對hpv18 e7蛋白具有結合親和力的多肽及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種對HPV18E7具有結合親和力的多肽及其應用，首次揭示了一種對HPV18的E7蛋白具有結合親和力的多肽；本發(fā)明還提供了該多肽作為藥物或分子靶向試劑的診斷或治療用途。
【專利說明】
對HPV18 E7蛋白具有結合親和力的多肽及其應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物工程領域，具體是一種對HPV18E7(人乳頭瘤病毒18型的E7蛋 白）具有結合親和力的多肽及其應用。
【背景技術】
[0002] 宮頸癌是威脅人類健康和生命的主要疾病，在女性的癌癥發(fā)病率居第二位，僅次 于乳腺癌，在發(fā)展中國家更為多見，近幾年甚至出現(xiàn)年輕化的趨勢。在我國，每年宮頸癌的 新病例大概是13.15萬，占全世界的1/7,宮頸癌的發(fā)病率和死亡率居全球第二位。雖然近60 年來，國內外的學者們進行了大量研究，并且宮頸癌的預防疫苗已經(jīng)上市，但由于多方面因 素的共同存在，目前臨床對于宮頸癌的治療，效果仍不理想。
[0003] 人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)感染是宮頸癌的重要病因。流行病 學研究表明90%以上的宮頸癌與HPV感染相關，尤其是高危型HPV中的HPV16和18型，宮頸鱗 狀細胞癌中，HPV 16型感染陽性占51%以上，而宮頸腺癌中HPV 18型感染陽性占56% APV基 因組約有8 000 bp，結構上由早期轉錄區(qū)（Early transcribed region，E區(qū)）、晚期轉錄區(qū) (Late transcribed region，L區(qū)）和非編碼區(qū)（Non-coding region，URR)組成。E區(qū)有E1、 E2、E4、E5、E6、E7等6個開放讀碼框(Open reading frame，0RF)，它們編碼的蛋白均參與病 毒復制與轉錄的過程，其中E6和E7為腫瘤原性蛋白，E6與P53結合，E7和pRB蛋白結合，誘導 感染細胞發(fā)生轉化，細胞因復制失控而致永生化。
[0004]親和體分子，英文名affibody，是一類親新的親和性配體，其結構由58個氨基酸 組成、相對分子量小，約為6.5 X 103，其功能類似于抗體，可與相應的抗原、受體或配體結 合，但又有著一些抗體所沒有的性質，如相對分子量小，僅為6.5 X 103、折疊速率快、選擇性 和親和力高，以及理化性質穩(wěn)定，可耐受化學修飾等，因此人們稱其為"人工抗體"。 affibody分子所具備的這些獨特性質，使其在各個免疫學領域和生物科學領域中迎來了 廣闊的應用前景，從20世紀80年代首次報道以來，研究者們便對其產(chǎn)生了濃厚的興趣，因 此它的發(fā)展也極為迅速。
[0005] 基于上述說明，本領域仍然亟待研究靶向性治療HPV相關腫瘤疾病的新藥物或新 方法，以改善目前臨床現(xiàn)狀。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術存在的缺點和不足，而提供一種HPV18E7具有 結合親和力的多肽及其應用。
[0007] 本發(fā)明的第一個目的，其技術方案是一種對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結 合親和力的多肽，其特征在于:該多肽是以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作為骨架，進 行12-20個氨基酸變異后獲得的多肽。
[0008] 進一步設置是相對于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，該多肽在第9-11，13_ 14，17-18，24-25，27-28，32，35，43 位上發(fā)生氨基酸突變。
[0009] 進一步設置是相對于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，該多肽的： 第9位氨基酸突變?yōu)镻、F或A; 第10位氨基酸突變?yōu)镕、L或V; 第11位氨基酸突變?yōu)镃、L或R; 第13位氨基酸突變?yōu)镽、M或S; 第14位氨基酸突變?yōu)镼、V或G; 第17位氨基酸突變?yōu)镾、F或A; 第18位氨基酸突變?yōu)镻、W或V; 第24位氨基酸突變?yōu)镠、E或P; 第25位氨基酸突變?yōu)镠或E; 第27位氨基酸突變?yōu)镋、A或D; 第28位氨基酸突變?yōu)镻、E或L; 第32位氨基酸突變?yōu)镚、R或P; 第35位氨基酸突變?yōu)镻、H、Q或V; 第43位氨基酸突變?yōu)镋、D或K。
[0010] 進一步設置是該多肽與人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白相互作用的KD值為IX 1(T6M 至3X10-7M〇
[0011] 本發(fā)明的第二個目的，提供一種靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分子，所述的靶 向性分子包括前文所述的任一多肽，以及與該多肽相連接(或偶聯(lián)）的偶聯(lián)物，所述的偶聯(lián) 物包括:半胱氨酸殘基，多肽標簽，抑制人乳頭瘤病毒18型的藥物，或可檢測標記物(如熒 光標記，酶，生物素或放射性同位素）。
[0012] 本設置中，所述的偶聯(lián)物與所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結合親和 力的多肽構成融合多肽。本設置中，所述的多肽標簽包括但不限于:His標簽(如6XHis)， Myc標簽，GST標簽，F(xiàn)lag標簽，所述酶包括但不限于:堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
[0013] 進一步設置是所述的抑制人乳頭瘤病毒18型的藥物包括:毒素;所述毒素是具 有抑制人乳頭瘤病毒18型病毒感染或抑制腫瘤作用的毒素，如白喉毒素、蓖麻毒素、綠膿 桿菌外毒素或所述毒素的功能性片段;且所述的腫瘤是人乳頭瘤病毒18型陽性的腫瘤。
[0014] 本設置中，所述的毒素是綠膿桿菌外毒素A，或所述毒素的功能性片段是綠膿桿菌 外毒素A的活性片段PE38KDEL。較佳地，該綠膿桿菌外毒素A或其功能性片段連接于所述 的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結合親和力的多肽的羧基末端(C末端）。本設置中， 所述的偶聯(lián)物與所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結合親和力的多肽以柔性肽 連接，所述柔性肽包括(但不限于）：（Gly4Se r)3。
[0015] 本發(fā)明的第三個目的，提供一種分離的多核苷酸，其編碼前文任一所述的對人乳 頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結合親和力的多肽。
[0016] 本發(fā)明的第四個目的，提供一種多核苷酸，其編碼前文所述的靶向人乳頭瘤病毒 18型的靶向性分子，且其中所述的偶聯(lián)物是肽。
[0017] 本發(fā)明的第五個目的，提供一種重組載體，該載體包含前文所述的多核苷酸。
[0018] 本發(fā)明的第六個目的，提供一種宿主細胞，該宿主細胞包含前文所述的重組載體， 或其包含有或基因組中整合有前文所述的多核苷酸。
[0019] 本發(fā)明的第七個目的，提供一種制備前文所述的任一對人乳頭瘤病毒18型的 E7蛋白具有結合親和力的多肽的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 培養(yǎng)前文所述的細胞，從而表達前文所述任一的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白 具有結合親和力的多肽； (2) 分離純化(1)獲得的多肽。
[0020] 本發(fā)明的第八個目的，提供一種前文所述的任一對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白 具有結合親和力的多肽或所述的靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分子的用途，用于制備 治療人乳頭瘤病毒18型感染疾病或人乳頭瘤病毒18型表達陽性腫瘤的藥物;或用于制備 檢測人乳頭瘤病毒18型病毒感染的檢測試劑;或用于制備診斷人乳頭瘤病毒18型感染疾 病或人乳頭瘤病毒18型表達陽性腫瘤的診斷試劑。
