參與白灰制菌素a或b合成的基因簇的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種參與抗生素leucinostatin A或B合成的基因簇，該基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，編碼抗生素leucinostatin A合成所涉及的20個(gè)基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2～21所示。本發(fā)明為深入研究leucinostatins的生物合成途徑提供了直接依據(jù)。為開(kāi)發(fā)更有效的leucinostatins衍生物奠定了基礎(chǔ)。該基因簇可用于抗生素leucinostatin A或B的合成，還可用在基因工程、蛋白表達(dá)、酶催化反應(yīng)等方面，也可用于尋找和發(fā)現(xiàn)用于醫(yī)藥、工業(yè)或農(nóng)業(yè)的化合物或基因以擴(kuò)大抗生素leucinostatin A或B的來(lái)源范圍。
【專利說(shuō)明】
參與白灰制菌素 A或B合成的基因簇
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)基因領(lǐng)域，具體涉及一種參與抗生素 leucinostatin A或B合 成的基因簇。
【背景技術(shù)】
[0002] Leucinostatin A(白灰制菌素）于1972年首次在淡紫擬青霉(Purpureocillicum Iilacinum)中分離得到。而后，在P· lilacinum，Paecilomyces marquandii和Acremonium sp.等真菌中相繼分離到leucinostatin家族中24個(gè)化合物，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0003]
[0004] Leucinostatins結(jié)構(gòu)中，在N末端，是一個(gè)脂肪酸連殘基(4-甲基-2-六稀酸），在碳 末端，是NI，N1-二甲基丙烷-1，2-二元胺。中間包含亮氨酸以及特殊氨基酸：甲基脯氨酸、羥 基亮氨酸、氨基異丁酸和 丙氨酸等。當(dāng) Rl = CH3，R2 = CH3OfeCOCH2 (OH) CH，R3 = CH3，R4 = CH3時(shí)，式1所示化合物為leucinostatin Α，當(dāng)Rl = CH3,R2 = CH3CH2C0CH2(0H)CH，R3 = CH3，R4 =H時(shí)，式1所示化合物為leucinostatin B。
[0005] Leucinostatins通過(guò)抑制磷酸化作用于線粒體ATP的合成發(fā)揮作用，具有對(duì)細(xì)菌、 真菌、腫瘤細(xì)胞、錐形蟲(chóng)的廣譜抗性。研究表明，Leucinostatin A能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的 生長(zhǎng)。
[0006] P. Iilacinum是農(nóng)業(yè)上重要的生防真菌，對(duì)多種昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)以及真菌具有很好的防 效。有研究表明，能夠產(chǎn)生leucinostatin A的菌株對(duì)于植物寄生線蟲(chóng)具有更好的防效。
[0007] 分子生物學(xué)以及生物信息學(xué)的分析表明，在真菌中，控制次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的合 成酶基因以及調(diào)控基因是排列成簇的，位于靠近染色體端粒的區(qū)域。
[0008] 雖然，Leucinostatin A的應(yīng)用已經(jīng)廣泛引用，但是對(duì)于控制其作用的基因序列還 不為人所知，過(guò)對(duì)其生物合成機(jī)制的研究和揭示其合成機(jī)制，并且通過(guò)分子改造等手段讓 Ieucinostatins更有效，以及指導(dǎo)其合成途徑具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明公開(kāi)了一種參與抗生素 leucinostatin A合成的基因簇，這種基因簇同樣 參與抗生素 leucinostatin B的合成，可以有效的指導(dǎo)leucinostatin A或B的合成。
[0010] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0011] 一種參與抗生素 leucinostatin A合成的基因簇，該基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，編碼抗生素 leucinostatin A合成所涉及的20個(gè)基因的氨基酸序列具體如下： [0012] (I)IcsA:編碼NRPS合成酶，IcsA的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序 列的第63670~99575個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0013] (2)lcsB:編碼PKS合成酶，IcsB的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列 的第20959~29243個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0014] (3)lcsC:編碼PKS合成酶，IcsC的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列 第40712~48967個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示；
