黑曲霉在制備黃芪甲苷中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了黑曲霉在制備黃芪甲苷中的應(yīng)用。該應(yīng)用具體可為制備黃芪甲苷的方法。該制備黃芪甲苷的方法包括用黑曲霉發(fā)酵黃芪藥渣，得到黃芪藥渣黑曲霉發(fā)酵物，從所述黃芪藥渣黑曲霉發(fā)酵物中提取得到黃芪甲苷。實(shí)驗(yàn)證明，黃芪藥渣經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，提高了黃芪甲苷的得率：黃芪藥渣經(jīng)黑曲霉ACCC 30583發(fā)酵后按照相同的提取方法提取得到的黃芪甲苷的產(chǎn)量是未經(jīng)發(fā)酵的黃芪藥渣的5.4倍；黃芪藥渣經(jīng)黑曲霉ACCC 30784發(fā)酵后按照相同的提取方法提取得到的黃芪甲苷的產(chǎn)量是未經(jīng)發(fā)酵的黃芪藥渣的2.7倍；黃芪藥渣經(jīng)黑曲霉ACCC 30177發(fā)酵后按照相同的提取方法提取得到的黃芪甲苷的產(chǎn)量是未經(jīng)發(fā)酵的黃芪藥渣的4.8倍。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
黑曲霉在制備黃庚甲昔中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物領(lǐng)域中黑曲霉的用途，特別設(shè)及黑曲霉在制備黃巧甲巧中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥是我國(guó)的傳統(tǒng)藥物，近年來(lái)隨著我國(guó)中醫(yī)藥事業(yè)的不斷發(fā)展，中成藥在我國(guó) 乃至國(guó)際上的市場(chǎng)份額越來(lái)越大，使得我國(guó)中成藥生產(chǎn)和中藥加工企業(yè)數(shù)量不斷增多，運(yùn) 就必然使中藥廢棄物中藥藥渣大量增加，如果不能對(duì)中藥藥渣進(jìn)行及時(shí)的處理，就會(huì)發(fā)生 如貴州百靈的"藥渣村"、哈藥的"污染1'了'等事件，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。有報(bào)道顯 示，截止到2010年我國(guó)有1636家中藥企業(yè)，每年消耗植物藥材高達(dá)70萬(wàn)噸，產(chǎn)生了大量的中 藥藥渣。受中藥生產(chǎn)工藝的限制，各中藥企業(yè)對(duì)中藥有效成分提取率較低，中藥藥渣中還含 有大量的有效成分，具有較高的利用價(jià)值，如何正確處理中藥藥渣已成為目前研究的重點(diǎn)。
[0003] 中藥藥渣是中藥材提取其有效成分后的殘留物，在中藥提取工業(yè)上一般作為廢棄 物處理。目前工業(yè)上對(duì)中藥藥渣的處理方法主要為堆放、填埋W及焚燒等，如果采用焚燒方 式處理，藥渣在焚燒過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的有毒有害氣體，污染大氣，而且濕物料也會(huì)給焚燒 帶來(lái)困難;如果采用堆放、填埋等方式處理，藥渣會(huì)發(fā)生腐敗，產(chǎn)生大量的刺激性氣味，嚴(yán)重 污染了周邊的環(huán)境。中藥材中有效成分含量較低，加上提取工藝落后，中成藥生產(chǎn)往往產(chǎn)生 大量的中藥藥渣，所W中藥藥渣具有體積大、產(chǎn)量多等特點(diǎn)。由于中藥藥渣具有體積大，產(chǎn) 量多的特點(diǎn)，所W中藥藥渣W堆放為主，對(duì)中藥藥渣進(jìn)行堆放處理，不僅浪費(fèi)了藥渣中殘留 的有效成分，造成了資源浪費(fèi)，同時(shí)對(duì)周邊的水±資源造成污染，對(duì)人們的生產(chǎn)生活帶來(lái)嚴(yán) 重的危害。
[0004] 根據(jù)《2010版中華人民共和國(guó)藥典第一部》對(duì)黃巧的規(guī)定可知，黃巧為豆科植物蒙 古黃巧（Astragalus membranaceus(Fisch. )Bge. var.mongholiCUS(Bge. )Hsiao)或膜芙黃 巧(Astragalus membranaceus(Fisch. )Bge)的干燥根。皂巧類(lèi)是黃巧藥材的主要有效成分 之一，目前已經(jīng)從黃巧藥材中分離出黃巧巧、異黃巧巧等40多種皂巧。近年來(lái)隨著對(duì)黃巧皂 巧類(lèi)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)黃巧皂巧除了具有免疫調(diào)節(jié)作用外，還有抗病毒、抗腫瘤、降血 糖W及改善屯、血管疾病等作用。Wang等研究表明，黃巧甲巧可W促進(jìn)小鼠抗體生長(zhǎng)和T，B淋 己細(xì)胞增殖，提高小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何W黃巧藥渣為原料制備黃巧甲巧。
