微滴式數(shù)字pcr熒光檢測(cè)系統(tǒng)和熒光檢測(cè)裝置的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)和熒光檢測(cè)裝置，其中，微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)包括微滴成像模塊、熒光檢測(cè)模塊、樣品傳送模塊以及控制模塊，微滴成像模塊和熒光檢測(cè)模塊與控制模塊連接。微滴樣品在所述樣品傳送模塊中依次經(jīng)過微滴成像模塊以及熒光檢測(cè)模塊。微滴成像模塊測(cè)量每一個(gè)微滴樣品的直徑的大小，當(dāng)微滴樣品的直徑滿足預(yù)設(shè)值時(shí)，記為有效微滴樣品，統(tǒng)計(jì)有效微滴樣品的總數(shù)量發(fā)送至控制模塊。熒光檢測(cè)模塊收集熒光探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)，將有效微滴樣品的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)發(fā)送至控制模塊。控制模塊結(jié)合數(shù)字信號(hào)和有效微滴樣品的總數(shù)量進(jìn)行運(yùn)算分析，得到目標(biāo)核酸的濃度。本發(fā)明技術(shù)方案使微滴樣品的數(shù)量能夠被精確統(tǒng)計(jì)。
【專利說明】
微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)和熒光檢測(cè)裝置
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及PCR檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)和應(yīng)用 該檢測(cè)系統(tǒng)的熒光檢測(cè)裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是一種用于擴(kuò)增特定DNA片 段的分子生物學(xué)技術(shù)，已經(jīng)歷了三代的發(fā)展。第一代PCR，即普通PCR，是通過凝膠電泳獲得 定性的結(jié)果，為終點(diǎn)PCR技術(shù)。第二代PCR，即熒光定量PCR，利用熒光探針對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo) 記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增過程，依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因來測(cè)定核酸量，實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量，應(yīng)用 十分廣泛。第三代PCR，即數(shù)字PCR，通過對(duì)樣本進(jìn)行微小單元化處理，可確定低至單拷貝的 待檢靶分子的絕對(duì)數(shù)目，為絕對(duì)定量PCR技術(shù)。
[0003] 微滴式數(shù)字PCR是數(shù)字PCR的一種，區(qū)別于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，它在擴(kuò)增前首先對(duì)樣品 進(jìn)行微滴化處理，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，對(duì)每個(gè)微滴的熒光信號(hào)進(jìn)行逐一檢測(cè)分析，最后根據(jù)泊松 分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例，得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。
[0004] 現(xiàn)有的微滴式數(shù)字PCR是用微流控技術(shù)，在DNA擴(kuò)增前對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理。使 每個(gè)微滴只包含單個(gè)或不含目標(biāo)核酸分子。在PCR擴(kuò)增后，對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)， 被檢測(cè)到很強(qiáng)熒光信號(hào)的微滴被記為陽(yáng)性微滴，微弱熒光信號(hào)或者無熒光信號(hào)的微滴被標(biāo) 記陰性微滴。