[0021 ]本發(fā)明的第九個目的，提供一種藥物組合物，其包括前文所述的對人乳頭瘤病毒 18型的E7蛋白具有結合親和力的多肽或權利要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒18型 的靶向性分子;和藥學上可接受的載體。
[0022]本發(fā)明的第十個目的，提供一種用于診斷或治療人乳頭瘤病毒18型感染疾病或 人乳頭瘤病毒18型表達陽性腫瘤的藥盒，所述的藥盒中包括:前文所述的任一對人乳頭瘤 病毒18型的E7蛋白具有結合親和力的多肽，或前文所述的靶向人乳頭瘤病毒18型的靶 向性分子，或前文所述的藥物組合物。
[0023 ]下面結合說明書附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步介紹。
【附圖說明】
[0024] 圖1重組質粒pET21a( + )/HPV16E7酶切鑒定圖； 圖1中：Ml:lkbDNAmarker; 1: pET21a( + )質粒2: pET21a( + )/HPV18E7; 3: pET21a ( + )/HPV18E7//NdeI+XhoI;4: HPV18E7 DNA片段；M2: DL2000 DNA marker; 圖2 HPV18E7蛋白的SDS-PAGE電泳及 Western Blot分析； 圖2中，M: marker; 1-3?重組質粒pET21a( + )/HPV18E7 分別經(jīng)IPTG誘導9h、6h、3h蛋 白表達;4?重組質粒pET21a( + )/HPV18E7未經(jīng)IPTG誘導蛋白表達;5. E.coli. BL21 (DE3) 菌株。A:SDS_PAGE;B: Western Blotting分析（一抗為小鼠抗6 X His單克隆抗體（1: 5000))； 圖3 Elisa檢測三級庫單克隆的親和性的數(shù)據(jù)圖； 圖4選擇進行研究的3個克隆氨基酸序列； 圖5A pET21a( + )/Z hpvi8 E7的重組質粒構建示意圖； 圖5B重組質粒pET21a( + )/Z hpvi8E7酶切鑒定圖； 圖5B中，Ml: DL2000 DNA marker; 1: Z HPV18 E7 DNA片段2: pET21a( + )/Z hpvi8E7/ Ndel+EcoRI; 3: pET21a( + )/ZHpvi8E7重組質粒；4: pET21a( + )質粒；M2:. lkbDNA marker； 圖6A重組蛋白pET21a( + )/Z hpvi8E7的表達； 圖6A中，M: marker; 1. E.coli. BL21 (DE3)菌株；2?重組質粒pET21a( + )/Z HPV18E7誘導前；3. pET21a( + )/Z HPV18E7:228重組蛋白；4. pET21a( + )/Z HPV18E7:242重組蛋白；5 .pET21a( + )/ZHPvi8E7:3i。重組蛋白；6. SPAZ蛋白； 圖6B重組蛋白pET21a( + )/Z hpvi8E7的純化圖； 圖6B中，M: marker;;l.純化后pET21a( + )/Z hpvi8E7:228蛋白；2.純化后pET21a( + )/Z HPV18E7:242蛋白；3.純化后pET21a( + )/Z HPV18E7:310蛋白；4.純化后Zwt蛋白； 圖7 Z Hm8E7與HPV18 E7親和力的表面等離子共振鑒定； 圖7A:不同濃度Z HPV18E7:228獲得的傳感；圖7B:不同濃度Z HPV18E7:242獲得的傳感；圖 7C:不同濃度 Z HPV18E7:31Q 獲得的傳感；圖 7D: Z HPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:31Q 及其 SPA-Z對照蛋白與HPV18 E7結合的表面等離子共振比較； 圖8 Z HPV18E7與HPV18 E7天然蛋白親和力的細胞免疫熒光方法鑒定(共聚焦激光顯微 鏡 X400); 圖8A:Z HPV18E7:228蛋白的間接細胞免疫焚光檢測；圖8B:Z HPV18E7:242蛋白的間接細胞 免疫熒光檢測；圖8C: Z Hm8E7:31Q蛋白的間接細胞免疫熒光檢測； 圖9 HeLa細胞各數(shù)量組接種裸鼠移植瘤生長曲線； 圖10 HeLa細胞裸鼠皮下移植瘤組織HE染色切片觀察（X 400); A:4xl07/ ml HeLa細胞組；B:lxl07/ ml HeLa細胞組；C:lxl06/ ml HeLa細胞組； 圖11正常裸鼠注射dy_ZHPV18 E7:228后生物近紅外信號分布圖 A:正常裸鼠注射dy-ZHPV18E7:228后各時間段的生物近紅外信號成像圖；B:正常裸鼠注 射dy-ZHPV18 E7:228后各時間段的腎臟與正常組織近紅外信號強度的比值圖。
[0025] 圖 12 HeLa荷瘤鼠注射dylight標記的ZHPV18 E7:228，ZHPV18 E7:31Q，ZhPV18 E7:242，ZWT后生 物焚光分布圖； 圖13 HeLa荷瘤鼠注射dylight標記的ZHPV18E7 affibody后腫瘤和腎臟的生物分布曲 線。A，B，C，D分別為HeLa荷瘤鼠注射Dy755-Z HPV18 E7： 228 ； Dy755~Z HPV18 E7： 310 ； Dy755~Z HPV18 E7:224;Dy755_Zwt后各時間段腫瘤、左腎和右腎與正常組織的焚光強度比值。E為各時間 段HeLa荷瘤鼠注射Dy755-z HPV18 E7：228 ；Dy755-Z HPV18 E7： 310 ； Dy755~Z HPV18 E7：224 ；Dy755-Zwt 后各時間段腫瘤與正常組織的熒光強度比值。
[0026] 圖 14 pET21a( + )/Z HPV18 E7/PE38KDEL的重組質粒構建示意圖； 圖15重組質粒pET21a( + )/Z HPV18E7/PE38KDEL酶切鑒定圖； 圖 15中，Ml: DLlOOOOBp Marker; 1: pET21a( + ) / Z hpvi8E7:228/PE38KDEL質粒2: pET21a( + )/228/PE38KDEL質粒；3: pET21a( + )/ZHPvi8E7:228/PE38KDEL/NdeI+EcoRI;4: Z hpvi8E7:228 DNA片段；M2:DL2000 DNA marker; 圖 16 Zhpvis E7 affitoxin蛋白SDS-PAGE電泳和WB鑒定。
[0027] 圖 16A中，M: marker; 1. E.coli. BL21 (DE3)菌株；2?重組質粒pET21a( + )/Z hpvi8E7:228/PE38KDEL誘導前；3?重組質粒pET21a( + )/ Z hpvi8E7:228/PE38KDEL誘導后；4. pET21a( + )/Z hpvi8E7:3iq/PE38KDEL誘導后；圖 16B 重組蛋白ZHpvi8E7affitoxin的純化 M: marker; 1 ?純化后affitoxin 228蛋白；2.純化后affitoxin 310蛋白；圖 16C, -抗為his-tag鼠單克隆抗體：1?純化后affitoxin 228蛋白；2.純化后affitoxin 310蛋白； 圖 17 affitoxin 228, (A)和affitoxin 310 (B)對HeLa細胞的IC50分析； 圖18不同濃度affitoxin 228, (A)和affitoxin 310 (B)蛋白對HeLa細胞的生長抑 制作用； 圖19 Zhpvi8E7 affitoxin對HeLa細胞荷瘤裸鼠的抑瘤作用效應； 圖19中，三組裸鼠在接種HeLa細胞后，待腫瘤長至100~200 mm3大小時，尾靜脈注射 5mg/kg affitoxin228蛋白或affitoxin 310蛋白及0.2 ml PBS，每隔3天注射一次，共6次， 圖中箭頭所示； 圖20 ZHPV18 E7 affitoxin對HeLa細胞荷瘤裸鼠的抑瘤作用； 圖20中，A為45天后處死各組裸鼠所剝離的腫瘤組織;B為各組所剝離腫瘤組織的平均 重量。
【具體實施方式】
[0028]下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不 能理解為對本發(fā)明保護范圍的限定，該領域的技術工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內容對本發(fā)明 作出一些非本質的改進和調整。
[0029]如本文所用，所述的"對HPV18 E7具有結合親和力的多肽"是指以葡萄球菌A蛋白 Z段的氨基酸序列作為骨架，進行12-20個氨基酸變異后獲得的多肽，且該多肽能夠特異 性結合HPV18 E7、具有極少或沒有非特異性結合。