[0006] 為了解決W上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了黑曲霉在制備黃巧甲巧中的應(yīng)用。
[0007] 上述應(yīng)用中，所述黑曲霉可為黑曲霉ACCC 30583、黑曲霉ACCC 30177或黑曲霉 ACCC 30784O
[000引為了解決W上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了利用黑曲霉制備黃巧甲巧的方法。
[0009]本發(fā)明所提供的制備黃巧甲巧的方法，包括用黑曲霉發(fā)酵黃巧藥渣，得到黃巧藥 渣黑曲霉發(fā)酵物，從所述黃巧藥渣黑曲霉發(fā)酵物中提取得到黃巧甲巧。
[0010]上述方法中，用黑曲霉發(fā)酵黃巧藥渣，得到黃巧藥渣黑曲霉發(fā)酵物的方法包括將 所述黑曲霉接入含有黃巧藥渣的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到黃巧藥渣黑曲霉發(fā)酵物。
[00川上述方法中，所述黑曲霉可為黑曲霉ACCC 30583、黑曲霉ACCC 30177或黑曲霉 ACCC 30784O
[0012]上述方法中，所述含有黃巧藥渣的發(fā)酵培養(yǎng)基可按照如下方法制備:將含水量為 50%-60%的物料進(jìn)行滅菌得到所述含有黃巧藥渣的發(fā)酵培養(yǎng)基;所述物料由下述質(zhì)量份 的原料組成：10質(zhì)量份的黃巧藥渣、0.03-0.12質(zhì)量份(如0.03-0.06質(zhì)量份或0.06質(zhì)量份） 的氮源、1.2質(zhì)量份的K出K)4和0.6質(zhì)量份的MgS化? 7出0。
[OOU]上述方法中，所述氮源可為尿素、KN03、(馳)2S〇4、酵母粉、牛肉膏或/和蛋白腺。
[0014] 上述方法中，所述培養(yǎng)是在28 °C培養(yǎng)5-8天或5天。
[0015] 為了解決W上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了用于制備黃巧甲巧的成套產(chǎn)品。
[0016] 本發(fā)明所提供的用于制備黃巧甲巧的成套產(chǎn)品，包括所述黑曲霉和所述含有黃巧 藥渣的發(fā)酵培養(yǎng)基;所述黑曲霉和所述含有黃巧藥渣的發(fā)酵培養(yǎng)基均獨(dú)立包裝。
[0017] 所述含有黃巧藥渣的發(fā)酵培養(yǎng)基也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0018] 上述含有黃巧藥渣的發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述黃巧藥渣的粒徑(直徑)可為0.8-1.2cm 或2mm至4mm。
[0019] 本發(fā)明的黃巧藥渣是指用水提取黃巧有效成分后殘留的殘?jiān)?。黃巧藥渣具體可W 按照W下方法制備，將黃巧加水煮沸2-3次，過(guò)濾收集濾渣，該濾渣即為黃巧藥渣。
[0020] 實(shí)驗(yàn)證明，黃巧藥渣經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，提高了黃巧甲巧的得率:黃巧藥渣經(jīng)黑曲霉 ACCC 30583發(fā)酵后按照相同的提取方法提取得到的黃巧甲巧的產(chǎn)量是未經(jīng)發(fā)酵的黃巧藥 渣的5.4倍;黃巧藥渣經(jīng)黑曲霉ACCC 30784發(fā)酵后按照相同的提取方法提取得到的黃巧甲 巧的產(chǎn)量是未經(jīng)發(fā)酵的黃巧藥渣的2.7倍;黃巧藥渣經(jīng)黑曲霉ACCC 30177發(fā)酵后按照相同 的提取方法提取得到的黃巧甲巧的產(chǎn)量是未經(jīng)發(fā)酵的黃巧藥渣的4.8倍。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為黃巧甲巧標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜。箭頭示黃巧甲巧色譜峰。
[0022] 圖2為從黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物中提取的黃巧甲巧樣品的HPLC圖 譜。箭頭示黃巧甲巧色譜峰。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為 常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0024] 下述實(shí)施例中的黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC 30784于2006年5月11日收藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中屯、(簡(jiǎn)稱(chēng)ACCC，地址:北京市海淀區(qū)中關(guān)村 南大街12號(hào)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，郵編100081)，自該收藏日起公 眾可從中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中屯、獲得該菌株。黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC 30784在下文中簡(jiǎn)稱(chēng)黑曲霉ACCC 30784。