泊松分布原理需要同時(shí)對(duì)陽(yáng)性微滴和陰性微滴進(jìn)行分別計(jì)數(shù)，而陰性微滴的 探測(cè)是通過微滴中未參與反應(yīng)的熒光探針?biāo)l(fā)出的微弱熒光來判斷，然而如此會(huì)存在以下 問題:這十分微弱的熒光信號(hào)容易被環(huán)境噪聲所干擾，可能被誤判為噪聲而導(dǎo)致檢測(cè)到的 陰性微滴數(shù)量偏少，使微滴樣品的數(shù)量不能夠被精確統(tǒng)計(jì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的是提供一種微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)，旨在使微滴樣品的 數(shù)量能夠被精確統(tǒng)計(jì)。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出的微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)，用于檢測(cè)微滴樣 品，包括微滴成像模塊、熒光檢測(cè)模塊、樣品傳送模塊以及控制模塊，所述微滴成像模塊和 熒光檢測(cè)模塊與所述控制模塊連接；
[0007] 所述微滴樣品在所述樣品傳送模塊中依次經(jīng)過所述微滴成像模塊以及所述熒光 檢測(cè)模塊；
[0008] 所述微滴成像模塊測(cè)量每一個(gè)所述微滴樣品的直徑的大小，當(dāng)所述微滴樣品的直 徑滿足預(yù)設(shè)值時(shí)，記為有效微滴樣品，并統(tǒng)計(jì)所述有效微滴樣品的總數(shù)量發(fā)送至所述控制 豐旲塊；
[0009] 所述熒光檢測(cè)模塊通過照射所述微滴樣品后激發(fā)所述微滴樣品中的熒光探針，收 集所述熒光探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)，將所述有效微滴樣品的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)發(fā)送至 所述控制模塊；
[0010] 所述控制模塊結(jié)合所述有效微滴樣品的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成的數(shù)字信號(hào)和所述有效 微滴樣品的總數(shù)量進(jìn)行運(yùn)算分析，得到目標(biāo)核酸的濃度。
[0011] 可選地，所述微滴成像模塊包括白光光源、第一物鏡、第一透鏡和圖像傳感器，
[0012] 所述白光光源發(fā)出的白光經(jīng)過所述第一透鏡反射后進(jìn)入所述第一物鏡，并聚焦于 所述微滴樣品；
[0013] 所述微滴樣品經(jīng)過所述白光照射后，經(jīng)由所述第一物鏡后在所述圖像傳感器中成 像。
[0014] 可選地，所述第一透鏡為半反半透鏡，所述半反半透鏡的于豎直方向上的傾斜角 度為45度。
[0015] 可選地，所述熒光檢測(cè)模塊包括光源、第二透鏡、第二物鏡和熒光探測(cè)器，所述第 二物鏡為顯微物鏡；
[0016] 所述光源發(fā)射的探測(cè)光經(jīng)過所述第二透鏡反射后，在所述第二物鏡匯聚成光斑照 射到所述微滴樣品上；
[0017]所述微滴樣品經(jīng)所述探測(cè)光照射后發(fā)出熒光信號(hào)，所述熒光信號(hào)經(jīng)過所述第二物 鏡收集后，再通過所述第二透鏡，到達(dá)所述熒光探測(cè)器；
[0018] 所述熒光探測(cè)器將所述有效微滴樣品的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成的數(shù)字信號(hào)發(fā)送至所述 控制模塊。
[0019] 可選地，所述光源包括第一光源和第二光源，所述熒光探測(cè)器包括第一探測(cè)器和 第二探測(cè)器，所述第二透鏡為二向色鏡，所述第二透鏡包括第一二向色鏡、第二二向色鏡以 及第三二向色鏡，
[0020] 所述第一光源與所述第一探測(cè)器之間形成第一檢測(cè)通路，所述第二光源與所述第 二探測(cè)器之間形成第二檢測(cè)通路，
[0021 ]所述第一二向色鏡設(shè)于所述第一光源和所述第二物鏡之間；
[0022]所述第二二向色鏡設(shè)于所述第一二向色鏡和所述第三二向色鏡之間的光路中，且 與所述第一探測(cè)器對(duì)應(yīng)設(shè)置；
[0023]所述第三二向色鏡設(shè)于所述第二光源和所述第二二向色鏡之間，且與所述第二探 測(cè)器對(duì)應(yīng)設(shè)置。
[0024] 可選地，所述微滴樣品中包括第一熒光探針和/或第二熒光探針，所述第一光源用 于激發(fā)所述第一熒光探針，所述第一探測(cè)器用于探測(cè)所述第一熒光探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)；
[0025] 所述第二光源用于激發(fā)所述第二熒光探針，所述第二探測(cè)器用于探測(cè)所述第二熒 光探針產(chǎn)生的焚光信號(hào)。
[0026] 可選地，所述熒光檢測(cè)模塊還設(shè)有濾光片，所述濾光片包括第一濾光片和第二濾 光片，所述第一濾光片的光譜范圍與所述第一探測(cè)器相匹配，且所述第一濾光片設(shè)于所述 第一探測(cè)器與所述第二二向色鏡之間；