[0030]如本文所用，所述的"本發(fā)明的多肽"、"對HPV18 E7具有結合親和力的多肽"、 "HPV18E7 結合多肽"、"Zhpvi8E7 affibody 多肽"、"Zhpvi8E7 afTibody"、"ZHPVi8E7''、"afTibody 蛋白"、"affibody重組蛋白"、"Zhpvis E7重組蛋白"可以互換使用；SPAZ與Zwt可以互換使 用。
[0031]如本文所用，所述的"靶向性分子"是指將本發(fā)明的對HPV18 E7具有結合親和力 的多肽與其它功能性偶聯(lián)物連接后獲得的、可以靶向HPV18E7的分子。所述的偶聯(lián)物可以 是半胱氨酸殘基，多肽標簽，抑制人乳頭瘤病毒18型的藥物，酶或可檢測標記物等。
[0032]如本文所用，所述的"融合多肽"是所述的"靶向性分子"的下位概念，是指本發(fā)明 的對HPV18 E7具有結合親和力的多肽與其它功能性肽(例如毒素蛋白或功能性蛋白片段） 連接后獲得的、可以靶向HPV18 E7的分子。
[0033]本發(fā)明人選擇HPV18 E7作為靶抗原。本發(fā)明人以葡萄球菌A蛋白的Z結構域 (Zwt，SEQ ID NO: 1)作為支架，將其表面氨基酸殘基模擬抗體結合位點進行隨機突變，通 過噬菌體展示技術構建突變文庫，以HPV18 E7作為靶抗原對該文庫進行親和篩選，經(jīng)過大 量的篩選工作，最終獲得了對于HPV18 E7具有高度親和力的多肽。
[0034]本發(fā)明的多肽是以葡萄球菌A蛋白Z結構域的氨基酸序列作為骨架，進行14-20個 (較佳地為14個)氨基酸變異后獲得的多肽。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明的多肽相對于 葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列（SEQ ID N0: 1)，在第9-11，13-14，17-18,24-25,27_ 28,32,35,43位上發(fā)生氨基酸突變。更優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽具有SEQ ID NO: 1-4任一所 示的氨基酸序列，如表1所示。
[0035]本發(fā)明還涵蓋了在所述HPV18 E7結合多肽的氨基酸序列任一末端或兩端加入額 外的氨基酸殘基而形成的多肽。這些額外的氨基酸殘基可以在多肽結合HPV18 E7時起作 用，但是也可同樣用于其它目的，如涉及該多肽的生產(chǎn)、純化、穩(wěn)定、偶聯(lián)或檢測的一種或幾 種。這些額外的氨基酸殘基可以包括一或多種為了化學偶聯(lián)目的而添加的氨基酸殘基。如 在多肽鏈的第一位或最后一位添加，即在N或C末端添加一個半胱氨酸殘基等。這種額外 的氨基酸殘基也可以包括用于多肽純化或檢測的一個"標記"，如與標記抗體相互作用的六 組氨酸肽(His6)標記，或"myc"標記或"flag"標記。此外，其它本領域技術人員熟知的替代 方式也包含在本發(fā)明中。
[0036]所述"額外的氨基酸殘基"也可構成具有預期功能的一個或多個多肽結構域，如與 第一個、HPV18E7結合結構域相同的結合功能，或者其它結合功能，或是一種酶促功能，或 是一種熒光功能，或是其組合。
[0037]本發(fā)明也包含在所述的HPV18 E7結合多肽基礎上，經(jīng)修飾進而增加其在堿性條 件下的穩(wěn)定性的多肽。這種穩(wěn)定性包括用對于堿性條件較不敏感的氨基酸殘基定點取代在 沒有修飾的序列中出現(xiàn)的任何天冬酞胺殘基。由于在不同的反應之間親和層析柱要經(jīng)受頻 繁的強堿處理以進行洗脫，這種對堿降低敏感性的特性，有利于使用本發(fā)明的多肽作為親 和層析中的親和配體，能夠延長親和層析基質的使用壽命。
[0038]本發(fā)明也包含在本發(fā)明的HPV18 E7結合多肽基礎上，進行其它修飾后獲得的多 肽。這些修飾(通常不改變一級結構）形式包括:體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰 化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行 糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物 的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷酸酪氨 酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸）的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化 了溶解性能的多肽。
[0039]本發(fā)明的HPV18 E7結合多肽可以與偶聯(lián)物連接，從而構成功能性的靶向性分子， 這種連接可通過化學鍵(包括肽鍵)相連或吸附;所述的化學鍵是共價鍵或非共價鍵。作為 一種優(yōu)選方式，通過肽鍵連接，從而形成融合多肽。所述的HPV18 E7結合多肽與偶聯(lián)物之 間可以直接相連接，或者通過多肽連接子(連接肽)連接。所述的連接子例如包括1-30個氨 基酸;較佳地為1-20個氨基酸。連接肽的設置基本上不影響融合蛋白中各多肽的活性。較 佳地，可以利用柔性肽(Gly4Ser)3進行連接。其它本領域技術人員熟知的連接肽也可應用 于本發(fā)明。
[0040] 在"異源"融合多肽中，所述HPV18 E7結合多肽構成了第一個結構域或第一個部 分，第二和其它部分具有除了結合HPV18 E7外的其它功能，這些可預期的結果也在本發(fā)明 的范圍內。該融合多肽的第二和其它部分可能包含對除了HPV18 E7外的其它靶分子具有 親和力的結合結構域。這種結合結構域也可能與SPA結構域相關，但在1到大約20個位置 具有取代突變。結果是融合多肽有至少一個HPV18 E7結合結構域和至少一個與所述其它 靶分子具有親和力的結構域。這擴展了本發(fā)明的多肽的應用，如作為治療制劑或作為捕獲、 檢測或分離試劑。
[0041] 本發(fā)明融合多肽第二和其它部分的其它選擇包括用于治療性應用的一或多種部 分。在治療性應用中，其它分子也可以通過其它方法共價或非共價偶聯(lián)到本發(fā)明的多肽上。 作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，將改造的銅綠假單胞菌外毒素PE38KDEL通過柔性肽連接于 HPV18 E7結合多肽的C-末端，構成融合蛋白。非限制性例子包括用本發(fā)明多肽引導效應酶 (例如羧肽酶）而進行"ADEPT〃（抗體介導的酶前藥治療，anti body-directed enzyme prodrug therapy)的酶;包括用以募集免疫系統(tǒng)的效應細胞和其它組分的蛋白質；包括細 胞因子，如11^-2、1?1^、11-12、了陬€[、1?10 ;包括促凝血因子，如組織因子、￥011啊11613抑11(1 因子；包括毒素，如蓖麻毒蛋白A、calcheamicin、美登木素生物堿；包括毒性小分子，如 auristatin類似物、阿霉素等。同時，為了更方便摻入放射性核素(如68Ga、76Br、 mIn、99Tc 、124I、125I)用于診斷或放射性核素(如9()Y、131I、 211At)用于治療，可以考慮上述列舉的額外的 氨基酸(特別是六組胺酸標記和半胱氨酸），其目的是將放射性同位素的鰲合劑偶聯(lián)到多肽 序列。
[0042]本發(fā)明還涵蓋了在所述的HPV18 E7結合多肽上連接一個可檢測標記物（如熒光 標記，生物素或放射性同位素），從而可基于本發(fā)明的多肽的特異性，實現(xiàn)檢測HPV18感染或 HPV18感染相關疾病的目的。
[0043] "HPV18 E7結合親和力"是指可以例如通過利用表面等離子共振 (surfaceplasmon resonance)技術如Biocore?裝置進行檢測的一種多肽特性。HPV18 E7 結合親和力可以通過一個實驗進行檢測，其中將HPV18 E7固定在該裝置的感應芯片上，然 后將含有待測多肽的樣品通過該芯片?；蛘?，也可以將待檢測的多肽固定在該裝置的感應 芯片上，然后將含有HPV18 E7的樣品通過該芯片。本領域技術人員可以利用所獲得的感應 圖像建立多肽的HPV18 E7結合親和力的至少一種定性測量方法。如果需要定量測量方法， 例如為了建立相互作用間的某個KD值，也可以使用表面等離子共振方法。例如，結合值可 以利用Biocore?2000裝置(Biocore AB)進行測定。HPV18 E7固定于該裝置的感應芯片 上，而親和力待檢測的多肽樣品通過連續(xù)稀釋制備并以隨機順序進行注射。然后可從結果 中計算KD值。在本發(fā)明的實施例中，所述的多肽的KD值達到1X1(T 6M至3X1(T7M。
