抗逆相關(guān)蛋白RtHKT1及其編碼基因與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了抗逆相關(guān)蛋白RtHKT1及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的抗逆相關(guān)蛋白RtHKT1，為如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；a2)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；a3)將a1)或a2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，蛋白質(zhì)RtHKT1可使酵母的抗逆性增強(qiáng)和/或鈉吸收量增加和/或鉀吸收量增加和/或轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子能力增加和/或轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子能力增加和/或鈉鉀離子比減小和/或耐低鉀性增強(qiáng)，對培育抗逆優(yōu)良的作物具有重要的理論意義和實(shí)用價值。
【專利說明】
抗逆相關(guān)蛋白RtHKTI及其編碼基因與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗逆相關(guān)蛋白RtHKTI及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 土壤鹽堿化已成為影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的嚴(yán)重問題，利用基因工程手段改良作物的耐鹽 堿能力，提高農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物對逆境的適應(yīng)能力是新品種培育亟需解決的關(guān)鍵問題和重 大問題。近年來，人們從生理、生化、代謝、生態(tài)、以及遺傳、進(jìn)化等角度對植物響應(yīng)鹽堿等逆 境脅迫的機(jī)制進(jìn)行了大量研究，積累了豐富的資料，特別是隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們能 夠在基因組成、表達(dá)調(diào)控及信號傳導(dǎo)等分子水平上認(rèn)識植物對鹽脅迫的耐逆性機(jī)理，為利 用基因工程手段改良植物的抗脅迫性能開拓了新的途徑。由于植物抗逆性狀的復(fù)雜性，采 用傳統(tǒng)的育種方法提高植物的抗逆性十分困難，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因工程手段開 辟了植物抗逆育種的新途徑，但高效抗逆基因的分離成為限制植物抗逆基因工程的主要因 素。
[0003] 珍稀泌鹽植物長葉紅砂（Reaumur i a t r i gy na Max im .)隸屬于檉柳科 (丁311^1'；^3〇636)琵琶柴屬(1^3111]1111^3 1^1111.)，又名黃花紅砂、黃花琵琶柴，為古地中海子 遺植物，被學(xué)術(shù)界稱為"活化石"，為亞洲中部亞區(qū)東阿拉善-西鄂爾多斯特有種，被列為內(nèi) 蒙古自治區(qū)珍稀瀕危物種，是荒漠草原和干草原地區(qū)的重要生態(tài)屏障和良好草場，對鹽漬 荒漠環(huán)境具有極強(qiáng)適應(yīng)性，在改良鹽堿地、防風(fēng)固沙等方面發(fā)揮重要作用。該植物作為一種 特有的泌鹽鹽生植物，其鹽腺分泌離子具有明顯的選擇性，且具有極強(qiáng)的耐鹽性。因此對該 植物的耐鹽分子機(jī)理研究，發(fā)現(xiàn)特有耐鹽調(diào)控因子，并系統(tǒng)挖掘耐鹽相關(guān)基因用于培育抗 逆優(yōu)良作物具有重要的理論意義和實(shí)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高抗逆性。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了 一種蛋白質(zhì)。
[0000]本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，名稱為蛋白質(zhì)RtHKTI，來源于長葉紅砂（Reaumuria trigyna Maxim.)。所述蛋白質(zhì)RtHKTI可為如下al)或a2)或a3):
[0007] al)氣基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白質(zhì)；
[0008] a2)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；
[0009] a3)將al)或a2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。
[0010]其中，序列表中序列2由619個氨基酸殘基組成。
[0011] 為了使a 1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或 羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0012] 表1標(biāo)簽的序列
[0013]
[0014] 上述a3)中的蛋白質(zhì)，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為 不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0015] 上述a3)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。
[0016] 上述a3)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列1自5'末端起第64至1923 位所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的 錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0017] 編碼所述蛋白質(zhì)RtHKTl的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0018]所述編碼蛋白質(zhì)RtHKTl的核酸分子，具體可為如下(bl)或(b2)或(b3)或(b4)所示 的DNA分子：
[0019] (bl)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0020] (b2)編碼區(qū)如序列表中序列1自5'末端起第64至1923位所示的DNA分子；
[0021] (b3)與(bl)或(b2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述蛋 白質(zhì)RtHKTl的DNA分子；
[0022] (b4)在嚴(yán)格條件下與（bl)或（b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質(zhì) RtHKTl 的 DNA 分子。
[0023] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可 以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0024]其中，序列表中序列1由1941個核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表 中序列2所示的氨基酸序列。
[0025] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方 法，對本發(fā)明的編碼所述蛋白質(zhì)RtHKTl的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有 與本發(fā)明分離得到的所述蛋白質(zhì)RtHKTl的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要 編碼所述蛋白質(zhì)RtHKTl，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0026] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發(fā) 明的編碼序列表的序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75%或更高， 或80 %或更高，或85 %或更高，或90 %或更高，或95 %或更高同一性的核苷酸序列。同一性 可以用肉眼或計算機(jī)軟件進(jìn)行評價。使用計算機(jī)軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以 用百分比（％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0027]含有編碼所述蛋白質(zhì)RtHKTl的核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基 因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0028]所述含有編碼所述蛋白質(zhì)RtHKTl的核酸分子的重組載體可為在表達(dá)載體的多克 隆位點(diǎn)插入序列表的序列1自5'末端起第64至1923位所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒。 [0029] 所述表達(dá)載體具體可為載體pYES2.0/ΝΤ。
