一組鑒別阿膠及其制品中牛源性成分的多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一組鑒別阿膠及其制品中牛源性成分的多肽，以及使用所述多肽通過質(zhì)譜法鑒定阿膠及其制品中牛源性成分的方法，所述的多肽組中的多肽具有特定的序列結(jié)構(gòu)及特定m/z值(包括特定的母離子和一對子離子)，其序列如SEQ ID NO.1～50所示，所述肽段及其m/z為牛源阿膠特有，在驢源阿膠中未見存在。
【專利說明】
一組鑒別阿膠及其制品中牛源性成分的多肽
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一組鑒別阿膠及其制品中牛源性成分 的多肽及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿膠為馬科動物驢的皮，經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠，原產(chǎn)自山東省東阿縣，至今 已有近三千年歷史。阿膠是傳統(tǒng)的滋補上品、補血圣藥，味甘平，入肺、肝、腎經(jīng)，具有補血止 血、滋陰潤燥等功效，藥食兩用，長期服用可補血養(yǎng)血、美白養(yǎng)顏、抗衰老、抗疲勞、提高免疫 力，適用人群廣泛。李時珍著《本草綱目》載："阿膠《本經(jīng)》上品。弘景曰：'出東阿，故名阿 膠'"。阿膠是中藥材中典型的最講究"地道性"的藥材，道地阿膠必汲取東阿之水，得傳承人 之奇秘技藝煉制而成。道地阿膠表面平整，無油氣孔，質(zhì)硬而脆，斷面光亮細(xì)膩，碎片對光照 視呈棕色半透明狀，李時珍贊其〃黃透如琥珀色，光黑如璧漆"。
[0003] 早在1996年就曾曝光過假阿膠事件。時隔多年之后，阿膠造假不僅沒有得到遏制， 而且越演越烈。這些不法企業(yè)利用牛皮、馬皮下腳料等劣質(zhì)材料冒充驢皮制作偽劣阿膠，并 以次充好向市場銷售。
[0004] 導(dǎo)致阿膠造假事件屢禁不止的一部分原因是缺少鑒定的技術(shù)支持，動物皮經(jīng)過熬 制溶解之后，破壞了本身的特性，很難鑒別出動物皮的來源。目前國家也沒有有效鑒別阿膠 成分的方法，只能靠從生產(chǎn)源頭進行控制，以上情況導(dǎo)致了許多不法企業(yè)鉆空子。
[0005] 迫切需要一種高效準(zhǔn)確鑒定阿膠及其制品真?zhèn)蔚姆椒?。隨著代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā) 展，利用肽組學(xué)直接鑒定動物源成分成為可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明對阿膠和牛皮膠中的多肽進行了研究，建立了從多肽水平對阿膠及其制品 中牛源性成分進行鑒別的技術(shù)，填補了國內(nèi)外阿膠及其制品鑒別的空白。
[0007] 本發(fā)明首先涉及一組用于單獨或組合檢測阿膠及其制品中牛源性成分的多肽，所 述的阿膠制品包括但不限于阿膠糕、阿膠膏、阿膠漿、阿膠口服液、阿膠糖、阿膠補血顆粒， 所述的多妝的序列為：
[0008] SEQ ID N0.1：GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR；
[0009] SEQ ID N0.2：GPPGPQGPR；
[0010] SEQ ID N0.3：PGEVGPPGPPGPAGEK；
[0011] SEQ ID N0.4：NGLPGGPGLR；
[0012] SEQ ID N0.5：DGASGHPGPIGPPGPR；
[0013] SEQ ID N0.6：GDGGPPGATGFPGAAGR；
[0014] SEQ ID N0.7：IGQPGAVGPAGIR；
[0015] SEQ ID N0.8：GVAGEPGRNGLPGGPGLR；
[0016] SEQ ID N0.9：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
[0017] SEQ ID N0.10：GSTGEIGPAGPPGPPGLR；
[0018] SEQ ID NO.IKDIGSPGR;
[0019] SEQ ID N0.12：GEAGSPGIAGPK；
[0020] SEQ ID N0.13：GEPGPAGAVGPAGAVGPR；
[0021] SEQ ID N0.14：GETGTAGDAGPIGPVGAR；
[0022] SEQ ID NO.15：GETGMAGAVGPAGAVGPR；
[0023] SEQ ID NO.16：GGPGPAGPR；
[0024] SEQ ID NO.17：IGQPGAVGPAGIR；
[0025] SEQ ID NO.18：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
[0026] SEQ ID NO.19：TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK；
[0027] SEQ ID N0.20：SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR；
[0028] SEQ ID NO.21：GDGGPPGATGFPGAAGR；
[0029] SEQ ID N0.22：VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK；
[0030] SEQ ID N0.23：NGLPGGPGLR；
[0031] SEQ ID N0.24：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
[0032] SEQ ID N0.25：GIPGPVGAAGATGAR；
[0033] SEQ ID N0.26：GEAGPAGPAGPAGPR；
[0034] SEQ ID NO.27：IGYAVGPAAVLDAAR；