[00巧]下述實(shí)施例中的黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC 30177于1989年6月8日收藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中屯、(簡(jiǎn)稱(chēng)ACCC，地址:北京市海淀區(qū)中關(guān)村南 大街12號(hào)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，郵編100081 )，自該收藏日起公眾 可從中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中屯、獲得該菌株。黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC 30177在下文中簡(jiǎn)稱(chēng)黑曲霉ACCC 30177。
[00%] 下述實(shí)施例中的黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC 30583于2006年7月21日收藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中屯、(簡(jiǎn)稱(chēng)ACCC，地址:北京市海淀區(qū)中關(guān)村 南大街12號(hào)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，郵編100081)，自該收藏日起公 眾可從中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中屯、獲得該菌株。黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC 30583在下文中簡(jiǎn)稱(chēng)黑曲霉ACCC 30583。
[0027] 實(shí)施例1、利用黑曲霉制備黃巧甲巧
[0028] 本實(shí)施例所用的培養(yǎng)基如下：
[0029] PDA:馬鈴馨去皮，200g切成小塊，加水煮沸30min，4層紗布過(guò)濾，加20g葡萄糖，瓊 脂17g，蒸饋水定容到1000 mL,煮沸混勻，12rC條件下滅菌20分鐘，得到PDA培養(yǎng)基。
[0030] PD:馬鈴馨去皮，200g切成小塊，加水煮沸30min，4層紗布過(guò)濾，加20g葡萄糖，蒸饋 水定容到1000 mL,煮沸混勻，121°C條件下滅菌20分鐘，得到PD培養(yǎng)基。
[0031] 黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基：直徑為2mm至4mm的黃巧藥渣10.0g( W干重計(jì)），尿素 0.03邑，1(此口04 1.2邑，1邑504*7出0 0.6邑，調(diào)整運(yùn)些物料的含水量為60%、口巧直為7.0，1211： 條件下滅菌20分鐘，得到黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0032] 本實(shí)施例所用的黃巧藥渣均按照如下方法制備：
[0033] 將100g黃巧飲片(合肥樂(lè)家老鋪中藥飲片有限公司，產(chǎn)地四川，批號(hào)13060501)置 于燒杯中，加冷純水浸泡lh(加水量W剛好泡透藥材為準(zhǔn)）；煎煮時(shí)再加藥物總量的10倍冷 純水(約lOOOmL)。先武火煮沸，沸騰后改用文火保持微沸60min，濾取藥液。藥渣再加50°C左 右溫水進(jìn)行第二次煎煮，方法同前，濾取藥液，留取藥渣，得到黃巧藥渣。
[0034] 1、黑曲霉發(fā)酵黃巧藥渣制備黑曲霉黃巧渣固體發(fā)酵物
[0035] 本實(shí)施例利用黑曲霉ACCC 30583、黑曲霉ACCC 30784和黑曲霉ACCC 30177在相同 的條件下分別發(fā)酵黃巧藥渣，得到了黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物、黑曲霉ACCC 30784黃巧渣固體發(fā)酵物和黑曲霉ACCC 30177黃巧渣固體發(fā)酵物運(yùn)S種黑曲霉黃巧渣固體 發(fā)酵物，運(yùn)=種黑曲霉黃巧渣固體發(fā)酵物的制備方法的區(qū)別僅在于所用的黑曲霉菌株不 同。運(yùn)=種黑曲霉黃巧渣固體發(fā)酵物的制備方法具體如下：