[0030]所述含有編碼所述蛋白質(zhì)RtHKTl的核酸分子的重組載體具體可為在載體 PYES2 . Ο/NT的ΚρηI識別位點(diǎn)和XbaI識別位點(diǎn)之間插入序列表的序列1自5 '末端起第64至 1923位所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒pYES2. Ο-RtHKTl。
[0031]所述含有編碼所述蛋白質(zhì)RtHKTl的核酸分子的重組微生物可為將上述任一所述 含有編碼所述蛋白質(zhì)RtHKTl的核酸分子的重組載體導(dǎo)入出發(fā)微生物得到的重組菌。
[0032]所述含有編碼所述蛋白質(zhì)RtHKTl的核酸分子的重組微生物具體可為將所述重組 質(zhì)粒PYES2. Ο-RtHKTl導(dǎo)入出發(fā)微生物得到的重組菌。
[0033]所述出發(fā)微生物可為酵母。
[0034] 所述酵母具體可為酵母突變體AXT3。
[0035]所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系不包括繁殖材料。
[0036]所述蛋白質(zhì)RtHKTl、編碼所述蛋白質(zhì)RtHKTl的核酸分子或含有編碼所述蛋白質(zhì) RtHKTl的核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在dl)和/或d2)和/或 d3)和/或d4)和/或d5)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0037] dl)調(diào)控抗逆性；
[0038] d2)調(diào)控鈉吸收量和/或鉀吸收量；
[0039] d3)轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子和/或鉀離子；
[0040] d4)調(diào)控鈉鉀離子比；
[0041 ] d5)調(diào)控耐低鉀性。
[0042] 所述dl)中，所述調(diào)控抗逆性可為dla)或dlb):
[0043] dla)調(diào)控植物的抗逆性；
[0044] dlb)調(diào)控酵母的抗逆性。
[0045] 所述d2)中，所述調(diào)控鈉吸收量和/或鉀吸收量可為d2a)或d2b):
[0046] d2a)調(diào)控植物的鈉吸收量和/或鉀吸收量；
[0047] d2b)調(diào)控酵母的鈉吸收量和/或鉀吸收量。
[0048] 所述d3)中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子和/或鉀離子可為d3a)或d3b):
[0049] d3a)轉(zhuǎn)運(yùn)植物的鈉離子和/或鉀離子；
[0050] d3b)轉(zhuǎn)運(yùn)酵母的鈉離子和/或鉀離子。
[0051 ] 所述d4)中，所述調(diào)控鈉鉀離子比可為d4a)或d4b):
[0052] d4a)調(diào)控植物的鈉鉀離子比；
[0053] d4b)調(diào)控酵母的鈉鉀離子比。
[0054] 所述d5)中，所述調(diào)控耐低鉀性可為d5a)或d5b):
[0055] d5a)調(diào)控植物的耐低鉀性；
[0056] d5b)調(diào)控酵母的耐低鉀性。
[0057] 上述應(yīng)用中，所述酵母具體可為酵母突變體AXT3。
[0058]所述蛋白質(zhì)RtHKTl、編碼所述蛋白質(zhì)RtHKTl的核酸分子或含有編碼所述蛋白質(zhì) RtHKTl的核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，在培育抗逆性增強(qiáng) 和/或鈉吸收量增加和/或鉀吸收量增加和/或轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子能力增加和/或轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子能力 增加和/或鈉鉀離子比減小和/或耐低鉀性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因酵母中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0059] 上述應(yīng)用中，所述抗逆性可為抗鹽性。
[0060] 上述應(yīng)用中，所述耐低鉀性指的是在低鉀環(huán)境中的抗性增強(qiáng)，所述低鉀環(huán)境具體 為ImM K+以下的生長環(huán)境(如100μΜ K+的生長環(huán)境或ImM K+的生長環(huán)境）。
[0061 ]上述應(yīng)用中，所述鈉吸收量可為細(xì)胞質(zhì)的鈉吸收量和/或液泡的鈉吸收量和/或總 鈉吸收量。所述鉀吸收量可為細(xì)胞質(zhì)的鉀吸收量和/或液泡的鉀吸收量和/或總鉀吸收量。 所述鈉鉀離子比可為細(xì)胞質(zhì)的鈉鉀離子比和/或液泡的鈉鉀離子比和/或總鈉鉀離子比。
[0062] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種培育轉(zhuǎn)基因酵母的方法。
[0063] 本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因酵母的方法，可包括向受體酵母中導(dǎo)入編碼所述蛋白 質(zhì)RtHKTl的核酸分子，得到轉(zhuǎn)基因酵母的步驟;與所述受體酵母相比，所述轉(zhuǎn)基因酵母的抗 逆性增強(qiáng)和/或鈉吸收量增加和/或鉀吸收量增加和/或轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子能力增加和/或轉(zhuǎn)運(yùn)鉀 離子能力增加和/或鈉鉀離子比減小和/或耐低鉀性增強(qiáng)。
[0064]上述方法中，所述編碼所述蛋白質(zhì)RtHKTl的核酸分子可為如下(bl)或(b2)或(b3) 或(b4)所示的DNA分子：
[0065] (bl)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
[0066] (b2)編碼區(qū)如序列表中序列1自5'末端起第64至1923位所示的DNA分子；
[0067] (b3)與(bl)或(b2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述蛋 白質(zhì)RtHKTl的DNA分子；
[0068] (b4)在嚴(yán)格條件下與（bl)或（b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質(zhì) RtHKTl 的 DNA 分子。
[0069] 上述方法中，所述受體酵母可為酵母突變體AXT3。
[0070] 上述方法中，所述抗逆性可為抗鹽性。
[0071] 上述方法中，所述耐低鉀性指的是在低鉀環(huán)境中的抗性增強(qiáng)，所述低鉀環(huán)境具體 為ImM K+以下的生長環(huán)境(如100μΜ K+的生長環(huán)境或ImM K+的生長環(huán)境）。
[0072] 上述方法中，所述鈉吸收量可為細(xì)胞質(zhì)的鈉吸收量和/或液泡的鈉吸收量和/或總 鈉吸收量。所述鉀吸收量可為細(xì)胞質(zhì)的鉀吸收量和/或液泡的鉀吸收量和/或總鉀吸收量。 所述鈉鉀離子比可為細(xì)胞質(zhì)的鈉鉀離子比和/或液泡的鈉鉀離子比和/或總鈉鉀離子比。 [0073]實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)RtHKTl可使酵母的抗逆性增強(qiáng)和/或鈉吸收量 增加和/或鉀吸收量增加和/或轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子能力增加和/或轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子能力增加和/或鈉鉀 離子比減小和/或耐低鉀性增強(qiáng)。因此，本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)RtHKTl對培育抗逆優(yōu)良的作 物具有重要的理論意義和實(shí)用價值。
【附圖說明】
[0074] 圖1為重組質(zhì)粒pUC18-RtHKTl:GFP的元件示意圖。
[0075]圖2為RtHKTl基因亞細(xì)胞定位分析結(jié)果。
[0076]圖3為RtHKTl基因的表達(dá)模式。
[0077] 圖4為RtHKTl基因的表達(dá)模式。
[0078] 圖5為重組質(zhì)粒pYES2. Ο-RtHKTl的元件示意圖。
[0079]圖6轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的抗逆性鑒定。
[0080]圖7轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的抗逆性鑒定。
[0081 ]圖8轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的鈉離子和鉀離子的含量測定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0082]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0083]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0084] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0085] 以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0086] 載體pUC18_35Sp_GFP記載于如下文獻(xiàn)中：Chiu W，Niwa Y，Zeng W，Hirano T， KobayashiH,Sheen J.Engineered GFP as a vital reporter in plants[J].Current Biology Cb,1996,6(3):325-330.