[0015] (4)lcsD:編碼Acyl-CoA連接酶，IcsD的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷 酸序列第49241~50502個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示；
[0016] (5)lcsE:編碼硫酯酶，IcsE的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列第 57716~58718個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示；
[0017] (6)lcsF:編碼轉(zhuǎn)錄因子，IcsF的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列 第37587~39353個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
[0018] (7)lcsG:編碼0-甲基轉(zhuǎn)移酶，IcsG的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸 序列第1~1515個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示；
[0019] (8)lcsH:編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，IcsG的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序 列第1884~7298個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示；
[0020] (9)lcsl:編碼細(xì)胞色素 P450氧化酶，IcsG的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的 核苷酸序列第9095~10865個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示；
[0021] (IO)IcsJ:編碼硫酯酶，IcsJ的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列第 11061~11990個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示；
[0022] (11 HcsK編碼細(xì)胞色素 P450氧化酶，IcsK的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的 核苷酸序列第13352~15052個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示； [0023] (12)lcsL:編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，IcsL的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸 序列第16232~16973個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示；
[0024] (13)lcsM:編碼未知功能蛋白，IcsM的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸 序列第19388~19636個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示；
[0025] (H)IcsN:編碼細(xì)胞色素 P450氧化酶，IcsN的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的 核苷酸序列第30268~31402個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示； [0026] (15HcsO:編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，IcsO的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸 序列第31871~35196個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示；
[0027] (16)lcSP:編碼氨基轉(zhuǎn)移酶，IcsP的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序 列第35400~36761個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示；
[0028] (17)lcsQ:編碼tRNA合成酶，IcsQ的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序 列第53126~54338個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示；
[0029] (IS)IcsR:編碼水解酶，IcsR的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列第 54706~56166個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示；
[0030] (19)IcsS:編碼未知蛋白，IcsS的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列 第58953~59534個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；
[0031] (20)lcsT:編碼差向異構(gòu)酶，IcsT的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序 列第61311~62251個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:21所示。
