使用電方法的分子分析物的數(shù)字分析的制作方法
【專利說明】
[0001 ] 背景
[0002] 相關(guān)申請的交叉參考
[0003] 本申請要求2013年8月22日提交的美國臨時申請No.61/868,988的優(yōu)先權(quán)，將其全 部按引用并入本文中。本申請還將美國臨時申請No. 61 /728，067和國際專利申請No . PCT/ US2013/070797全部按引用并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明公開內(nèi)容涉及可用于分子的電檢測的組合物和方法，并且更具體地，涉及 使用數(shù)字化電信號和使用錯誤校正方案來表征靶標分析物的復(fù)雜混合物。
【背景技術(shù)】
[0005] 多重分子和生化方法可用于分子分析物的鑒別和定量。實例包括常用的基于核酸 的分析，如qPCR(定量聚合酶鏈式反應(yīng))和DNA微陣列，以及基于蛋白質(zhì)的方法，如免疫分析 和質(zhì)譜。然而，在目前的分析物分析技術(shù)中存在各種局限性。例如，目前的方法具有靈敏度 的局限性，尤其是在分析物以低拷貝數(shù)或以低濃度存在于生物樣品中的情況下。為了較高 的靈敏度，大部分核酸定量技術(shù)涉及樣品擴增。然而，擴增技術(shù)將偏差和不精確性引入了定 量中。此外，對于蛋白質(zhì)和肽是不可能擴增的。由于缺乏靈敏度，用于檢測和定量的方法常 常需要相對大的樣品體積。
[0006] 目前的方法對于其鑒別和定量大量分析物的能力也受到限制。樣品中全部mRNA和 蛋白質(zhì)的定量需要高的多重性(multiplexity)和大的動態(tài)范圍。此外，目前的技術(shù)缺乏同 時檢測和定量核酸和蛋白質(zhì)的能力。
[0007] 由于諸如弱的信號檢測、假陽性和其他錯誤的情況，目前的方法在分析物檢測和 定量過程中常常產(chǎn)生錯誤。這些錯誤可能導(dǎo)致分析物的錯誤鑒別和不準確的定量。
[0008] 因此，需要允許以小的樣品體積而具有高靈敏度、高多重性、大動態(tài)范圍以及在單 一分析中檢測蛋白質(zhì)和核酸分子的能力的用于分析物分析的方法和系統(tǒng)。此外，需要用于 校正分析物檢測錯誤的錯誤校正方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)的這些和其他局限性。
【附圖說明】
[0009] 公開的實施方案具有其他優(yōu)點和特征，其從以下結(jié)合附圖的發(fā)明詳述和所附的權(quán) 利要求更容易清楚地理解，其中：
[0010] 附圖（或"圖"）1說明了根據(jù)一個實施方案，固定于基質(zhì)上并特異性地結(jié)合組合物 的靶標分析物的實例。
[0011] 圖2A和2B說明了根據(jù)一個實施方案，固定于基質(zhì)上并特異性地結(jié)合組合物的靶標 分析物的實例，所述組合物包括尾區(qū)，所述尾區(qū)包括一個或多個中止堿基。
[0012] 圖3是高級框圖，其說明了根據(jù)一個實施方案，用于分析分子分析物的計算機300 的實例。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明提供了一種組合物，其包含:探針區(qū)，其中探針區(qū)配置成特異性地結(jié)合靶標 分析物;尾區(qū)，該尾區(qū)包含同型聚合的堿基區(qū)，所述堿基區(qū)包含至少25個連續(xù)的核苷酸；和 任選的位于探針區(qū)和尾區(qū)之間的接頭區(qū)，其中接頭區(qū)包含配置成特異性地結(jié)合尾區(qū)的一部 分的核苷酸序列，并且其中在任選的接頭區(qū)存在時，探針區(qū)和尾區(qū)各自包含單獨的核酸分 子。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種組合物，其包含:探針區(qū)，其中探針區(qū)配置成特異性地結(jié)合靶 標分析物;和至少一個連接至探針區(qū)的接頭區(qū)，其中接頭區(qū)包含配置成特異性地結(jié)合至少 一個尾區(qū)的一部分的核苷酸序列，所述尾區(qū)包含同型聚合的堿基區(qū)，所述堿基區(qū)包含25個 連續(xù)的核苷酸，其中探針區(qū)和尾區(qū)各自包含單獨的核酸分子。在一個實施方案中，所述組合 物進一步包含至少一個尾區(qū)，其中每個尾區(qū)的一部分配置成特異性地結(jié)合不同的接頭區(qū)。