[0087] 載體pYES2.0/NT(Mishra S，Alavilli H，Lee B，et al .Cloning and functional characterization of a vacuolar Na./H+antiporter gene from mungbean(VrNHXl)and its ectopic expression enhanced salt tolerance in Arabidopsis thaliana[J] ? PloS 〇1^，2014,9(10):6106678.)為11^1釷(^611公司產(chǎn)品。
[0088] 酵母突變體AXT3記載于如下文獻(xiàn)中：李平.大車前（Plantago major L. "Giant Turkish.")體外優(yōu)化再生體系的建立及Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 SeNHXl和TtNHXl的功能鑒 定[D].中國科學(xué)院植物研究所碩士學(xué)位論文，2005.
[0089] RNA Plant Plus Regen Kit為TaKaRa公司產(chǎn)品。M-MLV reverse transcriptase Kit為Invitrogen公司產(chǎn)品。pEASY-Tl載體為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄 號為CT101-0UTranstartR Green qPCR SuperMix為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品目 錄號為AQ141-02的試劑盒中的組件。單鏈鮭魚精DNA為阿拉丁公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號為 D119875。
[0090] 光暗交替培養(yǎng)即光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)交替，光暗交替培養(yǎng)的周期具體可為：16小時光 照培養(yǎng)/8小時黑暗培養(yǎng)。
[0091] Drop-Out液體培養(yǎng)基:將酵母氮源6.67g、右旋葡萄糖20g和氨基酸混合物1.03g溶 于1L蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值為5.8,121°C滅菌15min。酵母氮源為Solarbio公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號 為Y8040。氨基酸混合物的組成如表2所示。
[0092] 表2 10150mg的氨基酸混合物的組分
[0093]
[0094]
[0095] Urop-Uut回懷?首喬S:NL)rop-Uuty儀懷?首養(yǎng)基加入瓊脂粉，至其濃度為15g/L，得 到的培養(yǎng)基。
[0096] Yro液體培養(yǎng)基:將酵母提取物10g、胰蛋白胨20g和右旋葡萄糖20g溶于1L蒸餾水， 調(diào)節(jié)pH值為5.7，121°C滅菌15min。
[0097] MS液體培養(yǎng)基:將MS母液粉4.33g、蔗糖20g和嗎啉乙磺酸0.5g溶于1L蒸餾水，調(diào)節(jié) pH值為5 · 75，121 °C滅菌ISmiruMS母液粉為PhytoTechnology Laboratories公司產(chǎn)品，產(chǎn)品 目錄號為M524。
[0098] MS固體培養(yǎng)基：向MS液體培養(yǎng)基加入瓊脂粉，至其濃度為6.5g/L，得到的培養(yǎng)基。
[0099] 缺鉀的MS液體培養(yǎng)基：將NH4NO3 1650mg、MgS〇4 · 7H20 370mg、NH4H2P〇4 143.75mg、 CaCl2*2H2〇 440mg、MnS〇4*4H20 22.30mg、ZnS〇4*7H20 8.60mg、H3B03 6.20mg、NaI 0.75mg、Na2Mo〇4 · 2H20 0.25mg、CuS〇4 · 5H20 0.025mg、CoCl2 · 6H2O 0.025mg、FeS〇4 · 7H20 27·85mg、Na2EDTA37·25mg、肌醇100·00mg、VBl0·4mg、VB6 0·5mg、煙酸0·5mg、甘氨酸2·0mg 和鹿糖30g溶于1L蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至5.8。
[0100] 實(shí)施例1、高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白RtHKTi的編碼基因的克隆
[0101] 本發(fā)明的
【申請人】從長葉紅砂(Reaumuria trigyna Maxim.)中克隆出高親和性鉀 離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白RtHKTi的編碼基因，即RtHKTi基因。
[0102] 一、RtHKTi基因的cDNA全長序列的克隆
[0103] 1、采用RNA Plant Plus Regen Kit提取生長至40天的長葉紅砂幼苗的總RNA，然 后利用M-MLV reverse transcriptase Kit反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA。
[0104] 2、人工合成引物RtHKTl-2F: 5 ' -ACTTCTTAGTCTGTACATTTGGT-3 '（序列表中序列 1 自 5 ' 末端起第 1 至23位)和引物RtHKT 1-2R: 5 ' -CCACTGGCACGTGAACAATTAG-3 '（序列表中序列 1 自5'末端起第1920至1941位的反向互補(bǔ)序列）。
[0105] 3、完成步驟1和2后，以步驟1提取的cDNA為模板，以步驟2合成的引物RtHKTl-2F和 弓丨物RtHKT 1-2R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1941 bp的雙鏈DNA分子。
[0106] 4、將步驟3中得到雙鏈DNA分子連接至pEASY-Tl載體，得到重組質(zhì)粒甲。
[0107] 根據(jù)測序結(jié)果，重組質(zhì)粒甲含有序列表中的序列1所示的DNA分子，表達(dá)序列表中 序列2所示的高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白RtHKTl (以下簡稱蛋白質(zhì)RtHKTl或RtHKTl蛋白）。
[0108] 二、RtHKTl基因的克隆
[0109] 1、同步驟一中1。
[0110] 2、人丁合成引物RtHKTl-F:5'-CGCGGATCCATGCATAT(iCTGATC-3'（雙下創(chuàng)線為序列 表中序列 1 自 5 ' 末端起第64 至 78位)和引物RtHKT 1-R: 5 ' -GCGGAGCTCTTAGGACAGTTCCCAAG- 3'（雙下劃線為序列表中序列1自5'末端起第1907至1923位的反向互補(bǔ)序列）。
[0111] 3、完成步驟1和2后，以步驟1提取的cDNA為模板，以步驟2合成的引物RtHKTl-F和 引物RtHKT 1-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1874bp的雙鏈DNA分子。
[0112] 4、將步驟3中得到雙鏈DNA分子連接至pEASY-Tl載體，得到重組質(zhì)粒乙。