[0032] 并且，所述的基因簇也參與抗生素 leucinostatin B的合成。
[0033] 上述基因簇的用途之一為其編碼蛋白用于合成抗生素 leucinostatin A或B。
[0034] 上述蛋白可以通過(guò)其編碼基因，轉(zhuǎn)化到其他真菌中異源表達(dá)leucinostat ins，也 可通過(guò)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(6)和(9)等相關(guān)蛋白，調(diào)控Ieucinostatins的表達(dá)。
[0035] 上述合成酶基因以及相關(guān)基因，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0036] 含有上述基因（1)~（20)的表達(dá)載體、重組載體、重組菌株或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，都在 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0037] 可以將上述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體。載體中包括完整的基因，還包括組成型啟動(dòng) 子或者真菌自身啟動(dòng)子，在基因的3 '端，包含一段終止子序列。載體包括雙元農(nóng)桿菌載體或 者原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化所用載體。載體中需要含有抗生素標(biāo)記或者使菌絲發(fā)生顏色變化或者其他 變化的標(biāo)記，便于轉(zhuǎn)化子的篩選。
[0038] 上述基因?yàn)閰⑴cleucinostatin A或B生物合成過(guò)程的全部基因，這些基因處于共 表達(dá)的狀態(tài)。當(dāng)其中某個(gè)基因阻斷表達(dá)時(shí)，整個(gè)基因簇中基因的表達(dá)量會(huì)降低。當(dāng) P. Iilacinum處于不能產(chǎn)生Ieucinostatins的培養(yǎng)條件時(shí)，整個(gè)基因簇的表達(dá)量是極低的。
[0039] 本發(fā)明所述的基因簇的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段可以通 過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、接合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入外源宿主，這些外源宿主包括"包括細(xì)菌、酵母以及其他 絲狀真菌"，并在外源宿主中表達(dá)。并且通過(guò)調(diào)節(jié)所述基因簇的表達(dá)，達(dá)到防治植物寄生線 蟲(chóng)或者其他植物病原細(xì)菌或者真菌的目的。
[0040] 本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以用來(lái)分離需要的蛋白質(zhì)并可以用于抗體制備，本 發(fā)明所提供的基因及其蛋白質(zhì)，工業(yè)應(yīng)用上可構(gòu)建新的工程菌。
[0041] 包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通過(guò)合 適的表達(dá)體系在外源宿主中表達(dá)以得到相應(yīng)的酶或其他更高的生物活性或產(chǎn)量。
[0042] 包含本發(fā)明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些 氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物學(xué)活性，或者提高了產(chǎn)量或優(yōu)化了蛋白動(dòng)力學(xué)特 征或其他致力于得到的性質(zhì)。
[0043] 包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在 異源宿主中表達(dá)并通過(guò)DNA芯片技術(shù)了解它們?cè)谒拗鞔x鏈中的功能。
[0044] 包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列編碼的蛋白可以合成抗生素 leucinostatin A或 B0
[0045] 包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通 過(guò)遺傳重組來(lái)構(gòu)建重組質(zhì)粒以獲得新型生物合成途徑，也可以通過(guò)插入、置換、缺失或失活 進(jìn)而獲得新型生物合成途徑。
[0046] 包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可 以用來(lái)提高leucinostat in A或B的產(chǎn)量，并且發(fā)現(xiàn)調(diào)控基因能夠大量提高leucinostat ins 的代謝產(chǎn)量。
[0047] 包含本發(fā)明所提供的非核糖體肽合成酶可以通過(guò)缺失、插入或失活來(lái)自于相同或 不同的非核糖體肽合成酶系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)非核糖體肽合成酶結(jié)構(gòu)域、模塊或基因而產(chǎn)生 新的聚肽化合物。
[0048] 包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的片段或基因可以用來(lái) 構(gòu)建非核糖體肽合成酶庫(kù)或非核糖體肽合成酶衍生庫(kù)或組合庫(kù)。
[0049] 本發(fā)明為深入研究Ieucinostatins的生物合成途徑提供了直接依據(jù)。為開(kāi)發(fā)更有 效的Ieucinostatins衍生物奠定了基礎(chǔ)。