[0035] SEQ ID N0.28：GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR；
[0036] SEQ ID N0.29：AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK；
[0037] SEQ ID N0.30：AGPPGPPGPAGK；
[0038] SEQ ID NO.31：GEPGPAGLPGPPGER；
[0039] SEQ ID N0.32：GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR；
[0040] SEQ ID N0.33：GETGHAGPAGPIGPVGAR；
[0041] SEQ ID N0.34：GPPGSAGAPGK；
[0042] SEQ ID N0.35：GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR；
[0043] SEQ ID N0.36：GETGPAGPAGPIGPVGAR；
[0044] SEQ ID N0.37：SGETGASGPPGFVGEK；
[0045] SEQ ID N0.38：GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR；
[0046] SEQ ID N0.39：GPPGAGGPPGPR；
[0047] SEQ ID NO.40：GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK；
[0048] SEQ ID N0.41：DGASGHPGPIGPPGPR；
[0049] SEQ ID N0.42：GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER；
[0050] SEQ ID N0.43：GPPGESGAAGPTGPIGSR；
[0051] SEQ ID N0.44：GPPGAGGPPGPR；
[0052] SEQ ID N0.45：GVAGEPGRNGLPGGPGLR；
[0053] SEQ ID N0.46：GESGAPGVPGIAGPR；
[0054] SEQ ID N0.47：GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR；
[0055] SEQ ID NO.48：GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK；
[0056] SEQ ID N0.49：PGEVGPPGPPGPAGEK；
[0057] SEQ ID N0.50:GSTGEIGPAGPPGPPGLR。
[0058] 其m/z分別為：
[0059] 肽段 1:694.7;
[0060] 肽段 2:440.2;
[0061] 肽段 3:737.9;
[0062] 肽段4:477.8;
[0063] 肽段 5:495.6;
[0064] 肽段6:729.3;
[0065] 肽段7:596.8;
[0066] 肽段8:565.3;
[0067] 肽段 9:611.6;
[0068] 肽段 10:816.9;
[0069] 肽段11:387.7;
[0070] 肽段 12:528.8;
[0071] 肽段 13:511.6;
[0072] 肽段 14:791.9;
[0073] 肽段 15:777.9;
[0074] 肽段 16:391.2;
[0075] 肽段 17:604.8;
[0076] 肽段 18:908.9;
[0077] 肽段 19:923.5;
[0078] 肽段 20:659.3;
[0079] 肽段 21:737.3;
[0080] 肽段 22:605.3;
[0081] 肽段 23:485.7;
[0082] 肽段 24:601.0;
[0083] 肽段 25:634.3;
[0084] 肽段 26:631.3;
[0085] 肽段 27:722.4;
[0086] 肽段 28:1066.1;
[0087] 肽段 29:879.0;
[0088] 肽段 30:517.8;
[0089] 肽段 31:718.3;
[0090] 肽段 32:705.4;
[0091] 肽段 33:791.9;
[0092] 肽段 34:464.3;
[0093] 肽段 35:711.0;
[0094] 肽段 36:780.9;
[0095] 肽段 37:746.9;
[0096] 肽段 38:700.0;
[0097] 肽段 39:516.8;
[0098] 肽段40:1169.1;
[0099] 肽段41:500.9;
[0100] 肽段42:727.3;
[0101] 肽段43:790.9;
[0102] 肽段 44:516.8;
[0103] 肽段45:570.6;
[0104] 肽段46:677.3;
[0105] 肽段47:691.7;
[0106] 肽段48:779.7;
[0107] 肽段49:745.9;
[0108] 肽段 50:824.9。
[0109] 50條多肽對應(yīng)的母離子、子離子見下表1，
[0110] 表1牛源性多肽序列及其對應(yīng)的母離子、子離子
[0111]
[0112]
[0113]
[0114] 本發(fā)明所涉及前處理方法包括如下步驟：
[0115] (1)對待測樣本進行質(zhì)譜前處理，獲得待測多肽濾液：
[0116] (2)通過質(zhì)譜法檢測待測樣本的多肽成分，分析樣本中的動物皮來源成分。
[0117] 所述的質(zhì)譜前處理步驟如下：
[0118] (1)將待測樣品均質(zhì)成粉末狀態(tài)，稱取〇. lg~〇. 5g阿膠樣品或1.0-2.0g阿膠制品， 加入1 %NH4HC〇3溶液，超聲處理10~30min使樣品完全溶解，定容至50mL;
[0119] (2)溶液過 0·22μπι 濾膜；
[0120] (3)取 10 ~20yLTrypsin 酶溶液（1μg/μL 的 Trypsin 酶溶液）加入到 100yL ~200yL 上 述濾液中，37°C酶解16-18小時，待上機檢測。