[0036] 1.1、黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物的制備
[0037] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次重復(fù)的方法如下:將黑曲霉ACCC 30583接種于PDA平板，接種環(huán) 挑取黑曲霉ACCC 30583抱子，無(wú)菌水稀釋成1 X IO8C化/血的懸液，1 % (V/V)接種量接種PD， 28°C，160rpm培養(yǎng)24小時(shí)后得種子液，再將種子液Wl%(V/V)接種量接種于裝有50g黃巧渣 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中28°C培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到黑曲霉 ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物。每次重復(fù)設(shè)10個(gè)錐形瓶。
[0038] 1.2、黑曲霉ACCC 30784黃巧渣固體發(fā)酵物的制備
[0039] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次重復(fù)的方法如下:將黑曲霉ACCC 30784接種于PDA平板，接種環(huán) 挑取黑曲霉ACCC 30784抱子，無(wú)菌水稀釋成1 X IO8CfuAiL的懸液，1 % (V/V)接種量接種PD， 28°C，160rpm培養(yǎng)24小時(shí)后得種子液，再將種子液Wl%(V/V)接種量接種于裝有50g黃巧渣 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中28°C培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到黑曲霉 ACCC 30784黃巧渣固體發(fā)酵物。每次重復(fù)設(shè)10個(gè)錐形瓶。
[0040] 1.3、黑曲霉ACCC 30177黃巧渣固體發(fā)酵物的制備
[0041] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次重復(fù)的方法如下:將黑曲霉ACCC 30177接種于PDA平板，接種環(huán) 挑取黑曲霉ACCC 30177抱子，無(wú)菌水稀釋成1 X IO8CfVmL的懸液，1 % (V/V)接種量接種PD， 28°C，160rpm培養(yǎng)24小時(shí)后得種子液，再將種子液Wl%(V/V)接種量接種于裝有50g黃巧渣 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中28°C培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到黑曲霉 ACCC 30177黃巧渣固體發(fā)酵物。每次重復(fù)設(shè)10個(gè)錐形瓶。
[0042] 2、從黑曲霉黃巧渣固體發(fā)酵物中提取黃巧甲巧
[0043] 2.1從黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物中提取黃巧甲巧
[0044] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次重復(fù)的方法如下:取黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物lOg， 加入IOOmL的蒸饋水浸泡30min，煮沸并保持微沸30min，過(guò)濾收集濾液(將該濾液稱(chēng)為濾液 1);向?yàn)V渣中加入IOOmL的蒸饋水，煮沸并保持微沸30min，過(guò)濾收集濾液(將該濾液稱(chēng)為濾 液2)，合并濾液1和濾液2，于4000r/min離屯、IOmin，取上清液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至IOmL， 用水飽和正下醇振搖萃取4次，每次40mL，合并正下醇相，用氨液充分洗涂2次，每次40mL，棄 去氨液，將正下醇液蒸干，殘?jiān)铀?mL使溶解，通過(guò)DlOl型大孔吸附樹(shù)脂柱（內(nèi)徑1.5cm，柱 高12cm)，W水50mL洗脫，棄去水洗脫出來(lái)的液體，再用40 %乙醇水溶液30mL洗脫，棄去洗脫 出的液體，繼用70%乙醇水溶液SOmL洗脫，收集洗脫液(洗脫出的液體），蒸干，得到從黑曲 霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物中提取的黃巧甲巧樣品。用甲醇溶解該黃巧甲巧樣品，并 定容至IOmL ,HPLC檢測(cè)。