[0050] 本基因簇還可用在基因工程、蛋白表達(dá)、酶催化反應(yīng)等方面，也可用于尋找和發(fā)現(xiàn) 用于醫(yī)藥、工業(yè)或農(nóng)業(yè)的化合物或基因以擴(kuò)大抗生素 leucinostatin A或B的來(lái)源范圍，具 有較高的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0051] 圖1是本發(fā)明敲除突變體AlcsA的PCR鑒定結(jié)果；
[0052] 圖2為野生型(PLBJ-I)與敲除突變體AlcsA HPLC-MS分析結(jié)果；
[0053] 圖3為leucinostat ins合成基因簇的表達(dá)量分析。
【具體實(shí)施方式】
[0054]下面對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被 本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。
[0055] 本發(fā)明通過(guò)篩選P. Iilacinum的基因組，發(fā)現(xiàn)了Ieucinostatins的合成酶基因 (IcsA)。通過(guò)遺傳操作敲除IcsA后，P. Ii Iacinum不在產(chǎn)生leucinostat ins。通過(guò)野生型菌 株與突變體菌株的表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)一些與IcsA臨近的基因在IcsA敲除后表達(dá)量大幅度下 降。這些基因包括合成酶基因、修飾基因以及調(diào)控基因。通過(guò)過(guò)表達(dá)IcsA基因或者轉(zhuǎn)錄調(diào)控 因子，使Ieucinostatins的產(chǎn)量有所提高。下面通過(guò)其中一個(gè)具體例子來(lái)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一 步的闡述。具體過(guò)程如下：
[0056] 一、實(shí)驗(yàn)材料
[0057] 選用野生型菌株P(guān)LBJ-I(PurpureociIlium Iilacinum)，用]3DB培養(yǎng)基培養(yǎng)能夠產(chǎn) 生IeucinostatinA和B。其保藏在保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 保藏編號(hào)為CGMCC3.17492。
[0058]大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans5a，用于載體構(gòu)建和質(zhì)粒提取，購(gòu)買(mǎi)于全式金生物技術(shù) 有限公司。
[0059]載體PK0V21由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)彭友良教授饋贈(zèng)或者購(gòu)買(mǎi)自市場(chǎng)。
[0060] PDB培養(yǎng)基（lL):200g馬鈴薯在沸水中煮30min，加20g葡萄糖，定容至1L。
[00611 PDAS再生培養(yǎng)基（200ml): 2g甜蜜素，41g蔗糖，0.06g酵母提取物，0.06g蛋白胨， 0. 06g酸水解干酪素，0.06g酶水解干酪素，PDB定容，0.75 %瓊脂。
[0062] T-TOP再生培養(yǎng)基（IL): Ig磷酸二氫鉀，0 · 5g七水合硫酸鎂，0 · 5g氯化鉀，2g硝酸 鈉，20g葡萄糖，200g鹿糖，1.5%瓊脂。
[0063] 60%PEG(200ml):120g PEG4000,25g MOPS。
[0064] 0 · 7M STC(IL): 146g 山梨醇，50mL氯化鈣（IM)，I OmLTr i s-HCl (IM，PH=7 · 5)
[0065] g418:使用濃度為400mg/mL，購(gòu)于AMRESC0公司。
[0066]崩潰酶:使用濃度為20mg/mL，購(gòu)于sigma公司。
[0067] 0.1 M金精三羧酸（50mL):取2. Ig溶于50mL蒸餾水，加熱攪拌，離心取上清，分裝于 1.5mL離心管，置于4°C備用。
[0068] TEC(50mL):0.5mL IM Tris-HCl(pH = 7.5)，0.1mL 0.5M EDTA，2mL IM氯化鈣，分 裝于1.5mL離心管，4°C備用。
[0069] 二、實(shí)驗(yàn)部分
[0070] (一)Leucinostatins 合成酶基因 IcsA 的發(fā)現(xiàn)
[0071 ] 利用常規(guī)方法，對(duì)能夠產(chǎn)生IeucinostatinA和B的P· IiIacinum菌株P(guān)LBJ-I進(jìn)行全 基因組測(cè)序，經(jīng)組裝、拼接、注釋后，對(duì)預(yù)測(cè)蛋白進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物分析。
[0072 ]結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個(gè)基因簇，簇中基因類別、合成酶的結(jié)構(gòu)域等都符合 IeucinostatinA的特點(diǎn)，將此基因簇中的合成酶基因命名為lcsA，作為候選基因，進(jìn)行功能 驗(yàn)證。
[0073] 通過(guò)基因測(cè)序，得IcsA蛋白序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0074](二）同源敲除IcsA基因驗(yàn)證其功能
[0075] 敲除載體構(gòu)建:根據(jù)IcsA的基因組序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，PCR擴(kuò)增作為上下游同源 臂，連接到敲除載體PK0V21上。lcsA-upF和lcsA-upR擴(kuò)增敲除序列上游同源臂，引物IcsA-downF和I csA-downR擴(kuò)增敲除序列的下游同源臂。