[0027] 所述第二濾光片的光譜范圍與所述第二探測(cè)器相匹配，且所述第二濾光片設(shè)于所 述第二探測(cè)器和所述第三二向色鏡之間。
[0028] 可選地，所述光源為激光光源或單色LED光源，所述光源為單色LED光源時(shí)，所述光 源前設(shè)有窄帶濾光片。
[0029] 可選地，所述樣品傳送模塊為微流控芯片，包括微滴樣品通道、微滴存儲(chǔ)池以及流 速控制系統(tǒng)；
[0030] 所述流速控制系統(tǒng)與所述控制模塊連接，用于控制所述微滴樣品的流動(dòng)速度；
[0031] 所述微滴樣品通道的寬度與所述微滴樣品的直徑適配，以使每一所述微滴樣品依 次經(jīng)過所述第一物鏡的聚焦探測(cè)區(qū)域。
[0032] 本發(fā)明還提出一種熒光檢測(cè)裝置，包括微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)，所述微滴式 數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)包括微滴成像模塊、熒光檢測(cè)模塊、樣品傳送模塊以及控制模塊，所 述微滴成像模塊和熒光檢測(cè)模塊與所述控制模塊連接；
[0033] 所述微滴樣品在所述樣品傳送模塊中依次經(jīng)過所述微滴成像模塊以及所述熒光 檢測(cè)模塊；
[0034]所述微滴成像模塊測(cè)量每一所述微滴樣品的直徑的大小，當(dāng)所述微滴樣品的直徑 滿足預(yù)設(shè)值時(shí)，記為有效微滴樣品，并統(tǒng)計(jì)所述有效微滴樣品的總數(shù)量發(fā)送至所述控制模 塊；
[0035]所述熒光檢測(cè)模塊通過照射所述微滴樣品后激發(fā)所述微滴樣品中的熒光探針，收 集所述熒光探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)，并將所述有效微滴樣品的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成的數(shù)字信號(hào)發(fā) 送至所述控制模塊；
[0036]所述控制模塊結(jié)合所述有效微滴樣品的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成的數(shù)字信號(hào)和所述有效 微滴樣品的總數(shù)量進(jìn)行運(yùn)算分析，得到目標(biāo)核酸的濃度。
[0037] 本發(fā)明技術(shù)方案通過采用微滴成像模塊，使得通過微滴成像模塊的有效微滴樣品 的總數(shù)量能夠被精確統(tǒng)計(jì)，進(jìn)而使得控制模塊能夠精確統(tǒng)計(jì)目標(biāo)核酸的濃度。在檢測(cè)過程 中，微滴樣品在樣品傳送模塊中逐個(gè)傳送，經(jīng)過微滴成像模塊時(shí)，微滴成像模塊對(duì)微滴樣品 進(jìn)行成像，統(tǒng)計(jì)微滴樣品的尺寸，根據(jù)微滴樣品的尺寸和與設(shè)置比對(duì)，當(dāng)微滴樣品的直徑滿 足預(yù)設(shè)值時(shí)，記為有效微滴樣品，統(tǒng)計(jì)微滴樣品中的有效微滴樣品的總數(shù)量，并將有效微滴 樣品總數(shù)量發(fā)送至控制模塊。熒光檢測(cè)模塊收集熒光探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)，將有效微滴樣 品的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成的數(shù)字信號(hào)發(fā)送至控制模塊，控制模塊根據(jù)有效微滴樣品的總數(shù)量以 及熒光檢測(cè)模塊檢測(cè)到的有效微滴樣品的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成的數(shù)字信號(hào)進(jìn)行運(yùn)算而得到目 標(biāo)核酸的濃度。
【附圖說明】
[0038] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以 根據(jù)這些附圖示出的結(jié)構(gòu)獲得其他的附圖。
[0039] 圖1為本發(fā)明微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)一實(shí)施例的示意圖。
[0040] 附圖標(biāo)號(hào)說明：
