾的發(fā)生率，做到早篩查、早預(yù)防和早治療。
【附圖說明】
[0026] 圖1是本發(fā)明特異性條帶擴增循環(huán)條件；
[0027] 圖2是本發(fā)明突變樣本、對照樣本PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物圖；
[0028] 圖3是本發(fā)明突變樣本、對照樣本測序峰圖；
[0029]圖4是本發(fā)明流程不意圖。
[0030] 其中，1為DNAmarker，2為PCR產(chǎn)物①，3為PCR產(chǎn)物②，4為突變樣本的酶切產(chǎn)物①，5 為突變樣本的酶切產(chǎn)物②，6為野生型樣本的酶切產(chǎn)物①，7為野生型樣本的酶切產(chǎn)物②。
【具體實施方式】
[0031] 以下將結(jié)合實施方式來詳細說明本發(fā)明的實施方式，借此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù) 手段來解決技術(shù)問題，并達成技術(shù)效果的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。
[0032] 需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施方式及實施方式中的特征可 以相互組合。
[0033]本發(fā)明的一實施方式中，提供了一種線粒體tRNASei(UGN)基因 G7444A突變檢測試劑 盒，試劑盒包括:提取樣本全基因組DNA的試劑、PCR擴增反應(yīng)試劑、酶切反應(yīng)試劑、陽性標準 品、陰性標準品；提取樣本全基因組DNA的試劑包括:裂解液、溶液I、酚-氯仿-異戊醇混合液 和溶液Π ; PCR擴增反應(yīng)試劑包括:dNTP、10 X PCR緩沖液、MgC12、引物、Taq酶和三蒸水;溶液 I的主要成分為蛋白酶K，溶液Π 的主要成分為氫氧化鈉；引物序列為：
[0034] Ser(UCN)F 5，-ACGCCAAAATCCATTTCACT-3'
[0035] Ser(UCN)R 5，-CGGGAATTGCATCTGTTTTT-3,〇
[0036] 本發(fā)明再一實施方式中，還提供了一種線粒體tRNASef(UGN)基因 G7444A突變檢測中 使用的引物，引物特異性的擴增包含7444位點的序列，并且擴增的序列中不含有其它 TCTAGA回文結(jié)構(gòu)，引物中無連續(xù)出現(xiàn)的5個同一堿基，GC含量為40%，無引物二聚體和發(fā)夾 結(jié)構(gòu)，設(shè)計引物人工合成。
[0037]本發(fā)明另一實施方式中，提供了一種線粒體tRNASCT(lo)基因 G7444A突變的檢測方 法，主要內(nèi)容如下：
[0038] 1. DNA的提取:運用酚-氯仿-異戊醇法提取血液標本、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜刮 片或唾液的樣本中的DNA。
[0039] 2.特異性引物設(shè)計及特異性條帶PCR擴增:使用Primer 5.0軟件根據(jù)人類線粒體 基因序列(NC_012920.1)在7444前后設(shè)計上游引物Ser(UCN)F、下游引物Ser(UCN)R;采用上 述引物對包含7444的特異性條帶進行擴增。
[0040] 3.專一性酶切及電泳鑒定:采用專一性限制性內(nèi)切酶Xbal對上述特異性條帶進行 酶切，酶切后產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可鑒定是否發(fā)生7444G>A突變。
[0041 ] 具體步驟如下：
[0042] 1.收集標本
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