[0076] 下列引物序列中，小寫(xiě)字母為內(nèi)切酶及保護(hù)堿基序列。
[0077] lcsA-upF： tccccgcggggaCTCCTTCGTCCTCTACTGC(下劃線標(biāo)注SacΠ 識(shí)別位點(diǎn)）
[0078] lcsA-upR: aaggaaaaaagcggccgcaaaaggaaaaGCAAGGATAGCGATTCAGG (下劃線標(biāo)注 Not I識(shí)別位點(diǎn)）
[0079] lcsA-downF： cgggatcccgCCTCGTCCCAATTTGCTTT (下劃線標(biāo)注 BamHI 識(shí)別位點(diǎn)）
[0080] I csA-downR： ggaattccGTCGGCTCATCAGTCCCTA(下劃線標(biāo)注 EcoRI 識(shí)別位點(diǎn)）
[00811以P. Iilacinum基因組DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包括如下成 分：
[0082] DNA模板（lOOng/yL): IyL
[0083] 10XPCR buffer：2yL
[0084] dNTPs(25mM):lyL
[0085] 正向引物（IOmM) :0.8yL
[0086] 反向引物（IOmM) :0.8yL
[0087] Taq 酶（5UAiL):0.4yL
[0088] 超純水：14yL
[0089] PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C變性4min;94°C變性30sec;58°C退火30sec;72°C延伸 1111；[11;72°(^延伸10111；[11;35次循環(huán)，循環(huán)時(shí)從94°(^變性40860開(kāi)始到72°(^延伸1111；[11結(jié)束；
[0090] PCR產(chǎn)物與載體PK0V21分別用Sacn和NotI雙酶切，酶切體系為：
[0091] PCR 產(chǎn)物：20yg/pK0V21:10yg
[0092] 10XBuffer：20yL
[0093] SacH ：8yL
[0094] NotI：8yL
[0095] 超純水：補(bǔ)充至200yL
[0096] 酶切體系置于37°C4h。
[0097] 將載體pK0V21和PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接，得到中間載體pK0V21-up。純化按照天 根PCR產(chǎn)物純化試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行，連接的體系如下：
[0098] pK0V21：IOOyg
[0099] PCR 產(chǎn)物：300yg
[0100] 10X Buffer：IyL
[0101] T4 連接酶：lyL
[0102] 超純水：補(bǔ)至IOyL
[0103] 連接體系置于16°C過(guò)夜。
[0104] 將中間載體pK0V21-up和下游同源臂用BamHI和EcoRI雙酶切，然后回收連接。敲除 載體pK0V21-IcsA。具體為：
[0105] PCR產(chǎn)物與載體pK0V21分別用SacII和NotI雙酶切，酶切體系為：
[0106] PCR 產(chǎn)物：20yg/pK0V21:10yg
[0107] 10XBuffer：20yL
[0108] SacII ：8yL
[0109] NotI：8yL
[0110] 超純水:補(bǔ)充至200yL
[0111] 酶切體系置于37°C4h。
[0112] 將載體pK0V21和PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接，得到中間載體pK0V21-up。純化按照天 根PCR產(chǎn)物純化試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行，連接的體系如下：
[0113] pK0V21：IOOyg
[0114] PCR 產(chǎn)物：300yg
[0115] 10X Buffer：IyL
[0116] T4 連接酶：lyL
[0117] 超純水:補(bǔ)至IOyL
[0118] 連接體系置于16°C過(guò)夜。
[0119] (三)P. Iilacinum敲除突變體AlcsA的獲得
[0120] 1.原生質(zhì)體的制備：（1)稱取Ig幼嫩菌絲于50mL離心管中，加入2mL崩潰酶，30°C 85r/min。（2)鏡檢大部分細(xì)胞壁破裂后，用四層擦鏡紙過(guò)濾至50mL離心管中，然后用0.7M NaCl反復(fù)沖洗未過(guò)濾下去的殘留菌絲。（3)4°C，4000r離心15min，舍棄上清。（4)用IOmL STC 重懸原生質(zhì)體沉淀，4°C，4000r離心15min，舍棄上清。（5)用STC重懸原生質(zhì)體沉淀，調(diào)濃度 值2 X IO8個(gè)/mL。
[0121] 2.原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：（1)取5yg單酶切后的pK0V21及IOyL金精三羧酸，用TEC補(bǔ)至60μ L，冰上放置2〇111；[11。（2)取制備好的原生質(zhì)體，冰上解凍lOmin。（3)12000r/min離心2min，吸 取上清至解凍的原生質(zhì)體中，混勻，冰上放置20min。（4)緩慢滴入160yL 60 %PEG，充分混 勾，室溫放置15min。（5)加入ImL STC，混勾，4000r/min離心5min。（6)原生質(zhì)體沉淀用200yL STC重懸。（7) 50yL轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體與3mL 60 °CMM培養(yǎng)基混勻，鋪在預(yù)熱的I3DAS平板上，凝 固后，置于28 °C培養(yǎng)24h。（ 8)在HMS平板上倒5mL T-TOP培養(yǎng)基，內(nèi)含400yg/yL的g418。（ 9) 4d后平板長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子。
