天然黃酮Anastatin B的衍生物及制備和應用
【專利摘要】本發(fā)明屬于新化合物制備和藥物領域，涉及天然黃酮Anastatin B的衍生物及制備和應用，具體是兩個黃酮的衍生物制備及其在制備抗氧化和抗肝損傷藥物中的應用，結構式如下。本發(fā)明首次合成出天然黃酮Anastatin B的兩個衍生物，并首次利用體外化學評價法和細胞氧化損傷模型評價了化合物1和2的抗氧化活性，并運用CCl4誘導的小鼠肝損傷模型評價這兩個化合物的保肝活性。
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于新化合物制備方法及藥物領域，尤其是天然黃酮Anastatin B的兩個 衍生物的制備及其在制備抗氧化和抗肝損傷藥物中的應用。 天然黃酮Anastat i n B的衍生物及制備和應用
【背景技術】
[0002] Anastatin B是含生草(Anastatica hierochuntica)中提取得到的一種黃酮類化 合物，有報道顯示Anastatin B衍生物具有良好的抗氧化活性，并對大鼠的原代肝細胞損傷 具有一定保護作用，有一定程度的對抗D-GalN誘導損傷的能力，在抗肝損傷藥物研究領域 也有應用。
[0003] 由于Anastatin B本身具有良好的生物活性，所以可通過研究Anastatin B的衍生 物來尋找更好的抗氧化和抗肝損傷藥物。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供兩個黃酮的衍生物制備及其在制備抗氧化和抗肝損傷藥 物中的應用，本發(fā)明合成出天然黃酮Anastatin B的兩個衍生物1和2,這兩個衍生物具有較 好的抗氧化活性及抗肝損傷活性，合成和純化方法簡單。
[0005] 本發(fā)明所述Anastatin B的兩個衍生物1和2具有抗氧化活性，可以用于抗氧化治 療，可應用于制備抗氧化藥物;所述天然黃酮Anastatin B的兩個衍生物1和2具有抗肝損傷 活性，可應用于制備抗肝損傷藥物。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0007] Anastatin B衍生物的結構式如下：
[0008]
[0009] 而且，所述衍生物為4，8，9-三羥基-2-(4-羥基芐基)-2H-苯并呋喃并[2，3-g]苯并 呋喃-3-酮，（Z)-4,8,9-三羥基-2-(4-羥基亞芐基）-2H-苯并呋喃并[2,3-g]苯并呋喃-3-酮。
[00?0] Anastatin B兩個衍生物的制備。
[0011]
[0012] 兩個衍生物在制備治療抗氧化和抗肝損傷藥物中的應用。所述化合物對抗氧化活 性進行評價，結果表明此類化合物有抗氧化活性，同時所述化合物對保肝活性進行評價，結 果表明此類化合物有抗肝損傷活性。
[0013] 兩個衍生物在制備治療抗氧化和抗肝損傷藥物中的應用。所述化合物用作制備治 療肝損傷藥物和抗氧化藥物。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果：
[0015] 1、本發(fā)明合所述的Anastatin B的兩個衍生物1和2的合成、純化方法簡單。這類衍 生物具有抗氧化和抗肝損傷活性，本發(fā)明開拓了一類新型抗氧化和抗肝損傷藥物的研究方 向。
[0016] 2、所述的Anastatin B的兩個衍生物1和2的制備及其在制備抗氧化和抗肝損傷藥 物中的應用，其特征在于:所述化合物對抗氧化活性進行評價，結果表明此類化合物有抗氧 化活性，同時所述化合物對保肝活性進行評價，結果表明此類化合物有抗肝損傷活性。 [0017] 3、所述的Anastatin B的兩個衍生物1和2的制備及其在制備抗氧化和抗肝損傷藥 物中的應用，其特征在于:所述化合物用作制備治療肝損傷藥物和抗氧化藥物。
【附圖說明】
[0018] 圖1為compound 1的PC-12氧化損傷模型抗氧化活性測試結果；
[0019] 圖2為compound 2的PC-12氧化損傷模型抗氧化活性測試結果；
[0020] 圖3為化合物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷血衆(zhòng)AST的影響；
[0021 ]圖4為化合物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷血衆(zhòng)ALT的影響；