[0121] 本發(fā)明還涉及兩種檢測阿膠及其制品的質(zhì)譜方法，所述的質(zhì)譜法檢測為，
[0122] 采用AB SCIEXTnpl:eTQF?5600質(zhì)譜檢測，
[0123] 流動相A: 0.05~0.2 %甲酸-乙腈溶液，流動相B: 0.05~0.2 %甲酸-水，
[0124] 流速:0· 1~0.5mL/min，
[0125] T0F掃描范圍：100-3000Da，
[0126] 正離子反應(yīng)模式，GS1:35，GS2:45，Curtain Gas: 35，ISVF: 5500，TEM: 500，DP: 100， CE：10〇
[0127] 采用AB SCIEX三重四級桿質(zhì)譜檢測，
[0128] 流動相A: 0.05~0.2%甲酸-乙腈，流動相B: 0.05~0.2%甲酸-水，
[0129] 流速:0· 1~0.5mL/min，
[0130] 電噴霧離子源，正離子反應(yīng)模式，檢測方式:MRM，噴霧電壓：5500V，離子傳輸管溫 度:475°C;鞘氣壓力:40;輔助氣壓力:6。
[0131]所述的分析樣本中的牛源性成分為，將待測樣品的質(zhì)譜結(jié)果對比SEQ ID NO. 1~ 50的各條特異性多肽的質(zhì)譜譜圖，出現(xiàn)SEQ ID NO. 1~50的各條特異性多肽的質(zhì)譜檢測譜 圖時，即可判斷該組織樣本存在牛源性成分。
【附圖說明】
[0132] 圖 1，GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR 色譜圖
[0133] 圖 2，GPPGPQGPR 色譜圖
[0134] 圖 3，PGEVGPPGPPGPAGEK 色譜圖
[0135] 圖4，NGLPGGPGLR 色譜圖
[0136] 圖 5，DGASGHPGPIGPPGPR 色譜圖
[0137] 圖 6，GDGGPPGATGFPGAAGR 色譜圖
[0138] 圖7，IGQPGAVGPAGIR 色譜圖
[0139] 圖 8，GVAGEPGRNGLPGGPGLR 色譜圖
[0140] 圖 9，GPPGPMGPPGLAGPPGESGR 色譜圖
[0141] 圖 10，GSTGEIGPAGPPGPPGLR 色譜圖
[0142] 圖 11，GDIGSPGR 色譜圖
[0143] 圖 12，GEAGSPGIAGPK 色譜圖
[0144] 圖 13，GEPGPAGAVGPAGAVGPR 色譜圖
[0145] 圖 14，GETGTAGDAGPIGPVGAR 色譜圖
[0146] 圖 15，GETGMAGAVGPAGAVGPR 色譜圖
[0147] 圖 16，GGPGPAGPR 色譜圖
[0148] 圖 17，IGQPGAVGPAGIR 色譜圖
[0149] 圖 18，GPPGPMGPPGLAGPPGESGR 色譜圖
[0150] 圖 19，TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK色譜圖
[0151] 圖 20，SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR 色譜圖
[0152] 圖 21，GDGGPPGATGFPGAAGR 色譜圖
[0153] 圖 22，VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK 色譜圖
[0154] 圖 23，NGLPGGPGLR 色譜圖
[0155] 圖 24，GPPGPMGPPGLAGPPGESGR色譜圖
[0156] 圖 25，GIPGPVGAAGATGAR 色譜圖
[0157] 圖 26，GEAGPAGPAGPAGPR 色譜圖
[0158] 圖 27，IGYAVGPAAVLDAAR 色譜圖
[0159] 圖 28，GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR 色譜圖
[0160] 圖 29，AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK 色譜圖
[0161] 圖 30，AGPPGPPGPAGK 色譜圖
[0162] 圖 31，GEPGPAGLPGPPGER 色譜圖
[0163] 圖 32，GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR 色譜圖
[0164] 圖 33，GETGHAGPAGPIGPVGAR 色譜圖
[0165] 圖 34，GPPGSAGAPGK 色譜圖
[0166] 圖 35，GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR 色譜圖
[0167] 圖 36，GETGPAGPAGPIGPVGAR色譜圖
[0168] 圖 37，SGETGASGPPGFVGEK 色譜圖
[0169] 圖 38，GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR色譜圖
[0170] 圖 39，GPPGAGGPPGPR 色譜圖
[0171] 圖 40，GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK 色譜圖
[0172] 圖 41，DGASGHPGPIGPPGPR 色譜圖
[0173] 圖 42，GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER 色譜圖
[0174] 圖 43，GPPGESGAAGPTGPIGSR 色譜圖
[0175] 圖 44，GPPGAGGPPGPR 色譜圖
[0176] 圖 45，GVAGEPGRNGLPGGPGLR 色譜圖
[0177] 圖 46，GESGAPGVPGIAGPR 色譜圖
[0178] 圖 47，GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR 色譜圖