[0122] 3.轉(zhuǎn)化子的鑒定：
[0123] (1)將PDAS平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到含有g(shù)418的PDA平板上，待菌落長(zhǎng)大后，挑 去少量菌絲，提取DNA。
[0124] (2)以提取的轉(zhuǎn)化子DNA為模板，用如下三對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系與程序同 上所述，同樣為：
[0125] DNA模板（lOOng/yL): IyL
[0126] 10XPCR buffer ：2yL
[0127] dNTPs(25mM):lyL
[0128] 正向引物（IOmM) :〇.8yL
[0129] 反向引物（IOmM) :0.8yL
[0130] Taq 酶（5UAiL):0.4yL
[0131] 超純水：14yL
[0132] 得出：
[0133] lcsA-checkF: ATAAGTTGCCGATATTGAGG，此序列位于敲除部分。
[0134] lcsA-checkR:TGGTCTTGGGAGGAGTAGA，此序列位于敲除部分。
[0135] lcsAup_checkF:ACGACGGATGCCACGATAC，此序列位于P· Iilacinum基因組上上游同 源臂的上游，檢測(cè)同源置換。
[0136] lcsAup-checkR:TCATCCTACATAAATAGACGC，此序列位于 g418 抗性基因上，檢測(cè)同源 置換。
[0137] lcsAdown-checkF: GGTTGAGTTGGTGACGGAT，此序列位于 g418 抗性基因上，檢測(cè)同源 置換。
[0138] lcsAdown-checkR: AGTACCCAATTCGCCCTAT，此序列位于P · IiIacinum基因組上下游 同源臂的下游，檢測(cè)同源置換。
[0139] 上述第一對(duì)引物不能擴(kuò)增得到目的條帶，第二、三對(duì)引物能夠得到目的條帶，證明 結(jié)果為陽(yáng)性
[0140] 結(jié)果如圖1所示:泳道1、3、5模板為野生型，2、4、6模板為ALcsA，敲除基因在野生 型中存在(泳道1 )，突變體中不存在(泳道2)。同源置換的檢測(cè)在突變體中為陽(yáng)性(泳道4、 6)，在野生型中不能擴(kuò)增出條帶(泳道3、5)。
[0141] 4.轉(zhuǎn)化子化學(xué)表型鑒定。
[0142] P. Iilacinum的野生型菌株P(guān)LBJ-1、轉(zhuǎn)化子進(jìn)行如下方式處理：
[0143] (1)將孢子接種到PDB培養(yǎng)基(200mL)，濃度調(diào)制I X IO5個(gè)/mL，28°C，150r/min震蕩 培養(yǎng)8d。
[0144] (2)將培養(yǎng)體系用等體積的乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮， 最后溶于甲醇，最后用〇. 22μηι濾膜過(guò)濾，收集濾液。
[0145] 采用LC-MS的方法檢測(cè)濾液中是否含有l(wèi)eucinostatin A和Β。
[0146] HPLC分析使用waters公司HPLC system分析系統(tǒng)（Waters e2695,Waters 2998， Photodiode Array Detector)，使用ODS 色譜柱（C18,250 X4.6mm, YMC Pak，5ym)。流動(dòng)相總 流速為lmL/min，流動(dòng)相為梯度設(shè)置甲醇：水（0 . I %甲酸）。質(zhì)譜分析采用Agi lent Accurate-Mass-QTOF LC/MS 6520分析系統(tǒng)，柱后流出液不經(jīng)分流直接進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)。
[0147] HPLC分析見(jiàn)圖2,圖2的A部分中，Standard為leucinostatin標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于澳大利亞 Bioaustralis公司，WT為野生型，ALcsA為敲除突變體。LeucinostatinA和B標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)于 17.2min和17.6min處，在野生型中，存在這兩個(gè)峰，質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，這兩個(gè)峰的分子量 分別為1218.9和1204.9，在敲除突變體ALcsA這個(gè)兩個(gè)峰消失。圖2的B部分為圖1中陰影部 分的放大。
[0148] 以上結(jié)果表明，在IcsA基因敲除之后，P. Iilacinum不能產(chǎn)生leucinostatins，說(shuō) 明IcsA參與了 Ieucinostatins的合成途徑。
[0149] 5 · Leucinostatins合成基因族的確定
[0150] 在破壞IcsA基因表達(dá)之后，P. Iilacinum不再產(chǎn)生leucinostatins，而在真菌中， 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇往往會(huì)共表達(dá)，因此，整個(gè)基因簇中基因的表達(dá)量會(huì)同時(shí)下降，通 過(guò)RT-PCR可以鑒定出基因簇中包括哪些基因。操作方法如下：
[0151 ] (I )Trizol法提取總RNA，溶于DEPC水，電泳檢測(cè)合格后，用于下游試驗(yàn)。
[0152] (2)第一鏈cDNA的合成按照天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。
[0153] 擴(kuò)增體系包括：
[0154] cDNA：0.5yL