[0113]根據(jù)測序結(jié)果，重組質(zhì)粒乙含有序列表中的序列1自5'末端起第64至1923位所示 的DNA分子(即RtHKTl基因），表達(dá)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)RtHKTl。
[0114] 實(shí)施例2、RtHKTl蛋白的亞細(xì)胞定位
[0115] -、重組質(zhì)粒 pUC18_RtHKTl:GFP 的構(gòu)建
[0116] 1、同實(shí)施例1步驟一中1。
[0117] 2、人工合成引物肚邢11，(；〇1-?:5'-(^八丁66六丁(^六丁八1觀1^冗八171似-3'（單下 劃線為限制性內(nèi)切酶Ncol的識別序列，雙下劃線為序列表中序列1自5'末端起第64至84位） 和引物RtHKT 1 -NcoI-R: 5 ' -CCCATGGGGACAGTTCCCAAGCTTT-3 '（單下劃線為限制性內(nèi)切酶 Ncol的識別序列，雙下劃線為序列表中序列1自5'末端起第1903至1920位的反向互補(bǔ)序 列)。
[0118] 3、完成步驟1和2后，以步驟1提取的cDNA為模板，以步驟2合成的引物RtHKTl-Nco I-F和引物RtHKT 1 -Nco I-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1871 bp的雙鏈DNA分子;然后進(jìn)行純 化、回收，得到DNA片段。
[0119] 4、用限制性內(nèi)切酶Ncol單酶切步驟3得到的DNA片段，然后回收酶切產(chǎn)物。
[0120] 5、用限制性內(nèi)切酶此〇1單酶切載體?1](：18-353?-6??，回收約3.91〇3的載體骨架。
[0121] 6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pUC18-RtHKTl: GFP。重組質(zhì)粒pUC18-RtHKTl:GFP的元件示意圖如圖1所示，其中35Sp為CaMV 35S啟動子， RtHKTl為不含終止子的RtHKTl基因，NOSt為胭脂堿合酶終止子，GFP為綠色熒光蛋白的編碼 基因。
[0122] 根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pUC18-RtHKTl:GFP進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：向載體pUC18- 35 Sp-GFP的限制性內(nèi)切酶Nco I的識別位點(diǎn)之間插入序列表的序列1自5 '末端起第64至19 20 位所示的DNA分子。
[0123] 二、RtHKTl蛋白的亞細(xì)胞定位
[0124] 1、采用基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Zheng L L，Gao Z，Wang J，et al .Molecular cloning and functional characterization of a novel CBL-interacting protein kinase NtCIPK2in the halophyte Nitrariatangutorum[J].Genetics and Molecular Research，2014，13(3) :4716-4728.),將重組質(zhì)粒pUC18-RtHKTl:GFP轉(zhuǎn)化洋蔥的內(nèi)表皮細(xì) 胞。
[0125] 2、取轉(zhuǎn)化后的洋蔥，置于MS固體培養(yǎng)基，室溫暗培養(yǎng)24h。
[0126] 3、完成步驟2后，用鑷子撕下所述洋蔥的內(nèi)表皮細(xì)胞，置于載玻片上，在激光共聚 焦顯微鏡下觀察。
[0127] 按照上述方法，將重組質(zhì)粒pUC18-RtHKTl:GFP替換為載體pUC18-35Sp-GFP，其它 步驟均不變，在共聚焦顯微鏡下觀察，作為對照。
[0128] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2 (A和D為藍(lán)光，B和E為明場，C和F為藍(lán)光和明場的疊加，A、B和C為載 體pUC18-35Sp-GFP，D、E和F為重組質(zhì)粒pUC18-RtHKTl:GFP)。結(jié)果表明，RtHKTl蛋白定位在 細(xì)胞膜上。
[0129] 實(shí)施例3、RtHKTl基因在不同逆境脅迫下的表達(dá)模式
[0130] 一、不同濃度NaCl處理下RtHKTl基因的表達(dá)模式
[0131] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)的步驟如下：
[0132] 1、取長葉紅砂種子，用10% (質(zhì)量百分比）次氯酸鈉水溶液浸泡10min以進(jìn)行表面 滅菌，然后播種于MS固體培養(yǎng)基并置于溫度為22°C、濕度為70%的條件下，光暗交替培養(yǎng)30 天。
[0133] 2、完成步驟1后，取長勢基本一致的長葉紅砂幼苗，置于MS液體培養(yǎng)基中，22°C光 暗交替培養(yǎng)7天。
[0134] 3、取完成步驟2的長葉紅砂幼苗，置于MS液體培養(yǎng)基中處理2h(每次處理5株），然 后采用RNA Plant Plus Regen Kit分別提取每株長葉紅砂幼苗總RNA，然后利用M-MLV reverse transcriptase Kit反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，命名為正常處理的cDNA，正常處理的 cDNA中DNA的濃度為50ng/yL。
[0135] 按照上述步驟3,將"MS液體培養(yǎng)基"替換為"含100mMNaCl的MS液體培養(yǎng)基"、"含 200mMNaCl的MS液體培養(yǎng)基"、"含300mMNaCl的MS液體培養(yǎng)基"或"含400mMNaCl的MS液體培 養(yǎng)基"，其它步驟均不變，依次得到100mMNaCl處理的cDNA、200mMNaCl處理的cDNA、 300mMNaCl 處理的 cDNA 和400mMNaCl 處理的 cDNA。
[0136] 4、通過實(shí)時熒光定量PCR檢測步驟3得到的各cDNA中RtHKTl基因的相對表達(dá)量（以 β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，β-Actin基因記載與如下文獻(xiàn)中：董祿祿，秦曉春，黨振華.長葉紅 砂液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆及表達(dá)特性[J].西北植物學(xué)報，2015，35( 11) "2164-2170.)，然后取平均值，得到平均相對表達(dá)量。鑒定RtHKTl基因的引物為5'- TTACGGTCCTGATGCTGTTAGGT-3'和5'-ATGGTTTGTGGTCGGCTTG-3'。鑒定β-Actin基因的引物為 5 '-GGAATCCACGAGACCACCTACA-3 ' 和
[0137] 5 '-GATTGATCCTCCGATCCAGACA-3 '。
[0138] 反應(yīng)體系（20yL): 10yL TranstartR Green qPCR SuperMix、8·2yL ddH2〇、lyL步 驟3得到的cDNA(作為模板），0.4yL上游引物(含0.2μΜ引物）和0.4Λ下游引物（含0.2μΜ引 物）。反應(yīng)程序:95 °C預(yù)變性30s; 94°C變性5s，58 °C退火15s，72 °C延伸10s，48個循環(huán)。溶解曲 線從65~95°C。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用2-Δ Δ Ct法進(jìn)行分析，利用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及繪圖。