[0045] 2.2從黑曲霉ACCC 30784黃巧渣固體發(fā)酵物中提取黃巧甲巧
[0046] 與步驟2.1的區(qū)別僅在于將步驟2.1的黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物替換 為黑曲霉ACCC 30784黃巧渣固體發(fā)酵物。
[0047] 2.3從黑曲霉ACCC 30177黃巧渣固體發(fā)酵物中提取黃巧甲巧
[004引與步驟2.1的區(qū)別僅在于將步驟2.1的黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物替換 為黑曲霉ACCC 30177黃巧渣固體發(fā)酵物。
[0049] 3、從黃巧藥渣中提取黃巧甲巧
[0050] 同時(shí)從黃巧藥渣中按照步驟2.1的方法提取黃巧甲巧，作為對(duì)照。其與步驟2.1的 區(qū)別僅在于將步驟2.1的黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物替換為黃巧藥渣。
[0051 ] 4、HPLC檢測(cè)黃巧甲巧
[0052]取黃巧甲巧(標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)110781-201314,中國(guó)食品藥品研究所），用甲醇溶解定 容，進(jìn)行HPLC制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0化3] HPLC色譜條件:采用是安捷倫1100液相色譜工作站，色譜柱是:ZORBAX SB-C18250 X4.6mm 5皿C18 880975-902,流動(dòng)相：乙臘:水(體積比）= 30:70;流速：lmL/min;檢測(cè)波 長(zhǎng):210nm;柱溫：30°C;進(jìn)樣量：10化。
[0054]結(jié)果表明，黃巧藥渣未經(jīng)發(fā)酵，W干重計(jì)，每克黃巧藥渣能得到0.131±0.004mg黃 巧甲巧;黑曲霉ACCC 30583發(fā)酵黃巧藥渣，W干重計(jì)，每克黃巧藥渣經(jīng)黑曲霉ACCC 30583發(fā) 酵后能得到0.713 ± 0.003mg黃巧甲巧;黑曲霉ACCC 30784發(fā)酵黃巧藥渣，W干重計(jì)，每克黃 巧藥渣經(jīng)黑曲霉ACCC 30784發(fā)酵后能得到0.354±0.004mg黃巧甲巧;黑曲霉ACCC 30177發(fā) 酵黃巧藥渣，W干重計(jì)，每克黃巧藥渣經(jīng)黑曲霉ACCC 30177發(fā)酵后可W得到0.632 ± 0.002mg黃巧甲巧。黃巧藥渣經(jīng)黑曲霉ACCC 30583發(fā)酵后按照相同的提取方法提取得到的 黃巧甲巧的產(chǎn)量是未經(jīng)發(fā)酵的黃巧藥渣的5.4倍;黃巧藥渣經(jīng)黑曲霉ACCC 30784發(fā)酵后按 照相同的提取方法提取得到的黃巧甲巧的產(chǎn)量是未經(jīng)發(fā)酵的黃巧藥渣的2.7倍;黃巧藥渣 經(jīng)黑曲霉ACCC 30177發(fā)酵后按照相同的提取方法提取得到的黃巧甲巧的產(chǎn)量是未經(jīng)發(fā)酵 的黃巧藥渣的4.8倍。說(shuō)明黃巧藥渣經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，提高了黃巧甲巧的得率，相同的黃巧 藥渣經(jīng)不同的黑曲霉菌株在相同條件下發(fā)酵產(chǎn)生的黑曲霉黃巧渣固體發(fā)酵物，按照相同的 提取方法提取到的黃巧甲巧質(zhì)量不同，每克黃巧藥渣經(jīng)黑曲霉ACCC 30583發(fā)酵后提取到的 黃巧甲巧質(zhì)量是黑曲霉ACCC 30177的1.13倍，是黑曲霉ACCC 30784的2.Ol倍。
[0055] 實(shí)施例2、黑曲霉ACCC 30583發(fā)酵黃巧藥渣的條件優(yōu)化
[0056] 1、氮源種類(lèi)對(duì)黃巧甲巧產(chǎn)量的影響
[0057] 所用的氮源種類(lèi)優(yōu)化黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基如下:直徑為0.8-1.2cm的黃巧藥渣 10.0旨（^干重計(jì)），氮源1.2旨，1(出?04 1.2旨，1旨504.7此0 0.6旨，調(diào)整運(yùn)些物料的含水量為 50%、pH值為7.0，12rC條件下滅菌20分鐘，得到氮源種類(lèi)優(yōu)化黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基。其 中，氮源為(NH4)2S化、KN03、尿素、牛肉膏、酵母粉或蛋白腺。