[0155] 2XRT-PCR MIX(TAKARA)：7.5yL
[0156] 正向引物:0.5yL
[0157] 反向引物:0.5yL
[0158] 超純水:補(bǔ)至15yL
[0159] 擴(kuò)增程序?yàn)?94°C變性30sec; 94°C變性IOsec; 60 °C退火30sec; 40次循環(huán)，循環(huán)時(shí) 從94°C變性IOsec開(kāi)始到60°C退火30sec。溶解曲線測(cè)定:65°C至95°C梯度增溫，每5sec增加 0.5Γ。
[0160] 檢測(cè)基因 IcsA以及側(cè)翼基因在野生型和敲除突變體ALcsA中表達(dá)量的差異，計(jì)算 方法采用法。Actin基因作為內(nèi)參基因，其序列為：
[0161] ActF：GCCCTCTGTCCTGGGTCTT
[0162] ActR：ACAGGGAGGCGAGAATGGA
[0163] 表1為RT-PCR引物序列，其中，引物a、b、c、d為基因簇5'端4個(gè)基因的檢測(cè)引物，e、 f、g、h為基因族3端4個(gè)基因的檢測(cè)引物。
[0164] 表1RT-PCR引物序列

[0167] qRT-PCR的分析結(jié)果如圖3所示，圖中縱坐標(biāo)為基因在野生型中的表達(dá)量與在敲除 突變體ALcsA中表達(dá)量的比值。IcsA由于在突變體中已經(jīng)敲除，沒(méi)有表達(dá)量，所以該比值空 缺。在其3'端，e、f、g、h四個(gè)基因表達(dá)量差異很小，并且表達(dá)量很低，不參與Ieucinostatins 的合成，因此確定該基因簇邊界為lcsA。在IcsA的3'端，連續(xù)19個(gè)基因（lcsG-lcsT)(圖3)的 表達(dá)量在野生型中明顯高于ALcsA中，其中表達(dá)量差異最小的為lcsQ，發(fā)生4倍的表達(dá)量變 化，最大的為lcsH，表達(dá)量差異為110倍。在IcsG的3'端，a、b、c、d四個(gè)基因表達(dá)量差異很小， 并且表達(dá)量很低，不參與leucinos tat ins的合成。因此，結(jié)合這些基因的功能分析，確定 leucinostat ins合成基因族的邊界為IcsG-I csA，共20個(gè)基因參與了 leucinostat ins的合 成途徑。
[0168] 以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā) 明說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng) 域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種參與抗生素 leucinostatin A合成的基因簇，其特征在于，該基因簇核苷酸序列 如SEQ ID N0.1所示，編碼抗生素 leucinostatin A合成所涉及的20個(gè)基因的氨基酸序列具 體如下： (1) lcsA:編碼NRPS合成酶，lcsA的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的 第63670~99575個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示； (2) lcsB:編碼PKS合成酶，lcsB的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的第 20959~29243個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示； (3) lcsC:編碼PKS合成酶，lcsC的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列第 40712~48967個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示； (4) lcsD:編碼Acyl-CoA連接酶，lcsD的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序 列第49241~50502個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示； (5) lcsE:編碼硫酯酶，lcsE的核苷酸序列位于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列第57716 ~58718個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示； (6) lcsF:編碼轉(zhuǎn)錄因子，lcsF的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列第 37587~39353個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示； (7) lcsG:編碼0-甲基轉(zhuǎn)移酶，lcsG的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列 第1~1515個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示； (8) lcsH:編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，lcsG的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列第 1884~7298個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示； (9) lcsl:編碼細(xì)胞色素 P450氧化酶，lcsG的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷 酸序列第9095~10865個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示； (10) lcsJ:編碼硫酯酶，lcsj的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列第 