一種用NsiI鑒定人乳腺癌BRCA1基因rs8176318多態(tài)性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種用化i I鑒定人乳腺癌BRCAl基因rs8176318多 態(tài)性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核巧酸多態(tài)性（single nucleotide polymor曲ism,SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個(gè)核巧酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，包括剪輯的置換/插入和缺失等形式。 SNP是人類可遺傳的變異中最常見的一種，現(xiàn)已廣泛用于簡(jiǎn)單和復(fù)雜疾病的遺傳連鎖分析/ 關(guān)聯(lián)分析及疾病易感基因的定位，指導(dǎo)易感基因克隆.較常見的單堿基多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè) 方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)，S引物等位基因擴(kuò)增 法(TP-PCR)和測(cè)序等方法。運(yùn)些方法雖各有優(yōu)點(diǎn)，但也各有其不足之處。
[0003] PCR-RFLP是一種快速，簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確的檢測(cè)SNP基因型的經(jīng)典方法。其原理是:限制性 內(nèi)切酶是一類識(shí)別DNA特異位點(diǎn)(通常4-6bp)，并在特異位點(diǎn)進(jìn)行切割的酶類。酶切位點(diǎn)的 特異性意味著對(duì)特定等位基因的完全消化會(huì)產(chǎn)生同樣的片段序列。而堿基的置換，插入和 缺失可W產(chǎn)生或消除一個(gè)特定酶切位點(diǎn)，從而改變酶切后產(chǎn)生片段的大小和數(shù)目。運(yùn)些酶 切片段帶型的不同稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。如果SNP產(chǎn)生和消除了某個(gè)限制性內(nèi)切酶 位點(diǎn)，則可W通過對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切、電泳加W檢測(cè)。改方法的優(yōu)點(diǎn)在于快速簡(jiǎn)單，終點(diǎn)判 斷準(zhǔn)確。但其主要缺點(diǎn)在于酶切位點(diǎn)的選擇，要求待測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)和某一酶切位點(diǎn)相關(guān)。 PCR-RFLP酶的選擇具有局限性，并不是所有的SNP位點(diǎn)都可W用運(yùn)種方法來(lái)鑒別，且部分內(nèi) 切酶價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)成本高。S引物等位基因擴(kuò)增法(TP-PCR)-種不需要限制性內(nèi)切酶和 連接酶的重組DNA方法。反應(yīng)體系中有巧中模板和巧中引物，從而在同一個(gè)反應(yīng)體系中產(chǎn)生一 個(gè)重組DNA分子。運(yùn)種方法的主要優(yōu)點(diǎn)是快速，不依賴連接片段的限制酶位點(diǎn)。但其缺點(diǎn)是 擴(kuò)增效率低，擴(kuò)增特異性差，無(wú)法保證PCR產(chǎn)物的特異性和穩(wěn)定性，分型結(jié)果易造成誤判。 化qman巧光探針法是一種新型高效準(zhǔn)確的基因分型方法，其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度高，分型準(zhǔn) 確。但該方法需要昂貴的儀器和較長(zhǎng)的步驟，成本較高。
[0004] 乳腺癌1號(hào)基因（breast cancer 1 ,BRCAl)位于人類染色體17q2UBRCAl編碼一種 核蛋白，在維持基因組穩(wěn)定性中起作用。其編碼的蛋白質(zhì)與其他腫瘤抑制基因、DNA損傷傳 感器及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)形成一個(gè)大的多亞基蛋白復(fù)合物稱為BRCAl相關(guān)的基因組監(jiān)控復(fù)合體 (BASC)。該基因產(chǎn)物與RNA聚合酶II關(guān)系密切，并通過C端結(jié)構(gòu)域，與組蛋白去乙酷化酶復(fù)合 物的相互作用。BRCAl蛋白因此在轉(zhuǎn)錄、雙鏈斷裂的核酸修復(fù)和重組中發(fā)揮了重要作用。另 外有發(fā)明表明，BRCAl和BRCA2是兩個(gè)最重要的乳腺癌抑癌基因，若其發(fā)生基因突變將導(dǎo)致 DNA損傷修復(fù)能力降低，突變長(zhǎng)期積累為細(xì)胞發(fā)生癌變、腫瘤發(fā)生和發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。目前 BRCAl已經(jīng)被證實(shí)是乳腺癌遺傳易感基因，與家族性乳腺癌密切相關(guān)，其基因突變可W常染 色體顯性遺傳方式傳遞給子代。BRCAl基因突變的攜帶者一生中患乳腺癌，卵巢癌危險(xiǎn)顯著 增加，到70歲時(shí)發(fā)生乳腺癌的預(yù)測(cè)累積風(fēng)險(xiǎn)可達(dá)到大約80%，同時(shí)容易早年發(fā)病。