[0022] 圖5為化合物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷血漿LDH的影響；
[0023] 圖6為化合物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷血清MDA的影響；
[0024] 圖7為化合物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷血衆(zhòng)GSH的影響；
[0025]圖8為4,8,9_三羥基-2-(4-羥基芐基)-2H-苯并呋喃并[2,3-g]苯并呋喃-3-酮的 核磁共振氫譜；
[0026] 圖9為(Z)-4,8,9-三羥基-2-(4-羥基亞芐基)-2H-苯并呋喃并[2,3-g]苯并呋喃- 3-酮的核磁共振氫譜。
【具體實施方式】
[0027]為了理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明；下述實施例是說明性 的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。
[0028] 本發(fā)明基于Anastatin B有很好的生物活性，首次合成出Anastatin B的兩個衍生 物1和2,這類衍生物具有較好的抗氧化活性及抗肝損傷活性。其總還原能力、DPPH ·自由基 清除能力和ABTS ·自由基清除均與Vc相當，且均具有良好的細胞水平抗氧化損傷活性；同 時整體水平上對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷體現(xiàn)出良好的保護作用，有效抑制了肝損傷指 標ASL、ALT、LDH和MDA的活性及含量;提升了動物體內重要的保護酶GSH含量。
[0029]⑴利用體外化學法評價了 1和2的總還原能力、ABTS ·自由基清除能力及DPPH ·自 由基清除能力。實驗結果顯示：1和2的總還原能力分別為221 · 56g/mol和193 · 66g/mol; ABTS ·自由基清除力的EC5q值分別為2.40mM和2.74mM;DPPH ·自由基清除力的Ec5q值分別 為0.13mM和0.16mM。以上結果說明：1和2都具有良好的體外抗氧化活性和清除自由基的能 力。
[0030] ⑵進一步在細胞水平上驗證了 1和2的細胞毒性及對H2O2誘導PC-12細胞氧化損傷 的保護作用。實驗結果顯示:單獨使用1〇〇μΜ的1或2處理PC-12細胞48h后，細胞的存活率分 別為31.96%和60.77%，說明2的細胞毒性較小；當使用ΙμΜ的化合物對PC-12細胞進行預保 護時，2處理組能有效的抑制H 2O2誘導的PC-12細胞氧化損傷，細胞存活率為93.75%，是1處 理組細胞存活率(35.77% )的2.6倍。以上結果說明：與1相比較，2的細胞毒性更低，對H2O2誘 導PC-12細胞氧化損傷的保護作用更強。
[0031] ⑶利用四氯化碳(CCl4)誘導的小鼠急性肝損傷模型評價了 1和2的保肝活性。實驗 結果顯示:與CCl4模型組相比，1預處理組和2預處理組的肝損傷指標如ALT、AST、LDH、MDA的 活性和含量明顯降低，而對肝損傷起保護作用的GSH含量顯著升高，且2預處理組的保護效 果效果優(yōu)于I (p〈〇. 01)。
[0032]⑷Anastatin B的衍生物1和2合成、純化方法簡單并具有較好的抗氧化及保肝活 性，在抗氧化和抗肝損傷藥物的開發(fā)與應用方面具有廣闊的前景。
[0033]本發(fā)明所涉及的化合物在抗氧化及抗肝損傷藥物中的應用，包括但不限于在治療 肝損傷藥物中的應用。
[0034]本發(fā)明提供化合物1和2 LjrsLJ,、
[0035]
[0036] 本發(fā)明特別包括化合物：
[0037] (1 )4，8，9-三羥基-2-(4-羥基芐基)-2H-苯并呋喃并[2，3-g]苯并呋喃-3-酮
[0038] (2)(2)-4,8,9-三羥基-2-(4-羥基亞芐基)-2!1-苯并呋喃并[2,31]苯并呋喃-3-酮
[0039] 化合物1和2的合成路線
[0040]
[0041] 說明 1
[0042] (Z)-4,8,9-三羥基-2-(4-羥基亞芐基)-2H-苯并呋喃并[2,3-g]苯并呋喃-3-酮