11061~11990個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:11所示； (11) lcsK編碼細(xì)胞色素 P450氧化酶，lcsK的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷 酸序列第13352~15052個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示； (12) lcSL:編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，lcsL的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列 第16232~16973個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:13所示； (13) lcsM:編碼未知功能蛋白，lcsM的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列 第19388~19636個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:14所示； (14) lcsN:編碼細(xì)胞色素 P450氧化酶，lcsN的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷 酸序列第30268~31402個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示； (15) lcs0:編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，lcsO的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列 第31871~35196個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:16所示； (16) lcSP:編碼氨基轉(zhuǎn)移酶，lcsP的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列第 35400~36761個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:17所示； (17) lcsQ:編碼tRNA合成酶，lcsQ的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列第 53126~54338個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:18所示； (18) lcsR:編碼水解酶，lcsR的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列第 54706~56166個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:19所示； (19) lcsS:編碼未知蛋白，lcsS的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列第 58953~59534個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示； (20) lcsT:編碼差向異構(gòu)酶，lesT的核苷酸序列位于SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列第 61311~62251個(gè)堿基處，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:21所示。2. -種參與抗生素 leucinostatin A合成的相關(guān)蛋白，其特征在于，所述的蛋白氨基酸 序列選自如SEQ ID NO:2~21任一所示的氨基酸序列。3. 參與抗生素 leucinostatin A合成的相關(guān)基因，其特征在于，所述合成的相關(guān)基因編 碼權(quán)利要求2所述的參與抗生素 leucinostatin A合成的相關(guān)蛋白。4. 一種表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體含有權(quán)利要求1所述的抗生素 leucinostatin A合成的基因簇或權(quán)利要求3所述的參與抗生素 leucinostatin A合成的相 關(guān)基因。5. -種重組的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求4所述的表達(dá)載 體，或其染色體上整合有外緣的權(quán)利要求1所述的參與抗生素 leucinostatin A合成的基因 簇或權(quán)利要求3所述的參與抗生素 leucinostatin A合成的相關(guān)基因。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的參與抗生素 leucinostatin A合成的基因簇，其特征在于，所 述的基因簇也參與抗生素 leucinostatin B的合成。7. -種根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的基因簇的用途，其特征在于，其編碼蛋白用于合成抗 生素 leucinostatin A或B〇
【文檔編號(hào)】C12N9/16GK105861523SQ201610042013
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年1月22日
【發(fā)明人】謝丙炎, 茆振川, 楊宇紅, 王剛, 凌鍵
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所