[0042]本發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)、功能特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)將結(jié)合實(shí)施例，參照附圖做進(jìn)一步說明。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；?于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其 他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0044] 需要說明，本發(fā)明實(shí)施例中所有方向性指示(諸如上、下、左、右、前、后……）僅用 于解釋在某一特定姿態(tài)(如附圖所示）下各部件之間的相對(duì)位置關(guān)系、運(yùn)動(dòng)情況等，如果該 特定姿態(tài)發(fā)生改變時(shí)，則該方向性指示也相應(yīng)地隨之改變。
[0045] 另外，在本發(fā)明中涉及"第一"、"第二"等的描述僅用于描述目的，而不能理解為指 示或暗示其相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有"第一"、"第 二"的特征可以明示或者隱含地包括至少一個(gè)該特征。另外，各個(gè)實(shí)施例之間的技術(shù)方案可 以相互結(jié)合，但是必須是以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)為基礎(chǔ)，當(dāng)技術(shù)方案的結(jié)合出現(xiàn) 相互矛盾或無法實(shí)現(xiàn)時(shí)應(yīng)當(dāng)認(rèn)為這種技術(shù)方案的結(jié)合不存在，也不在本發(fā)明要求的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
[0046]本發(fā)明提出一種微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)100,用于檢測(cè)微滴樣品40中目標(biāo)核 酸的濃度。
[0047]圖1為本發(fā)明微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)100-實(shí)施例的示意圖。其中，ox為水平 方向，〇y為豎直方向。
[0048]在本發(fā)明實(shí)施例中，如圖1所示，該微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)100包括微滴成像 模塊10、熒光檢測(cè)模塊20、樣品傳送模塊30、以及控制模塊(未圖示），微滴成像模塊10和熒 光檢測(cè)模塊20均與控制模塊連接；
[0049]微滴樣品40在所述樣品傳送模塊30中依次經(jīng)過微滴成像模塊以及熒光檢測(cè)模塊 20；
[0050]微滴成像模塊10測(cè)量每一個(gè)微滴樣品40的直徑的大小，當(dāng)微滴樣品的直徑滿足預(yù) 設(shè)值時(shí)，記為有效微滴樣品，并統(tǒng)計(jì)有效微滴樣品40的總數(shù)量發(fā)送至控制模塊；
[0051]熒光檢測(cè)模塊20通過照射微滴樣品40后激發(fā)所述微滴樣品40中的熒光探針，收集 熒光探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)，將所述有效微滴樣品40的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)發(fā)送至控制 豐旲塊；
[0052]所述控制模塊結(jié)合所述有效微滴樣品40的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成的數(shù)字信號(hào)和所述有 效微滴樣品40的總數(shù)量進(jìn)行運(yùn)算分析，得到目標(biāo)核酸的濃度。
[0053]其中，微滴樣品40的直徑的大小應(yīng)適宜，滿足于設(shè)置值。當(dāng)驗(yàn)證微滴樣品40直徑滿 足于設(shè)置值時(shí)，即為有效微滴樣品40?？梢岳斫獾氖?，當(dāng)微滴樣品40的直徑不滿足預(yù)設(shè)值的 數(shù)量過多時(shí)，控制模塊會(huì)報(bào)警，以使操作人員對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。
[0054]微滴樣品40在樣品傳送模塊30中逐個(gè)傳送，相鄰兩微滴樣品40之間的距離大致為 微滴樣品40的直徑的10倍。