[0179] 圖 48，GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK 色譜圖
[0180] 圖 49，PGEVGPPGPPGPAGEK 色譜圖
[0181] 圖 50，GSTGEIGPAGPPGPPGLR 色譜圖
[0182] 圖51，在純品驢阿膠膠原中檢測SEQ ID NO. 1~50所示多肽的色譜特征圖 圖52,樣品1的檢測結(jié)果圖 圖53,樣品2的檢測結(jié)果圖 圖54,驢阿膠對照品檢測結(jié)果圖
【具體實施方式】
[0183] 實施例1，篩選牛阿膠膠原特異性多肽
[0184] 通過質(zhì)譜分析純品牛膠原樣本和驢膠原樣本，利用ProteinPilot軟件對質(zhì)譜結(jié)果 進行檢索比對分析，從而確定最優(yōu)選的牛膠原專屬多肽序列。
[0185] 首先，對選取的純品膠原樣本進行質(zhì)譜分析，步驟包括：
[0186] ( - )樣本前處理步驟：
[0187] (1)稱取0. lg~0.5g均質(zhì)成粉末狀態(tài)的純品樣品，加入1 %NH4HC03溶液，超聲處理 10~30min使樣品完全溶解，定容至50mL;
[0188] (2)溶液過 0·22μπι 濾膜；
[0189] (3)取 10 ~20yLTrypsin 酶溶液（1μg/μL 的 Trypsin 酶溶液）加入到 100yL ~200yL 上 述濾液中，37°C酶解16-18小時，待上機檢測。
[0190] (二)上機檢測，
[0191] (1)采用AB SCIEXTripieTOF?5600質(zhì)譜檢測方法如下，
[0192] 流動相A: 0.05~0.2 %甲酸-乙腈溶液，流動相B: 0.05~0.2 %甲酸-水，
[0193] 流速:0· 1~0.5mL/min，
[0194] T0F掃描范圍：100-3000Da，
[0195] 正離子反應(yīng)模式，GS1:35，GS2:45，Curtain Gas: 35，ISVF: 5500，TEM: 500，DP: 100， CE：10〇
[0196] (2)采用AB SCIEX三重四級桿質(zhì)譜檢測方法如下，
[0197] 流動相A: 0.05~0.2%甲酸-乙腈，流動相B: 0.05~0.2%甲酸-水，
[0198] 流速:0· 1~0.5mL/min，
[0199] 電噴霧離子源，正離子反應(yīng)模式，檢測方式:MRM，噴霧電壓：5500V，離子傳輸管溫 度:475°C;鞘氣壓力:40;輔助氣壓力:6。
[0200] 其次，依據(jù)純品膠原樣本的質(zhì)譜結(jié)果，利用ProteinPilot軟件對質(zhì)譜結(jié)果進行檢 索比對分析，篩選得到在牛膠原中確實存在的專屬多肽組，組中的各條多肽序列信息如下：
[0201] SEQ ID N0.1：GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR；
[0202] SEQ ID NO.2：GPPGPQGPR；
[0203] SEQ ID NO.3：PGEVGPPGPPGPAGEK；
[0204] SEQ ID NO.4：NGLPGGPGLR；
[0205] SEQ ID N0.5：DGASGHPGPIGPPGPR；
[0206] SEQ ID N0.6：GDGGPPGATGFPGAAGR；
[0207] SEQ ID NO.7：IGQPGAVGPAGIR；
[0208] SEQ ID NO.8：GVAGEPGRNGLPGGPGLR；
[0209] SEQ ID N0.9：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
[0210] SEQ ID N0.10：GSTGEIGPAGPPGPPGLR；
[0211] SEQ ID N0.11：GDIGSPGR；
[0212] SEQ ID NO.12：GEAGSPGIAGPK；
[0213] SEQ ID NO.13：GEPGPAGAVGPAGAVGPR；
[0214] SEQ ID NO.14：GETGTAGDAGPIGPVGAR；
[0215] SEQ ID NO.15：GETGMAGAVGPAGAVGPR；
[0216] SEQ ID N0.16：GGPGPAGPR；
[0217] SEQ ID NO.17：IGQPGAVGPAGIR；
[0218] SEQ ID NO.18：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
[0219] SEQ ID NO.19：TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK；
[0220] SEQ ID N0.20：SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR；
[0221] SEQ ID NO.21：GDGGPPGATGFPGAAGR；
[0222] SEQ ID N0.22：VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK；
[0223] SEQ ID NO.23：NGLPGGPGLR；
[0224] SEQ ID NO.24：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
[0225] SEQ ID N0.25：GIPGPVGAAGATGAR；
[0226] SEQ ID N0.26：GEAGPAGPAGPAGPR；
[0227] SEQ ID NO.27：IGYAVGPAAVLDAAR；
[0228] SEQ ID N0.28：GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR；
[0229] SEQ ID N0.29：AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK；
[0230] SEQ ID N0.30：AGPPGPPGPAGK；