[0005] BRCAl基因rs8176318位點(diǎn)多態(tài)性在人群中存在S種基因型：GG型（人基因組 rs8176318多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基均為G)，GT型（人基因組rs8176318多態(tài)位點(diǎn)的兩 個(gè)等位基因堿基分別為G和T)和TT型（人基因組rs8176318多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基均 為T)(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生發(fā)明院國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書館生物信息技術(shù)中屯、，http:// www.ncbi.nlm.nih.gov)。
[0006] 目前人BRCAl基因多態(tài)rs8176318的鑒定常采用PCR-RFLP方法。但是目前鑒定人 BRCAl基因多態(tài)rs817631別寸常使用的限制性內(nèi)切酶價(jià)格昂貴(關(guān)于部分內(nèi)切酶的參考價(jià)格 可參考后面的表1)，實(shí)驗(yàn)成本高，難W在實(shí)驗(yàn)室中普及使用。
[0007] 因此，本領(lǐng)域存在對(duì)操作簡(jiǎn)單，成本低，使用范圍廣的新型檢測(cè)SNP方法的需求。本 領(lǐng)域迫切需要在節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本的前提下，通過PCR-RFLP技術(shù)的改進(jìn)，來(lái)開發(fā)經(jīng)濟(jì)、快速的檢 測(cè)人BRCAlrs8176318基因多態(tài)性的試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種用NsiI鑒定人乳腺癌BRCAl基 因rs8176318多態(tài)性的方法，該方法是改進(jìn)傳統(tǒng)的PCR-RFLP技術(shù)，通過創(chuàng)造酶切位點(diǎn)法 (Created Restriction Site PCR，CRS-PCR)，應(yīng)用引物3'端錯(cuò)配技術(shù)，在PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切 電泳后進(jìn)行基因型的鑒定，從而提供一種操作簡(jiǎn)單、成本低、適用范圍廣泛的檢測(cè)人 BRCAlrs8176318多態(tài)性的方法及檢測(cè)試劑盒。
[0009] 其技術(shù)方案如下：
[0010] 一種用化il鑒定人乳腺癌BRCAl基因rs8176318多態(tài)性的方法，包括W下步驟：
[0011] (a)抽提樣品的基因組DNA;
[0012] (b)提供擴(kuò)增人BRCAl基因多態(tài)性rs8176318位點(diǎn)附近序列的正向引物和反向引 物，W所述待測(cè)人基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲取擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0013] (C)使用限制性內(nèi)切酶對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，獲取相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；
[0014] (d)將酶切產(chǎn)物采用3 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，W判定BRCAl基因多態(tài)性 rs8176318位點(diǎn)的各基因型；
[0015] 其中，所述反向引物其3'末端倒數(shù)第一位堿基與多態(tài)rs8176318堿基相鄰一個(gè)堿 基，倒數(shù)第S位堿基為錯(cuò)配堿基T，在擴(kuò)增產(chǎn)物中與多態(tài)T等位基因形成ATGCAT結(jié)構(gòu)，第二個(gè) 堿基T為多態(tài)等位基因，第六個(gè)堿基T為錯(cuò)配堿基。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[0017] 本發(fā)明針對(duì)使用CRS-PCR鑒定BRCAlrs8176318多態(tài)性，對(duì)傳統(tǒng)PCR-R化P法進(jìn)行改 進(jìn)，應(yīng)用了引物3'端錯(cuò)配技術(shù)，克服了傳統(tǒng)PCR-RFLP法內(nèi)切酶選擇余地小，價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn) 成本高等缺點(diǎn)，本發(fā)明建立的BRCAlrs8176318多態(tài)性的檢測(cè)方法，內(nèi)切酶價(jià)格十分便宜，同 時(shí)PCR產(chǎn)物純度較高，酶切結(jié)果易于分辨。該檢測(cè)方法通過測(cè)序驗(yàn)證，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1是BRCAlrs8176318位點(diǎn)的電泳圖譜；
[0019] 圖2是服CAlrs8176318位點(diǎn)GG基因型測(cè)序圖譜；
[0020] 圖3是BRCAlrs8176318位點(diǎn)GT基因型測(cè)序圖譜；