[005引實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次重復(fù)的方法如下:將黑曲霉ACCC 30583接種于PDA平板，接種環(huán) 挑取黑曲霉ACCC 30583抱子，無(wú)菌水稀釋成1 X IO8C化/血的懸液，1 % (V/V)接種量接種PD， 28°C，ieOrpm培養(yǎng)24小時(shí)后得種子液，再將種子液Wl % (V/V)接種量接種于裝有50g氮源種 類(lèi)優(yōu)化黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，28°C培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物 質(zhì)，得到黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物。每次重復(fù)設(shè)10個(gè)錐形瓶。
[0059] 按照實(shí)施例1步驟2的方法從黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物中提取黃巧甲 巧，按照實(shí)施例1步驟4的方法HPLC檢測(cè)黃巧甲巧。結(jié)果表明黑曲霉ACCC 30583在W尿素為 氮源的氮源種類(lèi)優(yōu)化黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵黃巧藥渣的黃巧甲巧產(chǎn)量最高，W干重 計(jì)，每克黃巧藥渣能產(chǎn)生〇.673mg的黃巧甲巧(表1)。
[0060] 表1、氮源種類(lèi)對(duì)黃巧甲巧產(chǎn)量的影響 「00611
[0062] 2、尿素含量對(duì)黃巧甲巧產(chǎn)量的影響
[0063] 所用的尿素含量?jī)?yōu)化黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基如下:直徑為0.8-1.2cm的黃巧藥渣 10.0旨（^干重計(jì)），尿素，1(此?04 1.2旨，1旨504?7此0 0.6旨，調(diào)整運(yùn)些物料的含水量為50%、 pH值為7.0，12rC條件下滅菌20分鐘，得到尿素含量?jī)?yōu)化黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基。其中，尿 素的質(zhì)量為O.Olg(是黃巧藥渣質(zhì)量的0.1%)、0.02邑(是黃巧藥渣質(zhì)量的0.2%)、0.03邑(是 黃巧藥渣質(zhì)量的0.3%)、0.04肖（是黃巧藥渣質(zhì)量的0.4%)、0.05肖（是黃巧藥渣質(zhì)量的 0.5%)或0.06g(是黃巧藥渣質(zhì)量的0.6%)。每次重復(fù)設(shè)10個(gè)錐形瓶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次重 復(fù)的方法如下：將黑曲霉ACCC 30583接種于PDA平板，接種環(huán)挑取黑曲霉ACCC 30583抱子， 無(wú)菌水稀釋成1 X IO8C化/血的懸液，1 % (V/V)接種量接種PD，28°C，ieOrpm培養(yǎng)24小時(shí)后得 種子液，再將種子液Wl%(V/V)接種量接種于裝有50g尿素含量?jī)?yōu)化黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng) 基的500ml錐形瓶中28°C培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到黑曲霉ACCC 30583黃 巧渣固體發(fā)酵物。
[0064] 按照實(shí)施例1步驟2的方法從黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物中提取黃巧甲 巧，按照實(shí)施例1步驟4的方法HPLC檢測(cè)黃巧甲巧。結(jié)果表明黑曲霉ACCC 30583在尿素質(zhì)量 是黃巧藥渣質(zhì)量的0.3 %-0.6 %的尿素含量?jī)?yōu)化黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵黃巧藥渣的 黃巧甲巧產(chǎn)量均較高，W干重計(jì)，每克黃巧藥渣能產(chǎn)生0.668-0.684mg的黃巧甲巧(表2)。
[0065] 表2、尿素含量對(duì)黃巧甲巧產(chǎn)量的影響 「mAAl LUU6/」；3、友酔町間河黃氏甲甘廣重的寮刈曰」