[0139] 與正常處理的cDNA中的RtHKTl基因的平均相對表達(dá)量相比，lOOmM NaCl處理的 cDNA、200mM NaCl處理的cDNA、300mM NaCl處理的cDNA和400mM NaCl處理的cDNA中的 RtHKTl基因的平均相對表達(dá)量見圖3中A。結(jié)果表明，RtHKTl基因的相對表達(dá)量受NaCl脅迫 的誘導(dǎo)，在不同濃度NaCl脅迫下，RtHKTl基因均顯著下調(diào)表達(dá)，可能通過抑制RtHKTl介導(dǎo)的 Na+吸收來降低根部Na+濃度。
[0140] 二、NaC 1處理不同時間下RtHKT 1基因的表達(dá)模式
[0141] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)的步驟如下：
[0142] 1、同步驟一中1。
[0143] 2、同步驟一中2。
[0144] 3、模板的獲得
[0145] (1)取完成步驟2的長葉紅砂幼苗5株，采用RNA Plant Plus Regen Kit分別提取 每株長葉紅砂幼苗總RNA，然后利用M-MLV reverse transcriptase Kit反轉(zhuǎn)錄出第一鏈 cDNA，命名為對照處理的cDNA，對照處理的cDNA中DNA的濃度為50ng/yL。
[0146] (2)取完成步驟2的長葉紅砂幼苗，置于含200mMNaCl的MS液體培養(yǎng)基中處理lh (每 次處理5株），采用RNA Plant Plus Regen Kit分別提取每株長葉紅砂幼苗總RNA，然后利用 M-MLV reverse transcriptase Kit反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，命名為cDNAl，cDNAl中DNA的濃 度為 50ng/yL。
[0147] 按照上述步驟（2)，將"處理lh"替換為"處理3h" "處理6h"和"處理12h"或"處理 24h"，其它步驟均不變，依次得到cDNA2、cDNA3、cDNA4和cDNA5。
[0148] 4、同步驟一中4。
[0149] 對照處理的cDNA、cDNAl、cDNA2、cDNA3、cDNA4和cDNA5中的RtHKTl基因的相對表達(dá) 量見圖3中B，結(jié)果表明，在200mM NaCl脅迫條件下，隨著脅迫時間的延長，RtHKTl基因的平 均相對表達(dá)量迅速增加，到處理1小時達(dá)到最大值，RtHKTl基因之后的平均相對表達(dá)量逐漸 降低。
[0150] 三、不同濃度KC1處理下RtHKTl基因的表達(dá)模式
[0151] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)的步驟如下：
[0152] 1、同步驟一中1。
[0153] 2、同步驟一中2。
[0154] 3、取完成步驟2的長葉紅砂幼苗，置于MS液體培養(yǎng)基中處理24h(每次處理5株），然 后采用RNA Plant Plus Regen Kit分別提取每株長葉紅砂幼苗總RNA，然后利用M-MLV reverse transcriptase Kit反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，命名為正常處理的cDNA，即control。
[0155] 按照上述步驟3，將"MS液體培養(yǎng)基"替換為"缺鉀的MS液體培養(yǎng)基"、"含0.1 mM KC1 的MS液體培養(yǎng)基"、"含10mM KC1的MS液體培養(yǎng)基"、"含25mM KC1的MS液體培養(yǎng)基"、"含50mM KC1的MS液體培養(yǎng)基"、"含lOOmM KC1的MS液體培養(yǎng)基"、"含200mM KC1的MS液體培養(yǎng)基"或 "含300mM KC1的MS液體培養(yǎng)基"，其它步驟均不變，依次得到OmM KC1處理的cDNA、0.1mM KC1 處理的cDNA、10mM KC1 處理的cDNA、25mM KC1 處理的cDNA、50mM KC1 處理的cDNA、lOOmM KC1 處理的cDNA、200mM KC1 處理的cDNA和300mM KC1 處理的cDNA。
[0156] 4、同步驟一中4。
[0157] 正常處理的cDNA、0mM KC1處理的cDNA、0.1 mM KC1處理的cDNA、10mMKCl處理的 cDNA、25mMKCl 處理的 cDNA、50mMKCl 處理的 cDNA、100mMKCl 處理的 cDNA、200mMKCl 處理的 cDNA和300mMKCl處理的cDNA中的RtHKTl基因的相對表達(dá)量見圖4中A，結(jié)果表明，缺鉀脅迫 (OmM KC1處理)和低鉀處理(O.l-lOmM KC1處理)能顯著誘導(dǎo)RtHKTl基因的表達(dá)，隨著KC1濃 度的增加，RtHKTl基因的相對表達(dá)量顯著增加，在10mM KC1處理時其相對表達(dá)量達(dá)到最高； 高鉀處理(25-300mM KC1處理)時，在25mM KC1處理時表達(dá)量最低，繼續(xù)增加 KC1濃度其表達(dá) 量開始趨于穩(wěn)定。以上結(jié)果表明，在K+含量極低的生長環(huán)境下仍能有效攝入K+，即RtHKTl基 因?qū)τ贙+具有高度親和性，屬于高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
[0158] 四、KC1處理不同時間下RtHKTl基因的表達(dá)模式
[0159] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)的步驟如下：
[0160] 1、同步驟一中1。
[0161] 2、同步驟一中2。
[0162] 3、模板的獲得
[0163] (1)取完成步驟2的長葉紅砂幼苗5株，采用RNA Plant Plus Regen Kit分別提取 每株長葉紅砂幼苗總RNA，然后利用M-MLV reverse transcriptase Kit反轉(zhuǎn)錄出第一鏈 cDNA，命名為對照處理的cDNA，對照處理的cDNA中DNA的濃度為50ng/yL。
[0164] (2)取完成步驟2的長葉紅砂幼苗，置于含lOmMKCl的MS液體培養(yǎng)基中處理lh (每次 處理5株），采用RNA Plant Plus Regen Kit分別提取每株長葉紅砂幼苗總RNA，然后利用M- MLV reverse transcriptase Kit反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，命名為cDNAl，cDNAl中DNA的濃度 為50ng/yL。
[0165] 按照上述步驟（2)，將"處理lh"替換為"處理3h" "處理6h"和"處理12h"或"處理 24h"，其它步驟均不變，依次得到cDNA2、cDNA3、cDNA4和cDNA5。
[0166] 4、同步驟一中4。
[0167] 對照處理的cDNA、cDNAl、cDNA2、cDNA3、cDNA4和cDNA5中的RtHKTl基因的相對表達(dá) 量見圖4中B。結(jié)果表明，在1 OmMKC 1脅迫條件下，隨著脅迫時間的延長，RtHKT 1基因的相對表 達(dá)量迅速增加，到處理lh達(dá)到最大值，處理3~12h之間RtHKTl基因的相對表達(dá)量逐漸降低， 12h之后RtHKTl基因的相對表達(dá)量又顯著增加，說明該基因在低鉀環(huán)境下，可能參與K+的快 速吸收，短期的表達(dá)量提高為植物適應(yīng)長期脅迫提供信號。
[0168] 實(shí)施例4、轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的獲得