[0055]微滴樣品40在通過檢測(cè)前均被加入熒光探針，熒光探針上同時(shí)有熒光基團(tuán)和淬滅 基團(tuán)，沒擴(kuò)增時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)出的光被淬滅基團(tuán)吸收，熒光很弱。擴(kuò)增過程中，熒光基團(tuán)和淬 滅基團(tuán)被分開，就能產(chǎn)生很強(qiáng)的焚光。也即，若微滴樣品40中含有目標(biāo)核酸，該微滴樣品40 可被擴(kuò)增，該微滴樣品40的熒光染料會(huì)被激發(fā)形成熒光信號(hào);若該微滴樣品40中不含有目 標(biāo)核酸，則該微滴樣品40不會(huì)被擴(kuò)增，進(jìn)而不會(huì)被激發(fā)熒光信號(hào)或產(chǎn)生的熒光信號(hào)很弱。 [0056]本發(fā)明技術(shù)方案通過采用微滴成像模塊10,使得通過微滴成像模塊10的有效微滴 樣品40的總數(shù)量能夠被精確統(tǒng)計(jì)，進(jìn)而使得控制模塊能夠精確統(tǒng)計(jì)目標(biāo)核酸的濃度。在檢 測(cè)過程中，微滴樣品40在樣品傳送模塊30中逐個(gè)傳送，經(jīng)過微滴成像模塊10時(shí)，微滴成像模 塊10對(duì)微滴樣品40進(jìn)行成像，統(tǒng)計(jì)微滴樣品40的尺寸，根據(jù)微滴樣品40的尺寸和與設(shè)置比 對(duì)，當(dāng)微滴樣品40的直徑滿足預(yù)設(shè)值時(shí)，記為有效微滴樣品40,統(tǒng)計(jì)微滴樣品40中的有效微 滴樣品40的總數(shù)量，并將有效微滴樣品40總數(shù)量發(fā)送至控制模塊。熒光檢測(cè)模塊20收集熒 光探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)，將有效微滴樣品40的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)發(fā)送至控制模塊， 控制模塊根據(jù)有效微滴樣品40的總數(shù)量以及熒光檢測(cè)模塊20檢測(cè)到的有效微滴樣品40的 熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成的數(shù)字信號(hào)進(jìn)行運(yùn)算而得到目標(biāo)核酸的濃度。
[0057]參照?qǐng)D1，微滴成像模塊10包括白光光源11、第一物鏡12、第一透鏡13和圖像傳感 器14，
[0058]白光光源11發(fā)出的白光經(jīng)第一透鏡13反射后進(jìn)入所述第一物鏡12,聚焦于微滴樣 品40;
[0059]微滴樣品40經(jīng)過白光照射后，經(jīng)由第一物鏡12后在圖像傳感器14中成像。
[0060]其中，第一透鏡13為半反半透鏡，半反半透鏡于豎直方向上(參照?qǐng)D1中的oy)的傾 斜角度為45度。圖像傳感器14采用CCD成像技術(shù)。
[0061]在檢測(cè)過程中，白光光源11發(fā)出的白光照射在微滴樣品40,微滴樣品40在圖像傳 感器14中成像，如此可精確統(tǒng)計(jì)每一經(jīng)過第一物鏡12的有效微滴樣品40,使得微滴樣品40 的數(shù)量統(tǒng)計(jì)更為精確。
[0062]在本發(fā)明的一實(shí)施例中，焚光檢測(cè)模塊20包括光源(未標(biāo)不）、第二透鏡(未標(biāo)不）、 第二物鏡23和熒光探測(cè)器(未標(biāo)示），所述第二物鏡23為顯微物鏡；
[0063]光源發(fā)射的激發(fā)光經(jīng)過第二透鏡反射后，在第二物鏡23匯聚成光斑照射到微滴樣 品40上；
[0064]微滴樣品40經(jīng)激發(fā)光照射后發(fā)出熒光信號(hào)，熒光信號(hào)經(jīng)過第二物鏡23收集后，再 通過第二透鏡，到達(dá)熒光探測(cè)器；
[0065]熒光探測(cè)器將有效微滴樣品40的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成的數(shù)字信號(hào)發(fā)送至控制模塊。 [0066]其中，第二物鏡23采用顯微物鏡能夠得到聚焦更小的聚焦光斑，和較高的熒光收 集能力。熒光探測(cè)器可采用光電倍增管PMT，第二透鏡為二向色鏡。所述熒光檢測(cè)模塊20精 確檢測(cè)含有目標(biāo)核酸的微滴樣品40的數(shù)量，使得統(tǒng)計(jì)更為精確。
[0067] 在本實(shí)施例中，參見圖1，光源包括第一光源211和第二光源212,熒光探測(cè)器包括 第一探測(cè)器241和第二探測(cè)器242,第二透鏡為二向色鏡，第二透鏡包括第一二向色鏡221、 第二二向色鏡222、以及第三二向色鏡223，
[0068] 第一光源211與第一探測(cè)器241之間形成第一檢測(cè)通路，第二光源212與第二探測(cè) 器242之間形成第二檢測(cè)通路，
[0069] 第一二向色鏡221設(shè)于第一光源211和第二物鏡23之間；
[0070] 第二二向色鏡222設(shè)于第一二向色鏡221和第三二向色鏡223之間的光路中，且與 第一探測(cè)器241對(duì)應(yīng)設(shè)置；
[0071] 第三二向色鏡223設(shè)于第二光源212和第二二向色鏡222之間，且與第二探測(cè)器242 對(duì)應(yīng)設(shè)置。