[0015] 在一個實施方案中，組合物的尾區(qū)和探針區(qū)通過核酸骨架共價連接。在另一個實 施方案中，所述尾區(qū)進一步包含一個或多個核苷酸，所述核苷酸包含一個或多個與同型聚 合的堿基區(qū)內(nèi)的堿基不同的堿基。在另一個實施方案中，接頭區(qū)配置成特異性地結(jié)合多個 尾區(qū)的部分。在進一步的實施方案中，同型聚合的堿基區(qū)包含多聚-A尾、多聚-T尾、多聚-C 尾或多聚-G尾。在再另一個實施方案中，同型聚合的堿基區(qū)包含至少100或200個連續(xù)的核 苷酸。在一些實施方案中，靶標分析物包含蛋白質(zhì)、肽或核酸。在其它實施方案中，探針區(qū)包 含蛋白質(zhì)、肽、核酸或抗體。在其他實施方案中，接頭區(qū)序列包含至少10個核苷酸或20-25個 核苷酸。
[0016] 在一個實施方案中，尾區(qū)進一步包含:與同型聚合的堿基區(qū)相鄰的核苷酸，其中該 核苷酸包含與同型聚合的堿基區(qū)內(nèi)的堿基不同的堿基;與所述核苷酸相鄰的第二同型聚合 的堿基區(qū)，其中所述第二同型聚合的堿基區(qū)包含與該核苷酸的堿基不同的堿基;和任選的 多個另外的同型聚合的堿基區(qū)，其各自通過插入核苷酸與相鄰的同型聚合的堿基區(qū)分開， 其中插入核苷酸的堿基與每個相鄰的同型聚合的堿基區(qū)的堿基不同。
[0017] 在另一個實施方案中，每個同型聚合的堿基區(qū)包含相同的堿基。在另一個實施方 案中，所述核苷酸和每個任選的插入核苷酸包含相同的堿基。在單獨的實施方案中，包含多 個根據(jù)權(quán)利要求15的組合物的庫，其中（1)每個探針區(qū)與多個接頭區(qū)相關(guān)聯(lián)，和(2)每個接 頭區(qū)特異性地結(jié)合不同尾區(qū)的一部分。在進一步的實施方案中，庫中所有尾區(qū)的長度是恒 定的。
[0018] 本發(fā)明還提供了表征至少一種靶標分析物的方法，其包括:獲得多個有序的尾區(qū) 集，每個有序的尾區(qū)集包含權(quán)利要求1和3-18任一項中的一個或多個尾區(qū)，并且針對N種不 同靶標分析物的限定子集，其中N種不同的靶標分析物固定于基質(zhì)的空間上單獨的區(qū)域上； 將N種不同的靶標分析物在設(shè)計為促進探針區(qū)與一種或多種固定的N種不同的靶標分析物 特異性地結(jié)合的條件下接觸權(quán)利要求1-18任一項的探針區(qū);進行至少Μ個循環(huán)，其中所述進 行包括：（1)雜交步驟（如果尾區(qū)沒有共價連接至探針區(qū)），其包括將結(jié)合的探針區(qū)接觸尾 區(qū)，其中每個尾區(qū)特異性地結(jié)合探針區(qū)的接頭區(qū)；（2)合成步驟，該合成步驟包括在導(dǎo)致合 成使用尾區(qū)作為模板的多核苷酸鏈的條件下將結(jié)合的尾區(qū)接觸包含試劑的反應(yīng)混合物;和 (3)剝離步驟，該剝離步驟包括將尾區(qū)或探針區(qū)從Ν種不同的靶標分析物剝離;檢測至少Μ個 循環(huán)的每個循環(huán)的過程中來自基質(zhì)的空間上單獨的區(qū)域的多個輸出信號;和從檢測的多個 輸出信號針對N種不同的靶標分析物中的一種或多種確定每個循環(huán)的至少K位的信息，其中 將至少K位的信息用于確定總的L位的信息，其中KXM = L位的信息，且L2 log2(N)，并且其 中將L位的信息用于鑒別N種不同靶標分析物中的一種或多種。