[0231] SEQ ID NO.31：GEPGPAGLPGPPGER；
[0232] SEQ ID N0.32：GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR；
[0233] SEQ ID N0.33：GETGHAGPAGPIGPVGAR；
[0234] SEQ ID NO.34：GPPGSAGAPGK；
[0235] SEQ ID N0.35：GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR；
[0236] SEQ ID N0.36：GETGPAGPAGPIGPVGAR；
[0237] SEQ ID NO.37：SGETGASGPPGFVGEK；
[0238] SEQ ID N0.38：GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR；
[0239] SEQ ID N0.39：GPPGAGGPPGPR；
[0240] SEQ ID NO.40：GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK；
[0241] SEQ ID N0.41：DGASGHPGPIGPPGPR；
[0242] SEQ ID N0.42：GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER；
[0243] SEQ ID N0.43：GPPGESGAAGPTGPIGSR；
[0244] SEQ ID NO.44：GPPGAGGPPGPR；
[0245] SEQ ID N0.45：GVAGEPGRNGLPGGPGLR；
[0246] SEQ ID N0.46：GESGAPGVPGIAGPR；
[0247] SEQ ID N0.47：GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR；
[0248] SEQ ID NO.48：GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK；
[0249] SEQ ID NO.49：PGEVGPPGPPGPAGEK；
[0250] SEQ ID N0.50:GSTGEIGPAGPPGPPGLR。
[0251] 上述50條多肽的質(zhì)譜譜圖和m/z的數(shù)值如下：
[0252] 圖1是多肽64?6?〇6??64?6?1^1461^六1?在牛膠原中的色譜圖，其111/2為694.7。
[0253] 圖2是多肽6??6?〇6?1?在牛膠原中的色譜圖，其111/2為440.2。
[0254] 圖3是多肽PGEVGPPGPPGPAGEK在牛膠原中的色譜圖，其m/z為737.9。
[0255] 圖4是多肽呢1^66?61^在牛膠原中的色譜圖，其111/2為477.8。
[0256] 圖5是多肽06六36即6?16??6?1?在牛膠原中的色譜圖，其111/2為495.6。
[0257] 圖6是多肽6066??6416??64六61?在牛膠原中的色譜圖，其111/2為729.3。
[0258] 圖7是多肽16〇?64￥6?六611?在牛膠原中的色譜圖，其111/2為596.8。
[0259] 圖8是多肽GVAGEPGRNGLPGGPGLR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為565.3。
[0260] 圖9是多肽GPPGPMGPPGLAGPPGESGR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為611.6。
[0261] 圖10是多肽GSTGEIGPAGPPGPPGLR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為816.9。
[0262] 圖11是多肽⑶IGSPGR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為387.7。
[0263] 圖12是多肽GEAGSPGIAGPK在牛膠原中的色譜圖，其m/z為528.8。
[0264] 圖13是多肽GEPGPAGAVGPAGAVGPR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為511.6。
[0265] 圖14是多肽GETGTAGDAGPIGPVGAR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為791.9。
[0266] 圖15是多肽GETGMAGAVGPAGAVGPR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為777.9。
[0267] 圖16是多肽66?6?六6?1?在牛膠原中的色譜圖，其111/2為391.2。
[0268] 圖17是多肽16〇?64￥6?六611?在牛膠原中的色譜圖，其111/2為604.8。
[0269] 圖18是多肽GPPGPMGPPGLAGPPGESGR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為908.9。
[0270] 圖19是多肽了60?6?36136??6??6?六61(在牛膠原中的色譜圖，其111/2為923.5。
[0271] 圖20是多肽5601^^了6?46?46?16?￥641?在牛膠原中的色譜圖，其111/2為659.3。
[0272] 圖21是多肽6066??64了6??64六61?在牛膠原中的色譜圖，其111/2為737.3。
[0273] 圖22是多肽￥6??6?56熟6??6??6?六61(在牛膠原中的色譜圖，其111/2為605.3。
[0274] 圖23是多肽呢1^66?61^在牛膠原中的色譜圖，其111/2為485.7。
[0275] 圖24是多肽GPPGPMGPPGLAGPPGESGR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為601.0。