[0072] 其中，微滴樣品40中包括第一熒光探針和/或第二熒光探針(也即可以單獨(dú)存在一 種探針，也可以同時(shí)存在兩種探針），第一光源211用于激發(fā)第一熒光探針，第一探測(cè)器241 用于探測(cè)第一熒光探針產(chǎn)生的熒光信號(hào);第二光源212用于激發(fā)第二熒光探針，第二探測(cè)器 242用于探測(cè)第二熒光探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)。
[0073]可以理解的是，在檢測(cè)的過程中，可以只加入其中一種熒光探針。該第一熒光探針 為FAM(羧基熒光素)探針，第二熒光探針為VIC探針（由ABI公司生產(chǎn)），第一探測(cè)器241和第 二探測(cè)器242依次對(duì)應(yīng)第一光源211和第二光源212。第一探測(cè)器241檢測(cè)FAM探針發(fā)出的熒 光信號(hào)，第二探測(cè)器242檢測(cè)VIC探針發(fā)出的熒光信號(hào)。第一光源211的探測(cè)光的波長(zhǎng)范圍為 450nm-490nm，對(duì)應(yīng)FAM探針的熒光波長(zhǎng)范圍為515nm-520nm，第一探測(cè)器241的檢測(cè)范圍為 515nm-520nm。第二光源212的探測(cè)光的波長(zhǎng)范圍為500nm-535nm，對(duì)應(yīng)VIC探針的熒光波長(zhǎng) 范圍為560nm-580nm，第二探測(cè)器242的檢測(cè)范圍大于550nm。
[0074] 可以理解的是，第一光源211、第一探測(cè)器241以及第二光源212、第二探測(cè)器242可 根據(jù)實(shí)際檢測(cè)的熒光探針調(diào)換，熒光探針也可根據(jù)第一光源211和第二光源212的波長(zhǎng)范圍 進(jìn)行替換。
[0075] 二向色鏡又稱雙色鏡，其特點(diǎn)是對(duì)一定波長(zhǎng)的光幾乎完全透過，而對(duì)另一些波長(zhǎng) 的光幾乎完全反射。本申請(qǐng)中，第一二向色鏡221、第二二向色鏡222、第三二向色鏡223的截 止波長(zhǎng)依次為48511111、52511111、54〇11111。其中，第一二向色鏡221可供大于其截止波長(zhǎng)的光穿過 。 第二二向色鏡222可供小于其截止波長(zhǎng)的光穿過。第三二向色鏡223可供小于其截止波長(zhǎng)的 光穿過。
[0076] 每個(gè)微滴樣品中都含有FAM和VIC熒光探針，如果含有目標(biāo)DNA，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后， FAM或者VIC就會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光。如果不含目標(biāo)DNA，DNA不會(huì)擴(kuò)增，F(xiàn)AM或者VIC的熒光信號(hào) 很弱，或者沒有。
[0077]統(tǒng)計(jì)中，有效微滴樣品40的熒光信號(hào)會(huì)在熒光探測(cè)器中轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)，轉(zhuǎn)換的 數(shù)字信號(hào)為〇或1。含有目標(biāo)核酸，則記為1;不含有目標(biāo)核酸，則記為〇。
[0078]在檢測(cè)的過程中，第一光源211發(fā)出探測(cè)光至第一二向色鏡221反射，經(jīng)由第二物 鏡23到微滴樣品40,第二光源212發(fā)出探測(cè)光依次穿過第三二向色鏡223,在第二二向色鏡 222反射后，經(jīng)由第二物鏡23到微滴樣品40。
[0079]若微滴樣品40中含有目標(biāo)核酸:FAM探針受激發(fā)發(fā)出熒光信號(hào)并散射到第二物鏡 23中，熒光信號(hào)穿過第二物鏡23后，繼續(xù)穿過第二二向色鏡222至第一探測(cè)器241形成數(shù)字 信號(hào)，第一探測(cè)器241發(fā)送數(shù)字信號(hào)1至控制模塊。VIC探針受激發(fā)發(fā)出熒光信號(hào)并散射到第 二物鏡23中，熒光信號(hào)穿過第二物鏡23后，在第二二向色鏡222處反射至第三二向色鏡223， 在第三二向色鏡223處反射至第二探測(cè)器242,第二探測(cè)器242收集到后形成數(shù)字信號(hào)1發(fā)送 至控制模塊。
[0080] 微滴樣品40中不含有目標(biāo)核酸:第一探測(cè)器241和第二探測(cè)器242均發(fā)送數(shù)字信號(hào) 〇至控制模塊。
[0081] 如此，通過第一探測(cè)器241、第二探測(cè)器242以及第一光源211和第二光源212的設(shè) 置，激發(fā)波長(zhǎng)和熒光探測(cè)，一對(duì)一，依次排列，提高激發(fā)光激發(fā)效率，避免激發(fā)光源干擾，改 善熒光補(bǔ)償效果，提高測(cè)量的準(zhǔn)確性。