[006引所用的黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基:直徑為0.8-1.2cm的黃巧藥渣10.0g( W干重計(jì)）， (畑4)2504 1.2旨，1(此？04 1.2旨，1旨504.7此0 0.6旨，調(diào)整運(yùn)些物料的含水量為50%、9制直為 7.0，12rC條件下滅菌20分鐘，得到黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0069] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次重復(fù)的方法如下:將黑曲霉ACCC 30583接種于PDA平板，接種環(huán) 挑取黑曲霉ACCC 30583抱子，無(wú)菌水稀釋成1 X IO8C化/血的懸液，1 % (V/V)接種量接種PD， 28°C，ieOrpm培養(yǎng)24小時(shí)后得種子液，再將種子液Wl % (V/V)接種量接種于裝有50g尿素含 量?jī)?yōu)化黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中28 °C分別培養(yǎng)3天、4天、5天、6天、7天或8 天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)，得到黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物。每次重復(fù)設(shè)10 個(gè)錐形瓶。
[0070] 按照實(shí)施例1步驟2的方法從黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物中提取黃巧甲 巧，按照實(shí)施例1步驟4的方法HPLC檢測(cè)黃巧甲巧。結(jié)果表明黑曲霉ACCC 30583在黃巧渣固 體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵黃巧藥渣5-8天的黃巧甲巧產(chǎn)量均較高，W干重計(jì)，每克黃巧藥渣能產(chǎn) 生0.671-0.682mg的黃巧甲巧(表3)。
[0071] 表3、發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃巧甲巧產(chǎn)量的影響 「00701

L〇〇73」4、黃巧藥渣粒度對(duì)黃巧甲巧產(chǎn)量的影響
[0074] 所用的黃巧藥渣粒度優(yōu)化固體發(fā)酵培養(yǎng)基如下：黃巧藥渣10.0g( W干重計(jì)）， (畑4)25〇4 1.2旨，1(此？〇4 1.2旨，1旨5〇4.7此0 0.6旨，調(diào)整運(yùn)些物料的含水量為50%、9制直為 7.0，12rC條件下滅菌20分鐘，得到黃巧藥渣粒度優(yōu)化固體發(fā)酵培養(yǎng)基。其中，黃巧藥渣的 粒度為直徑0.8-1.2cm、2mm至4mm或小于2mm。
[0075] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次重復(fù)的方法如下:將黑曲霉ACCC 30583接種于PDA平板，接種環(huán) 挑取黑曲霉ACCC 30583抱子，無(wú)菌水稀釋成1 X IO8C化/血的懸液，1 % (V/V)接種量接種PD， 28°C，160rpm培養(yǎng)24小時(shí)后得種子液，再將種子液Wl%(V/V)接種量接種于裝有50g黃巧藥 渣粒度優(yōu)化固體發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中28°C分別培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物 質(zhì)，得到黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物。每次重復(fù)設(shè)10個(gè)錐形瓶。
[0076] 按照實(shí)施例1步驟2的方法從黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物中提取黃巧甲 巧，按照實(shí)施例1步驟4的方法HPLC檢測(cè)黃巧甲巧。結(jié)果表明黑曲霉ACCC 30583在黃巧藥渣 的直徑為0.8-1.2cm和黃巧藥渣的直徑為2mm至4mm的黃巧藥渣粒度優(yōu)化固體發(fā)酵培養(yǎng)基的 黃巧甲巧產(chǎn)量均較高，W干重計(jì)，每克黃巧藥渣能產(chǎn)生0.624-0.673mg的黃巧甲巧(表4)。
[0077] 表4、黃巧藥渣粒度對(duì)黃巧甲巧產(chǎn)量的影響
[0079] 5、發(fā)酵培養(yǎng)基含水量對(duì)黃巧甲巧產(chǎn)量的影響
[0080] 所用的含水量?jī)?yōu)化黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基:直徑為0.8-1.2cm的黃巧藥渣10 . Og (^干重計(jì)），（畑4)25〇4 1.2旨，1(此？〇4 1.2旨，1旨5〇4*7此0 0.6旨，調(diào)整運(yùn)些物料的含水量為 30 %、40 %、50%、60%、70%或80%，調(diào)整運(yùn)些物料的抑值為7.0，12rC條件下滅菌20分鐘， 得到含水量?jī)?yōu)化黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基。每次重復(fù)設(shè)10個(gè)錐形瓶。