[0276] 圖25是多肽61?6?￥64464了6六1?在牛膠原中的色譜圖，其111/2為634.3。
[0277] 圖26是多肽GEAGPAGPAGPAGPR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為631.3。
[0278] 圖27是多肽16￥4￥6?44￥1^六1?在牛膠原中的色譜圖，其111/2為722.4。
[0279] 圖28是多肽GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為1066.1。
[0280] 圖29是多肽AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK在牛膠原中的色譜圖，其m/z為879.0。
[0281] 圖30是多肽六6??6??6?六61(在牛膠原中的色譜圖，其111/2為517.8。
[0282] 圖31是多肽GEPGPAGLPGPPGER在牛膠原中的色譜圖，其m/z為718.3。
[0283] 圖32是多肽64?6?06??64?6?1^1461^六1?在牛膠原中的色譜圖，其111/2為705.4。
[0284] 圖33是多肽GETGHAGPAGPIGPVGAR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為791.9。
[0285] 圖34是多肽6??6346六?61(在牛膠原中的色譜圖，其111/2為464.3。
[0286] 圖35是多肽GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為711.0。
[0287] 圖36是多肽GETGPAGPAGPIGPVGAR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為780.9。
[0288] 圖37是多肽SGETGASGPPGFVGEK在牛膠原中的色譜圖，其m/z為746.9。
[0289] 圖38是多肽GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為700.0。
[0290] 圖39是多肽6??6六66??6?1?在牛膠原中的色譜圖，其111/2為516.8。
[0291] 圖40是多肽GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK在牛膠原中的色譜圖，其m/z為1169.1。
[0292] 圖41是多肽06436即6?16??6?1?在牛膠原中的色譜圖，其111/2為500.9。
[0293] 圖42是多肽GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER在牛膠原中的色譜圖，其m/z為727.3。
[0294] 圖43是多肽GPPGESGAAGPTGPIGSR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為790.9。
[0295] 圖44是多肽6??6六66??6?1?在牛膠原中的色譜圖，其111/2為516.8。
[0296] 圖45是多肽GVAGEPGRNGLPGGPGLR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為570.6。
[0297] 圖46是多肽GESGAPGVPGIAGPR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為677.3。
[0298] 圖47是多肽GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為691.7。
[0299] 圖48是多肽GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK在牛膠原中的色譜圖，其m/z為779.7。 [0300] 圖49是多肽PGEVGPPGPPGPAGEK在牛膠原中的色譜圖，其m/z為745.9。
[0301] 圖50是多肽GSTGEIGPAGPPGPPGLR在牛膠原中的色譜圖，其m/z為824.9。
[0302]最后，用相同的方法處理并檢測驢膠原樣本，質(zhì)譜檢測結(jié)果進行匹配，結(jié)果顯示， SEQ ID NO. 1~50所示的各條多肽樣本，在驢膠原中不存在。
[0303]圖51是在驢膠原中檢測上述多肽SEQ ID NO. 1~50的色譜特征圖，可見譜圖中未 檢出SEQ ID NO. 1~50所述的色譜峰。
[0304]實施例2,檢測不特定阿膠樣本，判斷是否為牛膠原冒充產(chǎn)品
[0305]對某市公安局送檢的動物皮熬制的阿膠及其制品樣本及市售阿膠產(chǎn)品進行質(zhì)譜 分析，確定是否為純品驢膠原阿膠。
[0306]對待測樣品的處理和檢測方法同實施例1中的處理和檢測方法 [0307]步驟(一)樣本前處理步驟：
[0308] (1)將待測樣品均質(zhì)成粉末狀態(tài)，稱取0.1的阿膠樣品或稱取2.0g阿膠制品，加入 1 %NH4HC〇3溶液，超聲處理10-30min使樣品完全溶解，定容至50mL;
[0309] (2)溶液過 0·22μπι 濾膜；
[0310] (3)取lOyLTrypsin酶溶液（1μg/μL的Trypsin酶溶液）加入到100yL上述濾液中，37 °C酶解16-18小時，待上機檢測。
[0311]步驟(二)上機檢測，
[0312] 采用AB SCIEXTripteT〇F#5600質(zhì)譜檢測，
[0313] 流動相A: 0.1 %甲酸-乙腈，流動相B: 0.1 %甲酸-水，
[0314] 流速:0.25mL/min，
[0315] T0F掃描范圍：350-1500Da，
[0316] 正離子反應(yīng)模式，GS1:35，GS2:45，Curtain Gas: 35，ISVF: 5500，TEM: 500，DP: 100， CE：10〇