[0082]參照?qǐng)D1，熒光檢測(cè)模塊20還設(shè)有濾光片，濾光片包括第一濾光片241a和第二濾光 片242a，所述第一濾光片241a的光譜范圍與所述第一探測(cè)器241相匹配，且第一濾光片241a 設(shè)于第一探測(cè)器241與第二二向色鏡222之間；
[0083]所述第二濾光片242a的光譜范圍與所述第二探測(cè)器242相匹配，且第二濾光片 242a設(shè)于第二探測(cè)器242和第三二向色鏡223之間。
[0084]第一濾光片241a和第二濾光片242a的設(shè)置可以濾除對(duì)應(yīng)熒光信號(hào)以外的背景光 干擾，使得第一探測(cè)器241和第二探測(cè)器242的測(cè)量更為精確。
[0085] 進(jìn)一步地，所述光源為經(jīng)過準(zhǔn)直處理的激光光源或單色LED光源，所述光源為單色 LED光源時(shí)，所述光源前設(shè)有窄帶濾光片(211 a，212a)。
[0086] 所述光源發(fā)出的探測(cè)光均進(jìn)行準(zhǔn)直處理，采用單色LED光源時(shí)，設(shè)置窄帶濾光片 (21 Ia，212a)能夠最大限度的接近染料最佳激發(fā)波長(zhǎng)，同時(shí)避免光源對(duì)探測(cè)的熒光干擾。 [0087]參照?qǐng)D1，樣品傳送模塊30為微流控芯片，包括微滴樣品通道31、微滴存儲(chǔ)池(未圖 示）以及流速控制系統(tǒng)(未圖示）；
[0088]流速控制系統(tǒng)與控制模塊連接，用于控制微滴樣品40的流動(dòng)速度；
[0089]微滴樣品通道31的寬度與微滴樣品40的直徑適配，以使每一微滴樣品40依次經(jīng)過 第一物鏡12的聚焦探測(cè)區(qū)域。
[0090] 如此，微滴樣品40的流動(dòng)速度和大小都精確可調(diào)，使得測(cè)量更加精準(zhǔn)。
[0091] 本發(fā)明還提出一種熒光檢測(cè)裝置(未圖示），該熒光檢測(cè)裝置包括微滴式數(shù)字PCR 熒光檢測(cè)系統(tǒng)100,該微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)100參照上述實(shí)施例，由于本熒光檢測(cè)裝 置采用了上述所有實(shí)施例的全部技術(shù)方案，因此至少具有上述實(shí)施例的技術(shù)方案所帶來的 所有有益效果，在此不再一一贅述。
[0092]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是在本 發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思下，利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)變換，或直接/間接運(yùn)用 在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域均包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)，用于檢測(cè)微滴樣品，其特征在于，包括微滴成像 模塊、熒光檢測(cè)模塊、樣品傳送模塊以及控制模塊，所述微滴成像模塊和熒光檢測(cè)模塊與所 述控制模塊連接； 所述微滴樣品在所述樣品傳送模塊中依次經(jīng)過所述微滴成像模塊以及所述熒光檢測(cè) 豐旲塊； 所述微滴成像模塊測(cè)量每一個(gè)所述微滴樣品的直徑的大小，當(dāng)所述微滴樣品的直徑滿 足預(yù)設(shè)值時(shí)，記為有效微滴樣品，并統(tǒng)計(jì)所述有效微滴樣品的總數(shù)量發(fā)送至所述控制模塊； 所述熒光檢測(cè)模塊通過照射所述微滴樣品后激發(fā)所述微滴樣品中的熒光探針，收集所 述熒光探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)，將所述有效微滴樣品的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)發(fā)送至所述 控制模塊； 所述控制模塊結(jié)合所述有效微滴樣品的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成的數(shù)字信號(hào)和所述有效微滴 樣品的總數(shù)量進(jìn)行運(yùn)算分析，得到目標(biāo)核酸的濃度。2. 如權(quán)利要求1所述的微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述微滴成像模塊 包括白光光源、第一物鏡、第一透鏡和圖像傳感器， 所述白光光源發(fā)出的白光經(jīng)過所述第一透鏡反射后進(jìn)入所述第一物鏡，并聚焦于所述 微滴樣品； 所述微滴樣品經(jīng)過所述白光照射后，經(jīng)由所述第一物鏡后在所述圖像傳感器中成像。