[0169] 一、重組質(zhì)粒 pYES2 · Ο-RtHKTl 的構(gòu)建
[0170] 1、同實(shí)施例1步驟一中1。
[0171] 2、人工合成引物肚服11-1^111-卩:5' -CGGGGTACCAT€CATATG(iTCATGAT-3 '（單下劃 線為限制性內(nèi)切酶ΚρηΙ的識別序列，雙下劃線為序列表中序列1自5'末端起第64至80位)和 引物RtHKT 1 -XbaI-R: 5 ' -GCTCTAGATTAGGACAGTTCCC-3 '（單下劃線為限制性內(nèi)切酶XbaI 的 識別序列，雙下劃線為序列表中序列1自5'末端起第1910至1923位的反向互補(bǔ)序列）。
[0172] 3、完成步驟1和2后，以步驟1提取的cDNA為模板，以步驟2合成的引物RtHKTl-Kpn I-F和引物RtHKT 1 -Xba I-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1874bp的雙鏈DNA分子。
[0173] 4、用限制性內(nèi)切酶ΚρηΙ和Xbal雙酶切步驟3得到的雙鏈DNA分子，然后回收酶切產(chǎn) 物。
[0174] 5、用限制性內(nèi)切酶ΚρηΙ和Xbal雙酶切載體pYES2.0/ΝΤ，回收約6. Okb的載體骨架。
[0175] 6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pYES2.0-RtHKTl。 重組質(zhì)粒PYES2.0-RtHKTl的元件示意圖如圖5所示。
[0176] 根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pYES2.0-RtHKTl進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：向載體pYES2.0/ NT的限制性內(nèi)切酶ΚρηΙ的識別序列和Xbal的識別序列之間插入序列表的序列1自5'末端起 第64至1923位所示的DNA分子。
[0177] 二、轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的獲得
[0178] (1)取酵母突變體AXT3的單菌落，接種于100mL YH)液體培養(yǎng)基，然后30°C、200rpm 培養(yǎng)至菌液的〇D6QQnm值在0.4~0.6之間。
[0179] (2)完成步驟(1)后，取所述菌液，4000rpm離心10min，收集沉淀1。
[0180] (3)完成步驟(2)后，取所述沉淀1，先用lmL無菌水洗滌1次，再用lmL 0.1M乙酸鋰 水溶液洗滌1次，最后用lmL 0.1M乙酸鋰水溶液重懸，30°C靜置培養(yǎng)30min，用EP管分裝，每 管250yL。
[0181] (4)完成步驟（3)后，取所述EP管，離心，得到沉淀2。向沉淀2中加入240yL 50% PEG-4000、36yL 1M乙酸鋰水溶液、50yg單鏈鮭魚精DNA和5yL重組質(zhì)粒pYES2.0-RtHKTl，然 后用無菌水補(bǔ)充至總體積為3 50yL，得到體系。
[0182] (5)完成步驟（4)后，取所述體系，先渦旋振蕩2min，充分混勻，30°C靜置培養(yǎng) 30min;然后42 °C熱激15min，離心，得到沉淀3。
[0183] (6)完成步驟(5)后，取所述沉淀3,用0. lmL無菌水重懸，然后均勾涂布于Drop-Out 固體培養(yǎng)基上，30°C倒置培養(yǎng)，2~4天。
[0?84] (7)完成步驟(6)后，隨機(jī)挑選Drop-Out固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種于5mL Drop- 〇ut液體培養(yǎng)基，30°C、250rpm培養(yǎng)24h，得到培養(yǎng)菌液，離心，得到沉淀4。
[0185] (8)完成步驟⑴后，取所述沉淀4，加入10yL溶菌酶，禍旋震蕩均勾，37°C、250rpm 震蕩培養(yǎng)30min。
[0186] (9)完成步驟(8)后，取所述培養(yǎng)菌液，加入20yL的10 % (質(zhì)量百分比）的SDS水溶 液，渦旋震蕩混勻，然后交替置于液氮和沸水浴中，重復(fù)凍融3~4次（目的為徹底破碎細(xì)胞 壁），然后加無菌水至200yL。
[0187] (10)完成步驟(9)后，取所述培養(yǎng)菌液，加入200yL苯酚:氯仿：異戊醇（體積比為 25:24:1)，禍旋震蕩5min，12000rpm離心10min，收集上清1。
[0188] (11)完成步驟（10)后，取所述上清1，加入8yL的10M的醋酸銨水溶液和500yL無水 乙醇，-20°C放置lh，12000rpm離心10min，收集沉淀5,真空干燥后，用20yL無菌水溶解沉淀 5,得到溶解液。
[0189] (12)完成步驟（10)后，以所述溶解液為模版，以步驟一人工合成的引物RtHKTl- Kpnl-F和引物RtHKTl-Xbal-R為引物，得至IjPCR擴(kuò)增產(chǎn)物;如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有大小 為1874bp的DNA片段，則步驟(7)隨機(jī)挑選的單菌落為轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母。
[0190]三、轉(zhuǎn)空載體酵母的獲得
[0191]按照上述步驟二的方法，將步驟（4)中重組質(zhì)粒pYES2.0-RtΗKT1替換為載體 pYES2.0/NT，其他步驟均相同，得到轉(zhuǎn)空載體酵母。
[0192] 四、轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的抗性鑒定
[0193] 1、轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的耐低鉀性
[0194] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)的具體步驟如下：
[0195] (1)取步驟二獲得的轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的單菌落，接種于5mLDrop-〇ut液體培養(yǎng) 基，30°C培養(yǎng)72h，然后用Drop-Out液體培養(yǎng)基稀釋至0D600為0.5，得到菌液1。
[0196] (2)取步驟（1)得到的菌液1，用Drop-Out液體培養(yǎng)基分別稀釋10倍、100倍和1000 倍，依次得到菌液2、菌液3和菌液4。
[0197] (3)取步驟（2)得到的5yL菌液（菌液1、菌液2、菌液3或菌液4)，均勻涂布于Drop- Out固體培養(yǎng)基（對照）、含100μΜ KC1的Drop-Out固體培養(yǎng)基、含ImM KC1的Drop-Out固體培 養(yǎng)基、含10mM KC1的Drop-Out固體培養(yǎng)基、含50mM KC1的Drop-Out固體培養(yǎng)基、含200mM KC1的Drop-Out固體培養(yǎng)基或含500mM KC1的Drop-Out固體培養(yǎng)基，30 °C倒置培養(yǎng)2天，觀察 不同濃度KC1處理下轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的生長狀態(tài)。
[0198] 按照上述步驟，將轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母替換為轉(zhuǎn)空載體酵母，其它步驟均不變，觀察 不同濃度KC1處理下轉(zhuǎn)空載體酵母的生長狀態(tài)。