[0044] 本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的HPV18 E7結合多肽或靶向性分子或融合多肽的分 離的核酸，也可以是其互補鏈。所述核酸可以全序列人工合成，也可用PCR擴增的方法分別 獲得。
[0045] 本發(fā)明還提供了包含編碼所述核酸分子的載體。所述的載體還可包含與所述核酸 分子的序列操作性相連的表達調控序列，以便于所述融合蛋白的表達。如本文所用，"操作 性相連"或"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線 性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制以編碼序列的轉錄，那么它就是可操作 地連于編碼序列。
[0046] 在本發(fā)明中，任何合適的載體都可以使用，比如一些用于細菌、真菌、酵母和哺乳 動物細胞的克隆和表達的載體，如Pouwels等，克隆載體:實驗室手冊中所描述的。
[0047] 此外，含有所述核酸序列的重組細胞也包括在本發(fā)明中。術語"宿主細胞"包括原 核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞包括大腸桿菌、枯草桿菌等;例如可為大腸桿菌細 胞(E. co 1 i)，如大腸桿菌HMS174 (DE3)、或BL21 (DE3)。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、 昆蟲細胞和哺乳動物細胞。
[0048]生產(chǎn)本發(fā)明的HPV18 E7結合多肽或靶向性分子或融合多肽的方法也已包括在本 發(fā)明中。所述方法包括培養(yǎng)含有相應多肽的編碼核酸的重組細胞，獲得產(chǎn)物多肽?？蓪⑸鲜?制備獲得的多肽純化為基本均一的性質，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。
[0049] 基于要表達多肽的信息和目前重組表達蛋白質的技術水平，結合本發(fā)明揭示的內 容，本領域技術人員易于制備本發(fā)明的多肽。例如，表達未被修飾的Z結構域的質?？梢杂?作起始材料。使用已知技術，所需的取代突變可以被引入這個質粒中以獲得本發(fā)明的表達 載體。
[0050] 當使用化學多肽合成方法制備本發(fā)明的多肽或靶向性分子或融合蛋白時，上述多 肽中的任何天然產(chǎn)生的氨基酸殘基都可以被任何相應的、非天然產(chǎn)生的氨基酸殘基或其衍 生物所取代，只要產(chǎn)物多肽的功能基本不被損害。
[0051]本發(fā)明還涉及所述的HPV18 E7結合多肽或靶向性分子或融合多肽在不同方面的 應用，包括應用于治療、診斷和/或檢測。
[0052]本發(fā)明的HPV18 E7結合多肽可作為HPV18 E7抗體在不同應用中的一種替代物。 [0053]作為非限制性的實例，其可用于治療特征以HPV18 E7表達或HPV18感染為特征 的疾病，例如腫瘤(如宮頸癌，頭頸部腫瘤)等。通過結合胞內HPV18 E7以抑制細胞信號傳 導，用于相關疾病的體內和體外診斷。本發(fā)明的多肽可作為一種檢測試劑、一種捕獲試劑或 者分離試劑，而且還可直接用作為一種治療制劑或者將其它治療制劑靶向HPV18 E7蛋白 的手段。體外使用本發(fā)明的多肽的方法可以不同方式進行，如微量滴定板、蛋白陣列、生物 傳感器表面和組織切片等等。為了使本發(fā)明多肽適用于特異的用途，在不偏離本發(fā)明的范 圍的情況下，可以對本發(fā)明的多肽進行修飾和/或添加。
[0054]在下面詳細描述了這些修飾和添加，其可能包括在同一多肽鏈中包含的額外的氨 基酸，或者標記和/或治療制劑，其化學修飾或以其它方式結合本發(fā)明的多肽。另外，本發(fā)明 還涵蓋了保留了結合HPV18 E7能力的該多肽的片段。
[0055]本發(fā)明的HPV18 E7結合多肽可以作為治療制劑，其治療作用基于至少一種以下 機制：（i)加強化療作用，施用本發(fā)明的多肽與目前和將來的化療治療協(xié)同作用。阻斷胞內 的HPV18 E7蛋白對抑癌基因pRb的破壞作用；（ii)抑制腫瘤細胞的增殖?？赡茉诩毎麅?存在以下機制：當結合多肽進入細胞內部與HPV18 E7蛋白結合時，阻斷了HPV18 E7與pRb 的結合，從而阻斷了細胞生長增殖信號。
[0056]本發(fā)明多肽的HPV18 E7結合特性以及用該多肽生產(chǎn)靶向性分子(包括融合蛋白） 和/或標記的結合分子的穩(wěn)定性意味著該多肽也可以用于將其它活性物質靶向腫瘤部位， 這些腫瘤包括表達HPV18 E7的細胞。因此，本發(fā)明的另一方面是提供了本文所述的HPV18 E7結合多肽與一種具有抗癌活性的物質偶聯(lián)的應用，以將所述物質運送到表達HPV18 E7 的細胞，產(chǎn)生靶細胞的損傷或凋亡。
[0057]這種抗癌活性的物質可能是通過融合或通過化學鍵偶聯(lián)到HPV18 E7結合多肽上 的蛋白質，如選自用于"ADEPT"（antibody_directed enzyme prodrug therapy)應用的效 應酶；用于募集免疫系統(tǒng)的效應細胞和其它組分的蛋白；細胞因子，如IL_2、IFNy、IL-12、 TNFaa、IP 10等;促凝血因子，如組織因子、von Willebrand因子等;毒素，如蓖麻毒蛋白 A、假單胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物堿等。或者，所述活性物質也可能是細胞 毒性藥物，如auristatin類似物或阿霉素或放射性同位素(如 9()Y、131I、211At等），這種同位 素可與HPV18 E7結合多肽直接結合，或通過一種鰲合劑，如熟知的鰲合劑D0TA或DTPA而 與HPV18 E7結合多肽結合。
[0058]在相關方面，本發(fā)明還提供了一種在體內將具有抗癌活性的物質導向表達 HPV18E7細胞的方法，包括施用給患者本文所述的所述活性物質與與HPV18 E7結合多肽 的偶聯(lián)物。這種偶聯(lián)物在前文已被適當描述。
[0059]本發(fā)明還包括使用所述的與HPV18 E7結合的多肽檢測樣品中的HPV18 E7蛋白。 [0060] 例如，這種檢測可以用來診斷特征為表達HPV18 E7的疾病情況。檢測HPV18 E7 的存在可以在體內也可以在體外進行。體內診斷的優(yōu)選選擇是使用正電子放射X線斷層攝 影術，PET。被檢測的樣品可以例如是生物學液體樣品或組織樣品。現(xiàn)在的普遍方法是用針 對與HPV18 E7的抗體，這種方法可以適用于本發(fā)明的與HPV18 E7結合多肽，這種方法是 組織化學方法檢測與HPV18 E7的存在，用來鑒定新鮮、冷凍或福爾馬林固定、石蠟包埋的 組織樣品中與HPV18 E7蛋白的表達。為了檢測HPV18 E7， 本發(fā)明的多肽也能用作融合蛋白的一部分，其中其它結構域是報告酶或熒光酶?；蛘?， 其也可以是被一個或多個熒光制劑和/或放射性同位素標記的，任選通過鰲合劑標記。合適 的放射性同位素包括68Ga、 76 Br、mIn、99Tc、124I和1251等。
[0061]本發(fā)明還包括將所述的HPV18 E7結合多肽應用于檢測生物學液體樣品中 HPV18E7。這個方法包括以下步驟：（1)提供被檢測患者的生物學液體樣品，（2)將本文所述 的HPV18 E7結合多肽在能使所述多肽與樣品中存在的任何HPV18 E7結合的條件下加入 樣品中，（3)除去非結合的多肽，及(4)檢測結合的多肽。被檢測到的結合的多肽的量與樣品 中存在的HPV18 E7量相關。在步驟(2)中，HPV18 E7結合多肽可以以任何適宜的形式加入 到樣品中，包括例如這樣的情況，當HPV18 E7結合多肽被固定在一種固體支持物上，通過 其使樣品接觸，或HPV18 E7結合多肽存在于溶液中。
[0062]所述的HPV18 E7結合多肽的其它應用還包括:檢測樣品中HPV18 E7的方法，包 括如下步驟：（1)提供一種懷疑含有HPV18 E7的組織樣品，例如冷凍切片或用福爾馬林包 埋的組織切片，（2)在適宜條件下加入本發(fā)明的HPV18 E7結合多肽到所述樣品中，所述條 件為益于所述多肽與樣品中存在的任何HPV18 E7結合，（3)除去未結合的多肽，及(4)檢測 結合的多肽。檢測到的結合的多肽的量與樣品中存在的HPV18 E7的量相關。
[0063]本發(fā)明還提供了一個診斷組織樣品中HPV18 E7表達的試劑盒，包括與報告酶(如 堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶)融合的、本發(fā)明的HPV18 E7結合多肽、檢測酶活性的試劑、 和陽性和陰性對照組織切片。