[0317]采用AB SCIEX三重四級桿質(zhì)譜檢測，
[0318] 流動相A: 0.1 %甲酸-乙腈，流動相B: 0.1 %甲酸-水，
[0319] 流速:0.3mL/min，
[0320] 電噴霧離子源，正離子反應(yīng)模式，檢測方式:MRM，噴霧電壓：5500V，離子傳輸管溫 度:475°C;鞘氣壓力:40;輔助氣壓力:6。
[0321] 檢測結(jié)果對比實施例1中的各條牛膠原特異性多肽的質(zhì)譜譜圖，出現(xiàn)實施例1所述 質(zhì)譜檢測譜圖時，即可判斷該組織樣本含有牛源性成分。
[0322] 經(jīng)檢測:某市公安局送檢的樣品中，
[0323] 樣品1為僅檢出牛源性成分，未檢出驢源性成分：
[0324] 選取實施例1中的兩條牛膠原多肽和已知兩條驢膠原特異性多肽作為參考，相同 的檢測條件下，樣品1中僅檢出選取的兩條牛膠原多肽的色譜峰(見圖52左上、右上），未見 驢膠原特異性多肽色譜峰(見圖52左下、右下）；
[0325] 樣品2既檢出驢源性成分也檢出牛源性成分：
[0326] 選取實施例1中的兩條牛膠原多肽和已知兩條驢膠原特異性多肽作為參考，相同 的檢測條件下，樣品2中既檢出選取的兩條牛膠原多肽的色譜峰（見圖53左上、右上），也可 見驢膠原特異性多肽色譜峰(見圖53左下、右下）；
[0327] 對照品東阿阿膠出產(chǎn)的桃花姬制品僅檢出驢源性成分：
[0328] 選取實施例1中的兩條牛膠原多肽和已知兩條驢膠原特異性多肽作為參考，相同 的檢測條件下，對照中未檢出選取的兩條牛膠原多肽的色譜峰(見圖54左上、右上），僅檢出 驢膠原特異性多肽色譜峰(見圖54左下、右下）；
[0329]最后需要說明的是，以上實施例僅用作幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明的實質(zhì)， 不用作的本發(fā)明保護范圍的限定。
【主權(quán)項】
1. 一組用于單獨或任意組合檢測阿膠及其制品中牛源性成分的多膚，所述的阿膠制品 包括但不限于阿膠糕、阿膠膏、阿膠漿、阿膠口服液、阿膠糖、阿膠補血顆粒，所述的多膚的 序列為： 膚段 1:沈Q ID N0.1:GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR; 膚段2:沈Q ID N0.2:GPPGPQGPR; 膚段3:沈Q ID N0.3:PGEVGPPGPPGPAGEK; 膚段4:沈Q ID N0.4:NGLPGGPGLR; 膚段5:沈Q ID N0.5:DGASGHPGPIGPPGPR; 膚段6:沈Q ID N0.6:GDGGPPGATGFPGAAGR; 膚段7:沈Q ID N0.7:IGQPGAVGPAGIR; 膚段8:沈Q ID N0.8:GVAGEPGRNGLPGGPGLR; 膚段9:沈Q ID N0.9:GPPGPMGPPGLAGPPGESGR; 膚段 10:沈Q ID N0.10:GSTGEIGPAGPPGPPGLR; 膚段 11:SEQ ID N0.11:GDIGSPGR; 膚段12:沈Q ID N0.12:GEAGSPGIAGPK; 膚段13:沈Q ID N0.13:GEPGPAGAVGPAGAVGPR; 膚段 14:沈Q ID N0.14:GETGTAGDAGPIGPVGAR; 膚段15:沈Q ID N0.15:GETGMAGAVGPAGAVGPR; 膚段 16:沈Q ID N0.16:GGPGPAGPR; 膚段 17:沈Q ID N0.17:IGQPGAVGPAGIR; 膚段 18:沈Q ID N0.18:GPPGPMGPPGLAGPPGESGR; 膚段 19:沈Q ID N0.19:TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK; 膚段20:沈Q ID N0.20:SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR; 膚段21:SEQ ID N0.21:GDGGPPGATGFPGAAGR; 膚段22:沈Q ID N0.22:VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK; 膚段23:沈Q ID N0.23:NGLPGGPGLR; 膚段24:沈Q ID N0.24:GPPGPMGPPGLAGPPGESGR; 膚段25:沈Q ID N0.25:GIPGPVGAAGATGAR; 膚段26:SEQ ID N0.26:GEAGPAGPAGPAGPR; 膚段27:SEQ ID N0.27:IGYAVGPAAVLDAAR; 膚段28:沈Q ID N0.28:GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR; 膚段29:沈Q ID N0.29:AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK; 膚段30:沈Q ID N0.30:AGPPGPPGPAGK; 膚段31:沈Q ID N0.31:GEPGPAGLPGPPGER; 膚段32:沈Q ID N0.32:GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR; 膚段33:SEQ ID N0.33:GETGHAGPAGPIGPVGAR; 膚段：M:沈Q ID N0.34:GPPGSAGAPGK; 膚段35:沈Q ID N0.35:(iLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR; 膚段36:沈Q ID N0.36:GETGPAGPAGPIGPVGAR; 膚段37:沈Q ID N0.37:SGETGASGPPGFVGEK; 膚段38:沈Q ID N0.38:GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR; 膚段39:沈Q ID N0.39:GPPGAGGPPGPR; 膚段40:沈Q