[0199] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6(RtHKTl為轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母，pYES2為轉(zhuǎn)空載體酵母，K+為KCllO 0為菌液1，101為菌液2，102為菌液3，104為菌液4)。結(jié)果如下：在Drop-Out固體培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn) RtHKTl基因酵母和轉(zhuǎn)空載體酵母均能正常生長;在含100μΜ KC1的Drop-Out固體培養(yǎng)基上 或含ImM KC1的Drop-Out固體培養(yǎng)基上(低鉀處理?xiàng)l件下），轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的生長狀況 明顯好于轉(zhuǎn)空載體酵母，可見RtHKTl基因能夠明顯恢復(fù)酵母突變體AXT3的生長缺陷；在含 10mM KC1的Drop-Out固體培養(yǎng)基、含50mM KC1的Drop-Out固體培養(yǎng)基、含200mM KC1的 Drop-Out固體培養(yǎng)基或含500mM KC1的Drop-Out固體培養(yǎng)基上（高鉀處理?xiàng)l件下），轉(zhuǎn)空載 體酵母和轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的生長均受到一定程度的抑制且濃度越高抑制程度越大，在相 同KC1濃度處理下，轉(zhuǎn)空載體酵母的抑制程度更加明顯。結(jié)果表明，RtHKTl基因?qū)Φ外浭?敏感，受低鉀的誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)RtHKT 1基因酵母的耐低鉀性增強(qiáng)，所述耐低鉀性指的是轉(zhuǎn)RtHKT 1基 因酵母在低鉀環(huán)境中的抗性增強(qiáng)，低鉀環(huán)境具體為ImM K+以下的生長環(huán)境。
[0200] 2、轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的抗逆性
[0201 ]實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)的具體步驟如下：
[0202] (1)同步驟 1中（1)。
[0203] (2)同步驟 1 中（2)。
[0204] (3)取步驟（2)得到的5yL菌液（菌液1、菌液2、菌液3或菌液4)，均勻涂布于Drop- Out固體培養(yǎng)基上（對照）、含lOOmM NaCl的Drop-Out固體培養(yǎng)基、含300mM NaCl的Drop-Out 固體培養(yǎng)基、含500mM NaCl的Drop-Out固體培養(yǎng)基或含700mM NaCl的Drop-Out固體培養(yǎng)基 上，30°C倒置培養(yǎng)2天，觀察不同濃度NaCl處理下轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的生長狀態(tài)。
[0205]按照上述步驟，將轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母替換為轉(zhuǎn)空載體酵母，其它步驟均不變，觀察 不同濃度NaCl處理下轉(zhuǎn)空載體酵母的生長狀態(tài)。
[0206] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7(RtHKTl為轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母，pYES2為轉(zhuǎn)空載體酵母，Na+為NaCl， 10°為菌液1，101為菌液2，102為菌液3，104為菌液4)。結(jié)果如下:轉(zhuǎn)空載體酵母在不同濃度的 NaCl脅迫下生長均受到不同程度的抑制，且脅迫濃度越高，生長抑制越嚴(yán)重，在700mM NaCl 脅迫時幾乎不能生長。而轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母在含100~500mM NaCl脅迫下生長狀況與在 Drop-Out固體培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)無顯著差別。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的抗鹽性增 強(qiáng)，RtHKTl基因在高鈉環(huán)境能夠轉(zhuǎn)運(yùn)Na+，且能顯著減輕Na+對酵母突變體AXT3的毒害。
[0207] 3、轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母在KC1或NaCl脅迫下的離子含量測定
[0208] A、KC1脅迫條件下的離子含量測定
[0209] (1)取酵母(轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母或轉(zhuǎn)空載體酵母或酵母突變體AXT3)單菌落，接種 于5mLDrop-〇ut液體培養(yǎng)基中，30°C震蕩培養(yǎng)72h，然后用Drop-Out液體培養(yǎng)基稀釋至0D600 為0.5,得到菌液1。
[0210] ⑵取步驟（1)得到的5yL菌液1，接種于50mL含ImM KC1的Drop-Out液體培養(yǎng)基中， 30°C震蕩培養(yǎng)72h。
[0211] (3)完成步驟（2)后，參考文獻(xiàn)(Mishra S，Alavilli H，Lee B，et al.Cloning and functional characterization of a vacuolar Na+/H+antiporter gene from mungbean (VrNHXl)and its ectopic expression enhanced salt tolerance in Arabidopsis thaliana[J] .PloS one,2014,9(10) :e 106678.)中的方法測定酵母細(xì)胞質(zhì)中的鈉離子及鉀 離子含量、酵母液泡中的鈉離子及鉀離子含量，和酵母的總鈉離子及總鉀離子含量。
[0212] B、NaCl脅迫條件下的離子含量測定
[0213] 將步驟A中⑵所述"含ImM KC1的Drop-Out液體培養(yǎng)基"替換為"含500mM NaCl的 Drop-Out液體培養(yǎng)基"，其它步驟均不變，得到酵母在NaCl脅迫下的離子含量測定。
[0214] C、正常條件下的的離子含量測定
[0215] 將步驟A中⑵所述"含ImM KC1的Drop-Out液體培養(yǎng)基"替換為"Drop-Out液體培 養(yǎng)基"，其它步驟均不變，得到酵母在正常條件下的離子含量測定。