[0064]本發(fā)明還提供了一個診斷組織樣品中HPV18 E7表達的試劑盒，包括通過抗體檢 測的與標記(如flag標記或myc標記)融合的本發(fā)明的HPV18 E7結合多肽、一個特異于標 記的一抗、特異于一抗并與報告酶偶聯(lián)的二抗、檢測酶活性的試劑，和陽性和陰性對照組織 切片。
[0065]診斷應用的一個領域就是在體內檢測癌細胞或其聚集物。本發(fā)明提供了一個進行 這種診斷的試劑盒，該試劑盒包括標記有一個鰲合物的、本發(fā)明的HPV18 E7結合多肽、一 種診斷用放射性同位素(非限制性的例子是6心、7如、11111!、 991'(3、1241和1251等），以及用于 分析摻入效率的試劑。
[0066]如上所述，本發(fā)明涵蓋了本發(fā)明的HPV18 E7結合多肽將活性物質靶向表達HPV18 E7的細胞如某些類型的癌癥細胞的應用。本發(fā)明還提供了一個用于此目的的試劑盒，該試 劑盒包括用一個鰲合物標記的本發(fā)明的HPV18 E7結合多肽、一個治療性放射性同位素(非 限制性的例子是，、1311、21^)，以及用于分析摻入效率的試劑。
[0067] 本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含:有效量的本發(fā)明所述的對人乳頭瘤病毒 18型的E7蛋白具有結合親和力的多肽或靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分子，和藥學上 可接受的載體。
[0068] 如本文所用，"藥學上可接受的"的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良 副反應(如毒性)的，即具有合理的效益/風險比的物質。術語"藥學上可接受的載體"指用于 治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體:它們本身并不 是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知 的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co.，N.J. 1991)中可找到關于 藥學上可接受的載體的充分說明。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽 水、甘油和山梨醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如潤滑劑、助流劑、潤濕劑 或乳化劑、pH緩沖物質和穩(wěn)定劑，如白蛋白等。
[0069] 可將所述的組合物制成各種適合于哺乳動物給藥的劑型，所述劑型包括但不限 于:注射劑、膠囊劑、片劑、乳劑、栓劑。
[0070] 在使用時，是將安全有效量的本發(fā)明所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有 結合親和力的多肽或靶向性分子施用于哺乳動物(如人），其中該安全有效量通常至少約1 微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約1微 克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因 素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內的。
[0071] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0072] (1) HPV18 E7蛋白的制備：以實驗室保存的pET32a( + )/HPV18 E7重組質粒轉化 E. co 1 i BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導表達后，SDS-PAGE電泳，一明顯蛋白條帶出現(xiàn)在相對分子質 量(Mr)約20kDa的位置，與預期蛋白Mr大小相符（圖5A)。經(jīng)用親和層析柱析純化后，經(jīng)SDS-PAGE分析在Mr20kDa的位置處出現(xiàn)1條較為單一的的蛋白條帶（圖2A)。以小鼠抗6XHis mAb為一抗進行Western blot分析，可見在Mr 20kDa處出現(xiàn)信號反應帶（圖2 B)，說明此條 帶為HPV18 E7蛋白，其純化后條帶較單一。
[0073] (2)利用制備的HPV18 E7蛋白對實驗室保存的噬菌體隨機affibody文庫進行淘 洗：以HPV18 E7蛋白為靶蛋白，用噬菌體隨機affibody文庫進行四輪淘洗;將純化的HPV18 E7蛋白包被96孔酶標板，經(jīng)封閉、加噬菌體文庫（初級庫）孵育、再加入E. coli TG1 37 °C，輕搖溫育；取100yl，用2*YT培養(yǎng)基做梯度倍比稀釋，取稀釋液100yl涂布S0B-AG平 板，30°C過夜，計數(shù)結合噬菌體感染菌落數(shù)，計算HPV18E7結合噬菌體滴度;結果平板可見 菌落，滴度是1X10 2;此時完成第一輪淘洗，另部分菌液加101()輔助噬菌體M13K07(購自北京 寶科維食安生物公司）和卡那霉素培養(yǎng)過夜，離心后取上清經(jīng)〇. 22mi濾膜過濾，獲得HPV18 E7分子親和篩選后的噬菌體文庫，為一級affibody庫。重復上述3輪富集篩選，分別獲得 HPV18 E7分子親和篩選后的噬菌體文庫，為二級，滴度為IX 106;在二級庫的基礎上再重復 上述2輪富集篩選，為三級文庫，滴度為1 X 108，同法獲得四級文庫，滴度為2 X 108。同時設置 不加噬菌體的空白對照作同步篩選。
[0074] (3)篩選與HPV18 E7蛋白特異性結合的高親和性的親和體affibody，標為ZHm8E7: 隨機挑取四輪淘洗后的affibody單克隆，用ELISA、測序等方法選取affibody分子，即 ZHPV18E7;挑取第四輪淘洗后的HPV18E7親和體四級庫的235株單克隆進一步進行Elisa驗證， 根據(jù)0D450值讀數(shù)，選取0D450值讀數(shù)較高的80株克隆，即讀數(shù)高于0.6(0D450>0.6)，送往 測序(如圖3)。經(jīng)過測序鑒定，10個克隆序列完全正確，且翻譯后沒有終止子。從中選取3個 親和力較高的單克隆，它們是228、242、310克隆，進行后續(xù)的研究，這三個單克隆分別標記 為Z HPV18 E7:228、Z HPV18 E7:242、Z HPV18 E7:31Q(氨基酸序列如表1，亦可參見附圖4,核苷酸序列參 見附圖4)。
(4)制備ZHPV18E7蛋白，并鑒定其與HPV18 E7蛋白的親和性： 將篩選得到的affibody陽性克隆ZHPV18E7克隆入載體pET21a( + )，構建成重組質粒 pET2 la ( + )/ZHPV18E7，表達、純化ZHPV18E7蛋白；培養(yǎng)宮頸癌HeLa細胞株，利用細胞免疫熒光和表 面等離子體諧振(SPR)技術鑒定Z HPV18E7蛋白與HPV18 E7蛋白的親和性和特異性;具體為： ①pET21a( + )/Z HPV18 E7的重組質粒構建 以篩選得到的Z HPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:31Q克隆為模板，經(jīng)PCR擴增，利用Ndel 和EcoRI酶切位點作為插入載體位點，克隆入pET21a( + )載體構建重組質粒（圖5A);構建的 pET21a( + )/Z HPV18 E7重組質粒經(jīng)Ndel和EcoRI酶切后，酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中約5400 bp和174 bp處各出現(xiàn)一條單一條帶（圖5B)，和pET21a( + )/Z HPV18 E7的理論大小相符。經(jīng)測 序，用NTI軟件匹配重組質粒序列和理論序列，兩者吻合，說明重組質粒構建成功（圖6)。 [0076] ②pET21a( + )/Z HPV18 E7重組蛋白表達、鑒定及純化 pET21a( + )/Z HPV18 E7重組質粒在E.coli BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導表達后，經(jīng)SDS-PAGE 電泳鑒定，在相對分子質量(Mr)約7kDa的位置，Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7： 242 > Z HPV18 E7： 310§|5 lH 現(xiàn)明顯的蛋白條帶，與本實驗室原先構建的野生型affibody蛋白，SPAZ(Zwt)蛋白，相吻合 (圖7A)。由于重組質粒pET21a( + )/Z HPV18 E7的C端含有pET21a( + )上的His標簽，所以用親和 層析柱析純化后，經(jīng) SDS-PAGE 分析，Z HPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:31Q 蛋白在約 7kDa 的 位置處出現(xiàn)1條較為單一的蛋白條帶，與對照蛋白SPAZ蛋白相一致（圖7B)，說明Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7：242>Z HPV18 E7: 310蛋白成功表達并制備了純化蛋白。