ID N0.40:GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK; 膚段41:SEQ ID N0.41:DGASGHPGPIGPPGPR; 膚段42:沈Q ID N0.42:GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER; 膚段43:沈Q ID N0.43:GPPGESGAAGPTGPIGSR; 膚段44:沈Q ID N0.44:GPPGAGGPPGPR; 膚段45:沈Q ID N0.45:GVAGEPGRNGLPGGPGLR; 膚段46:沈Q ID N0.46:GESGAPGVPGIAGPR; 膚段47:沈Q ID N0.47:GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR; 膚段48:沈Q ID NO. 48: GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK; 膚段49:沈Q ID N0.49:PGEVGPPGPPGPAGEK; 膚段50:沈Q ID N0.50:GSTGEIGPAGPPGPPGLR。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述多膚，其特征在于，所述多膚對應(yīng)的m/z值及子離子分別為： 膚段 1:694.7; 膚段2:440.2; 膚段3:737.9; 膚段4:477.8; 膚段5:495.6; 膚段6:729.3; 膚段7:596.8; 膚段8:565.3; 膚段 9:611.6; 膚段 10:816.9; 膚段 11:387.7; 膚段 12:528.8; 膚段 13:511.6; 膚段 14:791.9; 膚段 15:777.9; 膚段 16:391.2; 膚段 17:604.8; 膚段 18:908.9; 膚段 19:923.5; 膚段20:659.3; 膚段21:737.3; 膚段22:605.3; 膚段23:485.7; 膚段24:601.0; 膚段25:634.3; 膚段26:631.3; 膚段27:722.4; 膚段28:1066.1; 膚段29:879.0; 膚段 30:517.8; 膚段 31:718.3; 膚段32:705.4; 膚段33:791.9; 膚段34:464.3; 膚段 35:711.0; 膚段36:780.9; 膚段37:746.9; 膚段38:700.0; 膚段 39:516.8; 膚段40:1169.1; 膚段41:500.9; 膚段42:727.3; 膚段43:790.9; 膚段 44:516.8; 膚段45:570.6; 膚段46:677.3; 膚段47:691.7; 膚段48:779.7; 膚段49:745.9; 膚段50:824.9。3.-種檢測阿膠及其制品中是否含有牛源性成分的檢測方法，所述方法包括如下步 驟： 步驟(1)，對待測樣本進行質(zhì)譜前處理，獲得待測多膚濾液： 步驟(2)，通過質(zhì)譜法檢測步驟（1)獲得的多膚濾液，檢測待測樣本中是否含有權(quán)利要 求1或2所述膚段的質(zhì)譜峰。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟（1)所述的對待測樣本進行質(zhì)譜 前處理，獲得待測多膚濾液的步驟如下： (1) 將待測樣品均質(zhì)成粉末狀態(tài)，稱取O.lg~〇.5g阿膠樣品或1.0~2.0g阿膠制品，加 入1 %畑祖0)3溶液，超聲處理10~30min使樣品完全溶解，定容至50血； (2) 溶液過0.22μπι濾膜； (3) 取10~20化化ypsin酶溶液（lygAiL的化ypsin酶溶液)加入到上述10化L~2(Κ)化濾 液中，37°C酶解16-18小時，待上機檢測。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)通過質(zhì)譜法檢驗步驟（1) 獲得的多膚濾液的方法是下述方法A或方法B: 方法A:采用AB SCIEX T「ipleTOF?5600質(zhì)譜檢測多膚濾液中是否含有權(quán)利要求1或2所 述的膚段的質(zhì)譜峰， 上機參數(shù)為： 流動相A: 0.05~0.2 %甲酸-乙臘溶液，流動相B: 0.05~0.2 %甲酸-水， 流速:0.1 ~0.5mL/min， T0F掃描范圍：100-3000Da， 正離子反應(yīng)模式，GS1:35，GS2:45，Curtain Gas: 35，ISVF: 5500，TEM: 500，DP: 100，CE: 10; 方法B:采用AB SCIEXS重四級桿質(zhì)譜檢測多膚濾液中是否含有權(quán)利要求1或2所述的 膚段的質(zhì)譜峰， 上機參數(shù)為： 流動相A: 0.05~0.2 %甲酸-乙臘，流動相B: 0.05~0.2 %甲酸-水， 流速:0.1 ~0.5mL/min， 電噴霧離子源，正離子反應(yīng)模式，檢測方式:MRM，噴霧電壓：5500V，離子傳輸管溫度： 475 °C ;銷氣壓力:40;輔助氣壓力:6。6. 使用權(quán)利要求1所述的各個多膚或其任意組合W檢測目標(biāo)阿膠及其制品樣本中是否 含有牛源性成分的方法，所述方法包括:質(zhì)譜法、高效液相色譜法、核磁共振法等。7. 權(quán)利要求1所述的各個多膚或其任意組合在檢測目標(biāo)阿膠及其制品樣本中是否含有 牛源性成分中的應(yīng)用，所述的阿膠制品包括但不限于阿膠糕、阿膠膏、阿膠漿、阿膠口服液、 阿膠糖、阿膠補血顆粒。
【文檔編號】C07K14/47GK105837676SQ201610158016
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月18日
【發(fā)明人】張曉梅, 張鴻偉, 鮑蕾, 梁成珠, 王境堂
【申請人】山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心