[0043] 取(Z)-7-溴-4,6-二異丙氧基-2-(4-異丙氧基亞芐基)苯并呋喃-3(2H)_酮4.76g (lO.Ommol)，3,4_亞甲基苯棚酸1.83g(ll .Ommol)，Pd(PPh3)4l · 16g(l .Ommol)，Cs2C〇36.53g (20mmoI)，放入50mL支口反應瓶中，加入20mL N，N-二甲基甲酰胺，氬氣保護下，加熱到100 °C下反應12小時。TLC檢測反應完全后，將反應液冷卻至室溫，然后倒入200mL冰水中，用二 氯甲烷萃?。?X50mL)，合并有機相，經(jīng)飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，用展開劑石油 醚 ：乙酸乙酯=30:1，200-300目硅膠柱層析純化，得(2)-7-(苯并[(1][1，3]二氧雜環(huán)戊烯- 5-基)-4,6-二異丙氧基-2-(4-異丙氧基亞芐基)苯并呋喃-3(2H)_酮3.88g，產(chǎn)率75%。
[0044] 取(Z)-7-(苯并[d][1， 3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-4,6_二異丙氧基-2- (4-異丙氧基 亞芐基)苯并呋喃-3(2H)_酮5.17g(10.0mmol)，放入200mL圓底燒瓶中，加入20mL無水二氯 甲烷，冰浴攪拌下，緩慢滴加70mL三氯化硼溶液(70.0 mmoI，lmo 1/L的二氯甲烷溶液），滴加 完成后，將反應液加熱到40°C冷凝回流4小時。TLC檢測反應完全后，將反應溶液冷卻至室 溫，再將反應液慢慢倒入IOOmL冰水中，攪拌10分鐘，抽濾，并用水洗滌濾餅，再將濾餅干燥 后，得到（Z)-7-(3,4-二羥基苯基）-4,6_二羥基-2-(4-羥基亞芐基）苯并呋喃-3(2H)_酮 3.74g，產(chǎn)率 99%。
[0045] 取(Z)-7-(3，4_二羥基苯基)-4,6-二羥基-2-(4-羥基亞芐基)苯并呋喃-3(2H)_酮 378mg(lmmol)放入25mL圓底燒瓶中，加入IOmL N，N-二甲基甲酰胺，攪拌下加入Ag2〇 463mg (2mmol)，50°C加熱反應4小時。TLC檢測反應完全后，將反應溶液冷卻至室溫，再向反應溶液 中加入5mL無水甲醇，攪拌30分鐘。用硅藻土過濾掉反應液中的固體，并用乙酸乙酯洗滌，收 集反應液，將反應液倒入100mL水中，用乙酸乙酯萃取(3X IOOmL)，合并有機相，經(jīng)飽和食鹽 水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干后，得到（Z)-4,8,9-三羥基-2-(4-羥基亞芐基)-2H-苯 并呋喃并[2，3-g]苯并呋喃-3-酮282mg，產(chǎn)率75%。
[0046] 4^^(4001^,01^0)311.18(8,111),10.25(8,111),9.48(8,111),9.44(8,1!!), 7.92(d，J = 8.4Hz，2H)，7.40(s，lH)，7.08(s，lH)，7.00(d，J = 8.0Hz，2H)，6.79(s，lH)，6.76 (s，lH)〇
[0047] 說明 2
[0048] 4,8,9_三羥基-2-(4-羥基芐基)-2H-苯并呋喃并[2,3-g]苯并呋喃-3-酮 [0049] 取(Z)-4,8,9-三羥基-2-(4-羥基亞芐基)-2H-苯并呋喃并[2,3-g]苯并呋喃-3-酮 376mg(lmmol)，IOmL圓底燒瓶中，加入5mL無水乙醇，攪拌下加入Pd/C(10% )40mg，用氫氣球 提供氫氣和壓力，室溫下攪拌12小時。用硅藻土過濾掉反應液中的固體，并用無水乙醇洗 滌，收集反應液，減壓蒸干后，得到4，8，9-三羥基-2-(4-羥基芐基)-2H-苯并呋喃并[2，3-g] 苯并呋喃-3-酮370mg，產(chǎn)率98%。
[0050] 1H NMR(400MHz，DMS0)S10.88(s，1H)，9.32(s，1H)，9.23(s，1H)，9.20(s，1H)，7.11 (m,3H),7.01(s,lH) ,6.66(d ,J = 8.4Hz , 2H), 6.54(s, 1H), 5.04(m, 1H), 3.18(dd J= 14.8, 3.6Hz,lH),2.91(dd ,J = 14.8,8.0Hz,lH).