[0077] 本實施例中，本發(fā)明選擇pET21a( + )載體，在設計上利用其多克隆位點的起始酶位 點為Ndel ( CATATG)，其密碼子ATG即為目的蛋白翻譯的氨基酸(M)起始密碼子，這樣利用 原核表達系統(tǒng)表達的蛋白即為全長的目的蛋白Affibody而不帶載體蛋白片段，避免了載體 蛋白對實驗結果的干擾，為后續(xù)試驗打下了良好的基礎。將篩選出的親和體分子Z HPV18E7構 建在pET21a(+)載體上，在原核中表達相應蛋白，利用載體自身的His標簽可以將重組蛋白 通過N i親和層系柱純化方法純化得出較高純度的重組蛋白，經(jīng)S D S - P A G E電泳鑒定， ZhPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:310表達蛋白大小在約7.8 kDa的位置。由于affibody分 子量小，可以穿透0.2WI1的PVDF膜，故無法對其進行Western Blot進一步分析。本實施例采 用下列表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR)和免疫焚光等方法對其在蛋 白水平和細胞水平與靶蛋白的親和特性進行進一步的驗證。
[0078] ③表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR)技術分析和鑒定 將所用的革巴蛋白HPV 18E7和未和體Z HPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:31Q蛋白以及用 作對照的野生型SPAZ(Zwt)蛋白表達、純化、濃縮和復性后備用，調節(jié)蛋白濃度至500ug/ml。 根據(jù)操作手冊，在不同的流動池上通過偶聯(lián)于GLH芯片將HPV18E7重組蛋白固定，進行與篩 選多肽之間的親和力測定。第6個流動池表面被激活和失活以作為注射時的空白對照。將Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7：242>Z HPV18 E7：310> SPAZ蛋白稀釋成不同濃度，依次通過芯片表面。所有的 分析在25°C進行，流速為30yl /min，注射標本的容量為200yl，并以流速30yl /min隨機順 序注射，隨后用HC1(BI0-RAD 貨號:#176-2250 100 mM HC1)洗滌6min(解離），利用ProteOn Manager?軟件(BI0-RAD)的1: 1朗繆爾結合模型分析結合曲線(感應圖）。
[0079] 從圖9可知，Z HPV18 E7:228濃度范圍從0到20nM，最低0.625nM，Z HPV18 E7: 242濃度范圍 從0到40nM，最低1.25nM，Z HPV18 E7:31Q濃度范圍從0到20nM，最低0.625nM。從這些結果可知， 這三個親和體分子均與靶蛋白有結合，然而，Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7： 310 的最低濃度更低，說 明它們和靶蛋白的結合更強。將不同親和體蛋白用解離平衡常數(shù)(KD)進行動力學分析，發(fā) 現(xiàn)在同一蛋白濃度水平時，Z HPV18 E7:228的解離平衡常數(shù)最高，Z HPV18 E7:31Q的解離平衡常數(shù) 次之，Z Hm8E7:242的解離平衡常數(shù)最低，而對照蛋白SPAZ的數(shù)值低于0,說明SPA Z與靶蛋白 HPV 18E7沒有結合。
[0080]由此可知，篩選出的Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7：242>Z HPV18 E7:31Q蛋白均能特異性識別 HPV 18E7蛋白，從蛋白水平驗證了篩選出的三個重組Affibody蛋白與細胞表達的HPV 18E7 具有很強的親和力。
[0081 ]④細胞免疫熒光分析和鑒定 用純化的Z HPV18E7:228、Z HPV18E7:242、Z HPV18E7:31Q蛋白孵育HPV18E7蛋白表達陽性的宮頸 癌HeLa細胞，6小時后，分別用His單克隆抗體、SPA-Z兔血清以分析Z HPV18 E7蛋白與細胞株表 達的HPV 18E7蛋白的識別和結合能力，與此同時設置HPV 18E7蛋白表達陰性但HPV 16E7蛋白 表達陽性的Siha細胞株進行對比。在共聚焦熒光顯微鏡下觀察到，HeLa細胞的細胞核內可 見多個綠色的點狀或團塊狀焚光蛋白，而Siha細胞卻未見明顯的焚光，并且三個Z hpvi8 E7蛋 白在HeLa細胞的細胞核均可見綠色的點狀或團塊狀熒光，如圖8所見。
[0082] 本實施例中HeLa細胞為HPV 18DNA陽性細胞，而Siha則為HPV 18DNA陰性但 HPV16DNA陽性的宮頸癌細胞，在本研究的細胞免疫熒光實驗中，篩選出的三個ZHPV18 E7蛋白 在HeLa細胞中均能檢測出，而Siha細胞中均未檢測出，表明本研究篩選獲得的Z HPV18 E7:228、 Z HPV18 E7：242 >Z HPV18 E7： 31〇特異性識別能力強，均能與HPV18E7發(fā)生特異性結合，但不識別 HPV16E7蛋白。
[0083]由此可知，篩選出的Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7： 242 > Z HPV18 E7:31Q蛋白均能特異性識別細 胞中天然表達的HPV 18E7蛋白，從細胞水平驗證了篩選出的三個重組Affibody蛋白與細胞 表達的HPV 18E7具有特異性結合的親和力。
[0084] [5]在宮頸癌細胞荷瘤裸鼠中的生物分布和腫瘤靶向特性 在本實施例的實驗中，選擇篩選的Z HPV18 E7：228>Z HPV18 E7：242>Z HPV18 E7:31Q蛋白作為檢測 對象，用近紅外熒光染料DyLight755 NHS EsteKThermo Fisher公司，美國，貨號62278)標 記上述蛋白，并將其注射到攜帶宮頸癌HeLa細胞移植腫瘤的小鼠體內，進行Z HPV18E7 af f ibody的生物分布研究，并對裸小鼠成像定位以研究標記蛋白的祀向特性，同時用Zwt蛋 白作對照。
[0085] 具體為： ①宮頸癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立 分別將11106/1111，111〇71111，41107/1111三種不同濃度的宮頸癌拖1^細胞懸液和?83各 0.2ml皮下接種4-5周齡雌性裸鼠，接種后21天左右，實驗組裸鼠接種部位開始出現(xiàn)粟粒大 小結節(jié)，瘤體增長速度與細胞量相關，4xl07/ ml組瘤體增長最快，lxl07/ml組瘤體增長次 之，兩組裸鼠均在接種后第30天結節(jié)直徑增至300mm 3以上，且隨時間推移瘤體逐漸增大，而 lxl06/ml組裸鼠在接種后第30天也出現(xiàn)300mm 3以上的瘤體，但隨著時間推移瘤體沒有顯著 增大，對照組PBS組全程沒有結節(jié)生長（見圖10)。全程觀察期間，裸鼠沒有死亡，精神狀態(tài) 可，反應靈敏，飲食正常。接種HeLa細胞懸液60天后，處死荷瘤鼠，解剖觀察肝、脾、腎、大網(wǎng) 膜、子宮附件等臟器，未見明顯變化，無轉移。將腫瘤組織制成石蠟切片，進行病理學觀察， 使用HE染色，結果顯示各實驗組均見大小形狀不一的細胞、核仁肥大、深染細胞核、胞漿豐 富(見圖11)。
[0086] ② DyLight-755 NHS Ester標記Z hpvi8 E7蛋白的鑒定 按DyLight-755試劑說明書進行操作和鑒定。即將標記后的重組蛋白Dy755- Z HPV18 E7:228用16%聚丙烯酰胺凝膠遮光電泳，切取合適大小的凝膠放于活體成像儀中，激發(fā)光 濾片為671-705nm，發(fā)射光濾片為7501ongpass，采用8bit和2X2模式，用730-950nm波長間 隔10nm每次曝光5000ms收集圖像信息，用Maesro自帶的軟件進行圖像處理及分析。結果重 組蛋白Dy755- Z Hm8E7:228泳道有激發(fā)光，出現(xiàn)單一的熒光條帶，表明重組蛋白Dy755- Z HPV18 〇