[0216] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8(YPG為正常條件下，即在Drop-Out液體培養(yǎng)基;YPG+NaCl為NaCl脅 迫條件下，即在含500mM NaCl的Drop-Out液體培養(yǎng)基;YPG+KC1為KC1脅迫條件下，即在含 ImM KC1的Drop-Out液體培養(yǎng)基；pYES-空為轉(zhuǎn)空載體酵母，pYES-RtHKT為轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵 母）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)空載體酵母和酵母突變體AXT3中，細(xì)胞質(zhì)中的鈉離子及鉀離子含量、酵母 液泡中的鈉離子及鉀離子含量，和，酵母的總鈉離子及總鉀離子含量均無顯著差異。在 500mM NaCl脅迫處理下，與轉(zhuǎn)空載體酵母相比，轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的細(xì)胞質(zhì)中的鈉離子及 鉀離子含量、液泡中的鈉離子及鉀離子含量，和酵母的總鈉離子及總鉀離子含量均顯著增 加，但細(xì)胞質(zhì)的鈉鉀離子比、液泡的鈉鉀離子比和總鈉鉀離子比均降低，說明該基因?qū)τ诟?鹽脅迫具有極強(qiáng)的適應(yīng)性，并且能夠降低其細(xì)胞體內(nèi)的Na+/k+比，進(jìn)而使其具有較強(qiáng)的耐鹽 性。在ImM KC1脅迫處理下，與轉(zhuǎn)空載體酵母相比，轉(zhuǎn)RtHKTl基因酵母的細(xì)胞質(zhì)中的鈉離子 及鉀離子含量、液泡中的鈉離子及鉀離子含量，和酵母的總鈉離子及總鉀離子含量均顯著 增加，但細(xì)胞質(zhì)的鈉鉀離子比、液泡的鈉鉀離子比和總鈉鉀離子比均降低，說明該基因在低 鉀環(huán)境下能有效攝入K+，并且能夠降低其細(xì)胞體內(nèi)的Na+/k+比，進(jìn)而使其對低鉀環(huán)境具有極 強(qiáng)的適應(yīng)性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 蛋白質(zhì)，為如下al)或a2)或a3): al)氣基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白質(zhì)； a2)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)； a3)將al)或a2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子。3. 如權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子為如下(bl)或(b2)或(b3) 或(b4)所示的DNA分子： (bl)序列表中序列1所示的DNA分子； (b2)編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端起第64至1923位所示的DNA分子； (b3)與（bl)或(b2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼權(quán)利要求1 所述蛋白質(zhì)的DNA分子； (b4)在嚴(yán)格條件下與(bl)或(b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1所述蛋白 質(zhì)的DNA分子。4. 含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。5. (：1)或〇2)的應(yīng)用： cl)權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)，或，權(quán)利要求2或3所述核酸分子，或，含有權(quán)利要求2或3所 述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，在dl)和/或d2)和/或d3)和/ 或d4)和/或d5)中的應(yīng)用； dl)調(diào)控抗逆性； d2)調(diào)控鈉吸收量和/或鉀吸收量； d3)轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子和/或鉀離子； d4)調(diào)控鈉鉀離子比； d5)調(diào)控耐低鉀性； c2)權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)，或，權(quán)利要求2或3所述核酸分子，或，含有權(quán)利要求2或3所 述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，在培育抗逆性增強(qiáng)和/或鈉 吸收量增加和/或鉀吸收量增加和/或轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子能力增加和/或轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子能力增加和/ 或鈉鉀離子比減小和/或耐低鉀性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因酵母中的應(yīng)用。6. -種培育轉(zhuǎn)基因酵母的方法，包括向受體酵母中導(dǎo)入編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的 核酸分子，得到轉(zhuǎn)基因酵母的步驟;與所述受體酵母相比，所述轉(zhuǎn)基因酵母的抗逆性增強(qiáng) 和/或鈉吸收量增加和/或鉀吸收量增加和/或轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子能力增加和/或轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子能力 增加和/或鈉鉀離子比減小和/或耐低鉀性增強(qiáng)。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子 為如下(bl)或(b2)或(b3)或(b4)所示的DNA分子： (bl)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子； (b2)編碼區(qū)如序列表中序列1自5'末端起第64至1923位所示的DNA分子； (b3)與（bl)或(b2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼權(quán)利要求1 所述蛋白質(zhì)的DNA分子； (b4)在嚴(yán)格條件下與(bl)或(b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1所述蛋白 質(zhì)的DNA分子。8. 如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述受體酵母為酵母突變體AXT3。9. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，或，權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述抗逆性為 抗鹽性。10. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，或，權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于： 所述鈉吸收量為細(xì)胞質(zhì)的鈉吸收量和/或液泡的鈉吸收量和/或總鈉吸收量;所述鉀吸 收量為細(xì)胞質(zhì)的鉀吸收量和/或液泡的鉀吸收量和/或總鉀吸收量;所述鈉鉀離子比為細(xì)胞 質(zhì)的鈉鉀離子比和/或液泡的鈉鉀離子比和/或總鈉鉀離子比。
【文檔編號】A01H5/00GK105837672SQ201610413076
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】王迎春, 李寧寧, 鄭琳琳, 董碌碌
【申請人】內(nèi)蒙古大學(xué)