[0051 ] 實施例1
[0052]體外化學法評價了 I和2的總還原能力、ABTS ·自由基清除能力及DPPH ·自由基清 除能力測試。根據(jù)常規(guī)實驗方法檢測1和2的總還原能力、ABTS ·自由基清除能力及DPPH · 自由基清除能力，結果如表1所示。 「00531 丟1 ik會物優(yōu)孫水平的碰究 LUUDDJ 頭施觀
[0056] Compound 1和2對PC-12細胞氧化損傷的保護作用研究
[0057]細胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)液為含1 %的青霉素-鏈霉素溶液，10 %的胎牛血清的PRMI 1640細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37°C、含5%C02的恒溫培養(yǎng)箱。根據(jù)實驗PC-12細胞氧化損傷 模型實驗條件，對3個化合物進行抗氧化測試。根據(jù)化合物溶解度及細胞活性測試常用濃 度，用DMSO作為溶劑將化合物稀釋為不同濃度梯度，在實驗體系中，同時設置加入待測化合 后加入H 2O2組和H2O組作為對照組，加入H2O組用作測試化合物對PC-12細胞的細胞毒作用。 根據(jù)構建的氧化應激模型，對compound 1和compound 2的細胞水平氧化損傷保護作用進行 了測試，進行三次平行實驗，其實驗結果見圖1和圖2。
[0058] 實施例3
[0059] Compound 1和2對小鼠急性肝損傷的保護作用研究
[0060] (1)分組與給藥
[0061] 對72只小鼠（雌)進行平均隨機分成9組，每組8只，分別為空白組、模型組、聯(lián)苯雙 酯滴丸組、compound 1高劑量組、compound 1中劑量組、compound 1低劑量組、compound 2 高劑量組、compound 2中劑量組、compound 2低劑量組。
[0062] 本實驗給藥方式為灌胃給藥，在第一次給藥前禁食12小時，自由飲水。稱量后按照 下表對各組小鼠進行給藥。
[0063] 表2小鼠給藥劑量
[0066] (2)造模與取樣
[0067]從第一次給藥開始，每天給藥1次，連續(xù)給藥10天。第十天給藥1小時后，對非空白 組小鼠腹腔注射〇.3mL 0.25%四氯化碳花生油進行染毒，對空白組小鼠腹腔注射0.3mL普 通花生油進行染毒。
[0068] 染毒20h后對所有小鼠取血，放置于肝素鈉 EP管中，然后在4 °C 3000r/min離心10分 鐘后，吸取上層血清置于冰上待用。
[0069] 對每只小鼠取出0.1-0.2g肝臟。用移液槍吸取9倍肝臟樣本重量的0.86%預冷生 理鹽水，取其2/3加入玻璃勻漿器中。將肝臟樣本剪碎后倒入玻璃勻漿器中，將剩余的1/3預 冷的0.86%生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿器中。一手握住勻漿管 下端插入冰上，另一手將搗桿豎直插入套管中，上下轉動研磨6-8分鐘確保肝臟組織被充分 研碎，使組織勻漿化。在4°C3000r/min離心10分鐘后，吸取上層清液待用。
[0070] (3)AST/ALT/LDH/MDA/GSH 檢測試劑盒
[0071] 按照試劑盒說明書測定AST/ALT/LDH/MDA/GSH的含量及活性。結果如圖3-圖7所 不。
【主權項】
1. 天然黃酮Anastatin B的衍生物，其特征在于:衍生物的結構如下：2. -種制備權利要求1所述的天然黃酮A n a s t a t i η B的衍生物的方法，其特征在于：制 備方法如下：3. 天然黃酮Anastatin Β的衍生物，其特征在于:衍生物的結構如下：4. 一種制備權利要求3所述的天然黃酮Anastatin B的衍生物的方法，其特征在于：制 備方法如下：5.根據(jù)權利要求1或3所述的Anastatin B的衍生物在制備治療抗氧化和抗肝損傷藥物 中的應用。
【文檔編號】A61P39/06GK105859737SQ201610325752
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】郁彭, 徐傳明, 潘國軍, 滕玉鷗, 向岑, 楊珂, 馬艷濤, 李旭哲, 陳明朗, 沈棣, 蘇超, 蘆逵
【申請人】天津科技大學