[0087] ③Dy755_ Z hpvi8 E7在正常裸鼠體內的生物分布 為分析Dy755- Z即^^在正常裸鼠體內的代謝，用10%水合氯醛腹腔注射誘導麻醉， 待其進入深度麻醉狀態(tài)后經(jīng)尾靜脈注射50yg Dy755- Z HPV18E7:228蛋白，置于小動物活體成 像儀（CRi Maesro 2.10, in-vivo fluorescence imaging system)中成像，并用0.8-1 .On 1/g水合氯醛維持麻醉狀態(tài)，以保證小鼠在成像過程中處于深度麻醉，在5 min、30 min、lh、 2 h、4 h、6 h、8 h和24h連續(xù)成像觀察。結果可見雙側腎臟出現(xiàn)了最大的熒光信號，將其與 腿部肌肉處的熒光信號比值進行分析，即腎臟/正常組織率(K/N ratio=[腎臟R0I的背景 信號/正常R0I的組織(肌肉）背景信號]X100%}。結果表明，Dy755- Z HPV18E7:228主要分 布于腎臟，在注射后腎臟的熒光信號逐漸增強，并于2-4小時達到高峰，此后逐漸減弱，并于 72小時焚光信號完全消失。表明，Dy755- Z hpvi8 E7的蛋白主要分布于正常裸鼠的腎臟，即經(jīng) 腎臟排泄，并于72小時內完全排泄（圖13A，B)。
[0088] ④Dy755_ Z hpvi8 E7在HeLa細胞荷瘤裸鼠體內的生物分布 待裸鼠的HeLa腫瘤長至300-500mm3時將裸鼠帶出SPF屏障系統(tǒng)，用10%水合氯醛腹腔注 射誘導麻醉，待其進入深度麻醉狀態(tài)后經(jīng)尾靜脈注射50yg Dy755- ZHPV18E7:228、Dy755- Z HPV18E7:242、Dy755- Z HPV18E7:31Q及對照Dy755- Zwt蛋白，置于小動物活體成像儀（CRi Maesro 2.10m)中成像，并用0.8-1.0iil/g水合氯醛維持麻醉狀態(tài)，以保證小鼠在成像過程 中處于深度麻醉，在5 min、30 min、lh、2 h、4 h、6 h、8 h和24h連續(xù)成像觀察。觀察發(fā)現(xiàn)， Dy755_ Z HPV18 E7:228、Dy755_ Z HPV18 E7:242、Dy755_ Z HPV18 E7:310蛋白尾靜脈注射5分鐘內近 紅外信號分布全身，然后逐步向腫瘤和雙腎聚集，1小時左右，腫瘤部位和雙腎部位信號明 顯增強，腫瘤近紅外信號至4-6小時達到高峰，至24小時，雙腎和腫瘤部位信號明顯減弱；而 對照Dy755- Zwt，則腫瘤部位在觀察的各時間段均沒有顯著增強的信號出現(xiàn)。腫瘤與正常組 織的近紅外信號比值與上述觀察的結果相一致，也是以4-6小時比值達到高峰。荷瘤小鼠在 觀察期間狀態(tài)良好，未見明顯毒性反應。
[0089] 本實施例結果表明，Dylight755標記的Dy755_ Z HPV18 E7: 228、Dy 755- Z HPV18 E7:242、Dy755- Z HPV18 E7:31Q均具有靶向結合HPV18E7表達陽性腫瘤的特性，且沒有嚴重 的毒副作用。為HPV18陽性的宮頸癌靶向治療和分子顯像提供可能。
[0090]
[6]Z hpvi8E7 affitoxin體外對宮頸癌細胞生長抑制作用： 在本實施例的實驗中，利用Z HPV18E7的靶向作用，攜帶經(jīng)改構具有細胞毒作用的綠膿桿 菌外毒素A(pseudomonas exotoxinA，PEA)的活性片段PE38KDEL作為細胞毒分子。構建 affibody/PE38KDEL原核表達載體，并利用原核表達系統(tǒng)制備并純化了 affibody/PE38KDEL 蛋白，即affitoxiruaffitoxin對宮頸癌細胞的體外生長的抑制作用進行驗證。
[0091 ] 1)選擇Z HPV18E7:228和Z HPV18E7:31Q作為研究對象，利用分子克隆技術構建分別構建 pET21a( + )/ZHPvi8E7:228/PE38KDEL 和 pET21a( + )/ZHPvi8E7:3io/PE38KDEL 重組質粒；并測序鑒定。 [0092] 2)制備原核表達重組免疫毒素 Zhpvi8E7: 22 8/PE38KDEL和 Zhpvi8E7: 3io/PE38KDEL， affitoxin 228和affitoxin 310蛋白，BPaffitoxin 228和affitoxin 310蛋白，分別經(jīng) SDS-PAGE及Western blot分析鑒定； 3)為研究Z Hm8E7affitoxin228,310多肽體外細胞生長是否具有抑制作用，選擇HeLa 腫瘤細胞株作為實驗對象。利用CCK-8試劑檢測affitoxin 228和affitoxin 310蛋白對細 胞生長過程中各時間點的細胞生存率進行檢測，并利用Grahpad primer5.0軟件計算Z HPV16E7affibody 多肽的 IC50。
[0093] 具體為： ① pET21a( + ) / Z hpvi8 E7/PE38KDEL重組質粒的構建 以pET21a( + ) / Z hpvi8E7:228和Zhpvi8E7:31q質粒為模板，經(jīng)PCR擴增，利用Ndel和EcoRI進 行雙酶切，同時對實驗室原先構建保存的pET21a( + )/Z HPV18 e7:228/PE38KDEL質粒雙酶切，進 而酶連，構建成pET21a( + )/Z hpvi8 e7:22s/PE38KDEL重組質粒（圖14);構建的重組質粒經(jīng)Ndel 和Ecrol酶切后，酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中6100 bp和174 bp處均出現(xiàn)單一條帶，與 pET21a( + ) /PE38KDEL和Z hpvi8 E7:228的理論序列大小相吻合（圖15)，說明本重組質粒構建 成功。
[0094] ②pET21a( + ) / Z hpvi8 E7/PE38KDEL重組質粒的原核表達、鑒定及純化 pET21a( + ) / Z hpvi8E7:228/PE38KDEL及pET21a( + ) / Z hpvi8E7:3iq/PE38KDEL重組質粒 在E.coli BL21 (DE3)中經(jīng)IPTG誘導表達后，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，在相對分子質量(Mr)約 46kDa的位置出現(xiàn)一明顯條帶，與預期理論值大小相符，（圖16A)。由于重組Z hpvi8 E7:3io/ PE38KDEL蛋白（即Z HPV18 E? affitoxin)的C端含有His標簽，所以用親和層析柱析純化后，經(jīng) SDS-PAGE分析affitoxin228和310蛋白在約46kDa的位置處出現(xiàn)1條較為單一的蛋白條帶 (圖16B)。進一步通過Western Blot分析鑒定，結果（圖16C)顯示，His-tag鼠單抗作為一 抗，在分子質量約為46kDa均處出現(xiàn)單一條帶，提示ZHPvi8E7affitoxin228、310重組蛋白能 特異性識別His-tag血清抗體。表明，2[^18￡73€打1：(?;[11228、310重組純化蛋白制備成功。
[0095] ③為研究Z hpvi8E7 affitoxin體外細胞生長抑制作用，選擇affitoxin228,310蛋白 作為研究對象，并選擇HeLa腫瘤細胞株作為靶細胞。制備細胞懸液并計數(shù)接種于96孔細胞 培養(yǎng)板，0.5X 104 /孔。培養(yǎng)24h后，加入lμg/ml放線菌酮及5%胎牛血清，然后加入 affitoxin228，310蛋白，設置200iig/ml、100 μg/ml、50 iig/ml、25iig/ml、10iig/ml、lμg/ml 六個濃度組，同時設培養(yǎng)基對照，采用CCK-8試劑盒檢測細胞的生存率，在加樣后72h，加入 CCK-8試劑10yl/孔，在C02培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育30min后置于酶標儀A450處讀數(shù)。每組均設置3 個復孔，并進行3次重復實驗。細胞存活(Cell viability)計算方法為:Cell viability (% ) = (affitoxin組的0D值-培養(yǎng)基組0D值)/(培養(yǎng)基組對照組0D值-空白0D值）X 100% ; 同時用GraphPad primer 5.0軟件來計算細胞生長存活的IC50值。