3. 如權(quán)利要求2所述的微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述第一透鏡為半 反半透鏡，所述半反半透鏡于豎直方向上的傾斜角度為45度。4. 如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述 熒光檢測(cè)模塊包括光源、第二透鏡、第二物鏡和熒光探測(cè)器，所述第二物鏡為顯微物鏡； 所述光源發(fā)射的激發(fā)光經(jīng)過所述第二透鏡反射后，在所述第二物鏡匯聚成光斑照射到 所述微滴樣品上； 所述微滴樣品經(jīng)所述激發(fā)光照射后發(fā)出熒光信號(hào)，所述熒光信號(hào)經(jīng)過所述第二物鏡收 集后，再通過所述第二透鏡，到達(dá)所述熒光探測(cè)器； 所述熒光探測(cè)器將所述有效微滴樣品的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成的數(shù)字信號(hào)發(fā)送至所述控制 豐旲塊。5. 如權(quán)利要求4所述的微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述光源包括第一 光源和第二光源，所述熒光探測(cè)器包括第一探測(cè)器和第二探測(cè)器，所述第二透鏡為二向色 鏡，所述第二透鏡包括第一二向色鏡、第二二向色鏡以及第三二向色鏡， 所述第一光源與所述第一探測(cè)器之間形成第一檢測(cè)通路，所述第二光源與所述第二探 測(cè)器之間形成第二檢測(cè)通路， 所述第一二向色鏡設(shè)于所述第一光源和所述第二物鏡之間； 所述第二二向色鏡設(shè)于所述第一二向色鏡和所述第三二向色鏡之間的光路中，且與所 述第一探測(cè)器對(duì)應(yīng)設(shè)置； 所述第三二向色鏡設(shè)于所述第二光源和所述第二二向色鏡之間，且與所述第二探測(cè)器 對(duì)應(yīng)設(shè)置。6. 如權(quán)利要求5所述的微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述微滴樣品中包 括第一熒光探針和/或第二熒光探針，所述第一光源用于激發(fā)所述第一熒光探針，所述第一 探測(cè)器用于探測(cè)所述第一熒光探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)； 所述第二光源用于激發(fā)所述第二熒光探針，所述第二探測(cè)器用于探測(cè)所述第二熒光探 針產(chǎn)生的焚光信號(hào)。7. 如權(quán)利要求5所述的微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述熒光檢測(cè)模塊 還設(shè)有濾光片，所述濾光片包括第一濾光片和第二濾光片，所述第一濾光片的光譜范圍與 所述第一探測(cè)器相匹配，且所述第一濾光片設(shè)于所述第一探測(cè)器與所述第二二向色鏡之 間； 所述第二濾光片的光譜范圍與所述第二探測(cè)器相匹配，且所述第二濾光片設(shè)于所述第 二探測(cè)器和所述第三二向色鏡之間。8. 如權(quán)利要求5所述的微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述光源為經(jīng)過準(zhǔn) 直處理的激光光源或單色LED光源； 所述光源為單色LED光源時(shí)，所述光源前設(shè)有窄帶濾光片。9. 如權(quán)利要求1所述的微滴式數(shù)字PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述樣品傳送模塊 為微流控芯片，包括微滴樣品通道、微滴存儲(chǔ)池以及流速控制系統(tǒng)； 所述流速控制系統(tǒng)與所述控制模塊連接，用于控制所述微滴樣品的流動(dòng)速度； 所述微滴樣品通道的寬度與所述微滴樣品的直徑適配，以使每一所述微滴樣品依次經(jīng) 過所述第一物鏡的聚焦探測(cè)區(qū)域。10. -種熒光檢測(cè)裝置，其特征在于，包括如權(quán)利要求1至9中任一所述的微滴式數(shù)字 PCR熒光檢測(cè)系統(tǒng)。
【文檔編號(hào)】C12M1/34GK105861299SQ201610298481
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月5日
【發(fā)明人】關(guān)燁鋒, 張道森
【申請(qǐng)人】廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院(廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院)