[0081] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次重復(fù)的方法如下:將黑曲霉ACCC 30583接種于PDA平板，接種環(huán) 挑取黑曲霉ACCC 30583抱子，無(wú)菌水稀釋成1 X IO8C化/血的懸液，1 % (V/V)接種量接種PD， 28°C，ieOrpm培養(yǎng)24小時(shí)后得種子液，再將種子液Wl % (V/V)接種量接種于裝有50g含水量 優(yōu)化黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中28°C培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)， 得到黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物。
[0082] 按照實(shí)施例1步驟2的方法從黑曲霉ACCC 30583黃巧渣固體發(fā)酵物中提取黃巧甲 巧，按照實(shí)施例1步驟4的方法HPLC檢測(cè)黃巧甲巧。結(jié)果表明黑曲霉ACCC 30583在含水量為 60%的含水量?jī)?yōu)化黃巧渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵黃巧藥渣的黃巧甲巧產(chǎn)量最高，W干重 計(jì)，每克黃巧藥渣能產(chǎn)生〇.672mg的黃巧甲巧(表5)。
[0083] 表5、發(fā)酵培養(yǎng)基含水量對(duì)黃巧甲巧產(chǎn)量的影響
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 制備黃芪甲苷的方法，包括用黑曲霉發(fā)酵黃芪藥渣，得到黃芪藥渣黑曲霉發(fā)酵物，從 所述黃芪藥渣黑曲霉發(fā)酵物中提取得到黃芪甲苷。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：用黑曲霉發(fā)酵黃芪藥渣，得到黃芪藥渣黑 曲霉發(fā)酵物的方法包括將所述黑曲霉接入含有黃芪藥渣的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到黃芪藥 渣黑曲霉發(fā)酵物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述黑曲霉為黑曲霉ACCC 30583、黑曲 霉ACCC 30177或黑曲霉ACCC 30784。4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于:所述含有黃芪藥渣的發(fā)酵培養(yǎng)基按 照如下方法制備:將含水量為50%_60%的物料進(jìn)行滅菌得到所述含有黃芪藥渣的發(fā)酵培 養(yǎng)基;所述物料由下述質(zhì)量份的原料組成：1〇質(zhì)量份的黃芪藥渣、0.03-0.12質(zhì)量份的氮源、 1.2質(zhì)量份的KH 2P〇4和0.6質(zhì)量份的MgS〇4 · 7H20。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述氮源為尿素、KN〇3、（NH4)2S〇4、酵母粉、 牛肉膏或/和蛋白胨。6. 根據(jù)權(quán)利要求4-5中任一所述的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)是在28°C培養(yǎng)5-8天或5 天。7. 用于制備黃芪甲苷的成套產(chǎn)品，包括權(quán)利要求1-3中任一所述方法中的所述黑曲霉 和權(quán)利要求2-5中任一所述方法中的所述含有黃芪藥渣的發(fā)酵培養(yǎng)基;所述黑曲霉和所述 含有黃芪藥渣的發(fā)酵培養(yǎng)基獨(dú)立包裝。8. 權(quán)利要求4或5所述方法中的所述含有黃芪藥渣的發(fā)酵培養(yǎng)基。9. 黑曲霉在制備黃芪甲苷中的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述黑曲霉為黑曲霉ACCC 30583、黑曲霉 ACCC 30177或黑曲霉ACCC 30784。
【文檔編號(hào)】C12P33/20GK105861614SQ201610313391
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月12日
【發(fā)明人】顧金剛, 韓春陽(yáng), 陳華, 劉峰, 李世貴, 劉翠艷, 龔明波, 張瑞穎
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所