[0021] 圖4是BRCAlrs8176318位點(diǎn)TT基因型測(cè)序圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0023] 本發(fā)明的方法可W通過引物上的錯(cuò)配堿基將SNP附近的序列改變?yōu)榭杀活A(yù)先確定 的限制性內(nèi)切酶識(shí)別的序列。因此，可W克服傳統(tǒng)的PCR-RFLP方法所存在的需要采用昂貴 內(nèi)切酶的缺陷，進(jìn)而大大降低了檢測(cè)SNP的成本。具體而言：由于在該反向引物序列中倒數(shù) 第S位堿基為錯(cuò)配堿基T(該堿基在人BRCAl基因序列中的相應(yīng)位置為G)，因此錯(cuò)配后PCR產(chǎn) 物中多態(tài)附近序列由AGGCAG或ATGCAG更改為AGGCAT或ATGCAT(其中第二個(gè)堿基G/T多態(tài)位 點(diǎn)，第六個(gè)堿基T為錯(cuò)配堿基）。因此擴(kuò)增產(chǎn)物中T等位基因片段可被識(shí)別ATGCAT序列的限 制性內(nèi)切酶識(shí)別（即T等位基因片段可被內(nèi)切酶切開）；進(jìn)而，可W根據(jù)片段切開情況來(lái)判斷 多態(tài)基因型。更具體地，經(jīng)序列分析可知，基因原始序列中G/T多態(tài)可由表1中前兩種內(nèi)切酶 識(shí)別。如通過堿基錯(cuò)配PC時(shí)尋多態(tài)性位點(diǎn)后面第四位堿基G改變?yōu)門，則該多態(tài)為T等位基因 經(jīng)PCR擴(kuò)增后包含ATGCAT序列可被識(shí)另ijATGCAT序列的限制性內(nèi)切酶化i I識(shí)別，而G等位基因 不能切開。
[0024] 經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)該G/T多態(tài)的方法可使用表一中的S種酶，其中表中前兩種 酶價(jià)格昂貴，且酶切效果不理想。在采用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)法（Created Restriction Site PCR，CRS-PCR)對(duì)反向引物序列中倒數(shù)第S位堿基錯(cuò)配為T后，PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列生成 ATGCAT序列，從而可被限制性內(nèi)切酶化i I識(shí)別。由于識(shí)別特定位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶化il適 用范圍廣，價(jià)錢較為經(jīng)濟(jì)，進(jìn)而大大降低了檢測(cè)SNP的成本。因此，綜合考慮簡(jiǎn)單操作性與經(jīng) 濟(jì)實(shí)用性，限制性內(nèi)切酶化i I是不二選擇。
[0025] 表1中提供的限制性內(nèi)切酶的價(jià)格從肥B公司化ttp: //Ww.neb-china. com)，限制 性內(nèi)切酶的選擇從WatCut限制性內(nèi)切酶分析軟件上獲取化ttp: //watcut. water Ioo. Ca/ template.php?act = 3噸_116?〇，W此作為限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)和價(jià)格的參考。
[0026] 表1幾種限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列及其價(jià)格
[0027]
[0028] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，正向引物和反向引物的設(shè)計(jì)采用Primers.0軟件進(jìn)行，設(shè) 計(jì)的原則綜合考慮引物對(duì)PCR擴(kuò)增的靈敏度、特異度W及擴(kuò)增效率的影響。按照堿基互不配 對(duì)的原則設(shè)計(jì)引物，引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間，過長(zhǎng)或短均會(huì)造成特異性差，過長(zhǎng)還 會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74°C，不適于化qDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。引物GC含量在40 %~60 %之 間，Tm值最好接近72°C，GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。堿基要隨機(jī)分布，引物自身 及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)使引物本身復(fù)性。引物5/ 端和中間AG值應(yīng)該相對(duì)較高，而y端AG值較低。擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物 應(yīng)具有特異性，引物設(shè)計(jì)完成W后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行blast檢測(cè)，W確保其與其它基因不具有互 補(bǔ)性。
[0029] 最終正向引物由選自下列的核巧酸序列構(gòu)成:GCTTGAAGTCTCCCTTGGAAATCTG。
[0030] 反向引物由選自下列的核巧酸序列構(gòu)成:TTCCATTGAAGGGTCTGACTCTA