[0096] 結果如圖17,經(jīng)GraphPad primer 5.0軟件來計算HeLa細胞生長存活的IC50值， affitoxin228, 310蛋白的 IC50分別為0? llMm (圖 17A)和0.05福（圖 17B)。圖 18 顯示， affitoxin 228和310蛋白對表達HPV18 E7陽性的宮頸癌細胞HeLa具有較強的殺傷作用， 作用72h后，其細胞生存率隨著劑量濃度的升高而下降，具有劑量依賴性。afTit 〇xin228， 310蛋白的六個劑量組之間（200iig/ml、100 μg/ml、50 μg/ml、25iig/ml、10iig/ml、lμg/ml)， 200μg/ml與100 μg/ml劑量組之間對HeLa細胞生長率均有顯著性差異無顯著性差異(p> 0.05)，但200μg/ml及100 μg/ml與其他劑量組對HeLa細胞生長率均有顯著性差異（p〈 0.05)〇
[0097] 以上結果表明，affitoxin 228，310具有體外HPV18E7靶向抑制細胞生長的特異 性。
[0098] [7]研究ZHPV18E7 affitoxin 228，310對宮頸癌細胞荷瘤裸鼠模型的抑瘤作用： 為研究Z HPV18E7 affitoxin228,310蛋白體內對荷瘤裸鼠的抑瘤作用，將宮頸癌細胞株 HeLa細胞數(shù)調整至lX107/ml，接種于4-5周齡的裸鼠背側近右前肢處，每只0.2ml，待腫瘤生 長100~200 mm3大小時，分成3個組別，SPaffitoxin 228蛋白，affitoxin 310蛋白及PBS對 照組，蛋白按照5mg/kg的劑量，每只裸鼠經(jīng)尾靜脈注射0.2ml對應樣品。每3天注射1次，共6 次。同時每3天觀察小鼠生活和精神狀態(tài)等，測量腫瘤大小并拍照記錄，觀察至45天。之后處 死小鼠剝離腫瘤組織，稱重腫瘤大小。從圖19可知，各組裸鼠在注射蛋白后，隨著時間的推 移，PBS組瘤體逐漸加大，且增幅明顯，在第33天瘤體即大于1000mm 3，而注射aff i toxin 228 蛋白和affitoxin 310蛋白6次后，affitoxin 228蛋白和affitoxin 310蛋白組的瘤體增長 緩慢，觀察期間瘤體一直小于300mm3直至45天。45天全程觀察期間，裸鼠反應可，飲食正常， 體重變化不明顯。之后處死裸鼠，剝離的腫瘤組織拍照（圖20A)并稱量，affitoxin 228蛋白 和aff itoxin 310組瘤體最小，平均重量分別為0.16 ±0.05g和0.29±0.04g，而PBS組腫瘤 重量達到0.92±0.08g，經(jīng)t檢驗，aff itoxin 228蛋白和aff itoxin 310組瘤體與PBS組比 較，差別有統(tǒng)計學意義(P〈〇.5)(如圖20B)，而aff itoxin 228蛋白和aff itoxin 310組比較 差別有統(tǒng)計學意義(P>〇. 5)。
[0099] 上述結果表明，affitoxin228和affitoxin310蛋白均具有HPV18 E7靶向抑瘤作 用。且毒副作用不明顯。
【主權項】
1. 一種對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結合親和力的多肽，其特征在于:該多肽 是以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作為骨架，進行12-20個氨基酸變異后獲得的多肽。2. 如權利要求1所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結合親和力的多肽，其特 征在于:相對于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，該多肽在第9-11，13-14，17-18,24-25， 27-28,32,35,43位上發(fā)生氨基酸突變。3. 如權利要求2所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結合親和力的多肽，其特 征在于，相對于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，該多肽的： 第9位氨基酸突變?yōu)镻、F或A; 第10位氨基酸突變?yōu)镕、L或V; 第11位氨基酸突變?yōu)镃、L或R; 第13位氨基酸突變?yōu)镽、M或S; 第14位氨基酸突變?yōu)镼、V或G; 第17位氨基酸突變?yōu)镾、F或A; 第18位氨基酸突變?yōu)镻、W或V; 第24位氨基酸突變?yōu)镠、E或P; 第25位氨基酸突變?yōu)棣Щ駿; 第27位氨基酸突變?yōu)棣ァⅵ』駾; 第28位氨基酸突變?yōu)镻、E或L; 第32位氨基酸突變?yōu)镚、R或P; 第35位氨基酸突變?yōu)镻、H、Q或V; 第43位氨基酸突變?yōu)镋、D或K。4. 如權利要求1所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結合親和力的多肽，其特 征在于:該多肽與人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白相互作用的KD值為1X10_ 6M至3X10_7M。5. -種靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分子，其特征在于，所述的靶向性分子包括權 利要求1-4任一所述的多肽，以及與該多肽相連接(或偶聯(lián))的偶聯(lián)物，所述的偶聯(lián)物包括： 半胱氨酸殘基，多肽標簽，抑制人乳頭瘤病毒18型的藥物，或可檢測標記物。6. 如權利要求5所述的靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分子，其特征在于，所述的抑 制人乳頭瘤病毒18型的藥物包括:毒素;所述毒素是具有抑制人乳頭瘤病毒18型病毒感 染或抑制腫瘤作用的毒素，如白喉毒素、蓖麻毒素、綠膿桿菌外毒素或所述毒素的功能性片 段;且所述的腫瘤是人乳頭瘤病毒18型陽性的腫瘤。7. -種分離的多核苷酸，其編碼權利要求1-4任一所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7 蛋白具有結合親和力的多肽。8. -種多核苷酸，其編碼權利要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分 子，且其中所述的偶聯(lián)物是肽。9. 一種重組載體，其特征在于，該載體包含權利要求7或8所述的多核苷酸。10. -種宿主細胞，其特征在于，該宿主細胞包含權利要求9所述的重組載體，或其包 含有或基因組中整合有權利要求7或8所述的多核苷酸。11. 一種制備權利要求1-4任一所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結合 親和力的多肽的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 培養(yǎng)權利要求10所述的細胞，從而表達權利要求1-4任一所述的對人乳頭瘤病 毒18型的E7蛋白具有結合未和力的多妝； (2) 分離純化(1)獲得的多肽。12. -種如權利要求1-4任一所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結合親和力 的多肽或如權利要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分子的用途，用于制 備治療人乳頭瘤病毒18型感染疾病或人乳頭瘤病毒18型表達陽性腫瘤的藥物;或用于制 備檢測人乳頭瘤病毒18型病毒感染的檢測試劑;或用于制備診斷人乳頭瘤病毒18型感染 疾病或人乳頭瘤病毒18型表達陽性腫瘤的診斷試劑。13. -種藥物組合物，其特征在于，其包含： 權利要求1-4所述的對人乳頭瘤病毒18型的E7蛋白具有結合親和力的多肽或權利 要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒18型的靶向性分子;和藥學上可接受的載體。14. 一種用于診斷或治療人乳頭瘤病毒18型感染疾病或人乳頭瘤病毒18型表達陽性 腫瘤的藥盒，其特征在于，所述的藥盒中包括:權利要求1-4任一所述的對人乳頭瘤病毒 18型的E7蛋白具有結合親和力的多肽，或權利要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒18 型的靶向性分子，或權利要求13所述的藥物組合物。
【文檔編號】G01N33/574GK105820219SQ201610056286
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年1月27日
【發(fā)明人】張麗芳, 王樂丹, 薛向陽, 朱珊麗, 蔣朋飛, 李文姝, 陳俊
【申請人】溫州醫(yī)科大學