[0019] 在一個實施方案中，L>log2(N)，并且L包括用于校正多個信號中的錯誤的信息 位。在另一個實施方案中，L>log 2(N)，并且L包括以預(yù)定順序排序的信息位。在進一步的實 施方案中，預(yù)定順序是隨機順序。在另一個實施方案中，L>log 2(N)，并且L包括用于確定針 對N種不同靶標分析物中每一種的識別碼的信息位。在單獨的實施方案中，L>log 2(N)，并且 L包括含有用于針對至少Μ個循環(huán)中每個循環(huán)解碼有序尾區(qū)集的順序的密鑰的信息位。在進 一步的實施方案中，密鑰解碼了Ν種不同分析物中的一種或多種的身份。在另一個實施方案 中，將針對Ν靶標分析物確定的L位的信息與通過密鑰提供的預(yù)期信息位進行比較，其中將 該比較用于確定Ν靶標分析物的身份。在另一個實施方案中，有序尾區(qū)集的數(shù)量基于Ν種不 同革巴標分析物的數(shù)量。
[0020] 在一個實施方案中，將多個輸出信號數(shù)字化以擴大多個信號的動態(tài)檢測范圍。在 另一個實施方案中，本發(fā)明的方法是計算機執(zhí)行的。在單獨的實施方案中，L位信息可以用 于確定針對多個輸出信號的錯誤校正。在進一步的實施方案中，錯誤校正包括使用Reed-Solomon碼。在另一個實施方案中，上述基質(zhì)含有至少一個檢測多個輸出信號的晶體管。在 進一步的實施方案中，所述晶體管是離子敏感的場效應(yīng)晶體管（ISFET)結(jié)構(gòu)。
[0021] 本發(fā)明還提供了用于表征至少一種靶標分析物的試劑盒，其包含：多個探針區(qū)容 器，每個探針區(qū)容器容納不同的分子，所述分子包含權(quán)利要求1的探針區(qū)和接頭區(qū)；多個有 序尾區(qū)容器，每個尾區(qū)容器容納不同的核酸分子，所述核酸分子包含權(quán)利要求1的尾區(qū)；容 納反應(yīng)混合物的反應(yīng)混合物容器，所述反應(yīng)混合物包含用于從尾區(qū)之一合成多核苷酸鏈模 板的酶和多核苷酸;和使用說明，包括在導(dǎo)致多核苷酸鏈反應(yīng)產(chǎn)物合成的條件下將靶標分 析物接觸至少一個探針區(qū)容器的內(nèi)容物或其一部分、至少一個尾區(qū)容器的內(nèi)容物或其一部 分以及反應(yīng)混合物容器的內(nèi)容物或其一部分的說明。
[0022] 本發(fā)明還提供了用于表征至少一種靶標分析物的試劑盒，其包含：多個組合物容 器，每個組合物容器容納權(quán)利要求1-18任一項的不同組合物;容納反應(yīng)混合物的反應(yīng)混合 物容器，所述反應(yīng)混合物包含用于從尾區(qū)之一(如果存在尾區(qū)的話)合成多核苷酸鏈模板的 酶和多核苷酸;和使用說明，包括在導(dǎo)致多核苷酸鏈反應(yīng)產(chǎn)物合成的條件下將靶標分析物 接觸至少一個探針區(qū)容器的內(nèi)容物或其一部分以及反應(yīng)混合物容器的內(nèi)容物或其一部分 的說明。
[0023] 在一個實施方案中，試劑盒進一步包含：用于進行至少Μ個循環(huán)的說明，其中所述 進行包括：（1)雜交步驟(如果尾區(qū)沒有共價連接至探針區(qū)），其包括將結(jié)合的探針區(qū)接觸尾 區(qū)，其中每個尾區(qū)特異性地結(jié)合探針區(qū)的接頭區(qū)；（2)合成步驟，該合成步驟包括在導(dǎo)致使 用尾區(qū)作為模板的多核苷酸鏈合成的條件下將結(jié)合的尾區(qū)接觸包含試劑的反應(yīng)混合物;和 (3)剝離步驟，該剝離步驟包括將尾區(qū)或探針區(qū)從Ν種不同的靶標分析物剝離;用于在至少Μ 個循環(huán)的每個循環(huán)的過程中檢測來自基質(zhì)的空間上單獨的區(qū)域的多個輸出信號的說明；和 用于從多個信號針對Ν種不同的靶標分析物中的一種或多種確定每個循環(huán)的至少Κ位信息 的說明，其中將至少Κ位信息用于確定總的L位的信息，其中Κ X M = L位的信息，且L 2 1 og2 (N)，并且其中將L位的信息用于鑒別N種不同靶標分析物中的一種或多種的存在或不存在。 [0024]在一個實施方案中，L>log2(N)。在另一個實施方案中，說明進一步包括使用L位的 信息確定N種不同靶標分析物中每一種的鑒別，其中L包括用于靶標鑒別的信息位。在單獨 的實施方案