血清中肌酐的紫外分光測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血清中肌酐紫外分光測定方法，屬于利用可見光，通過測試反應結果顏色的變化來測試材料的方法。本發(fā)明的技術方案是：將試劑分為兩部分，其中試劑Ⅱ中僅有肌酐亞氨基水解酶有效組分，試劑Ⅰ中含有谷氨酸脫氫酶、α?酮戊二酸、NADH有效成分；其測定方法為：血清先與試劑Ⅰ于37℃溫浴3～5分鐘，血清中內(nèi)源性NH3與試劑Ⅰ在谷氨酸脫氫酶作用下反應生成NAD+，加入試劑Ⅱ于37℃溫浴4～7分鐘，肌酐經(jīng)肌酐亞氨基水解酶水解后生成NH3，NH3與試劑Ⅰ在谷氨酸脫氫酶作用下反應生成NAD+，在340nm波長處反應速度與同樣處理過的標準品比較，第二步反應NADH變化即為血清中肌酐的含量。
【專利說明】
血清中肌野的紫外分光測定方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及一種測定血清中肌酢含量的方法，屬于一種包含酶的測定方法;或是 利用可見光，通過測試反應的結果產(chǎn)生顏色變化來測試材料的方法，特別是設及一種用生 化分析儀快捷、準確檢測血清中肌酢的紫外分光測定方法。
【背景技術】
[0002] 肌酢又稱甲基脈基乙酸內(nèi)酷胺，分子式為C邊70N3，是一種相對分子質量較小(分子 量113.12)，烙點255°C，具有水溶性(80.1 g/L，16°C)的極性有機含氮化合物，肌酢在肌肉中 從憐酸肌酸通過自發(fā)和不可逆轉化而形成。正常情況下，人體內(nèi)肌酢含量基本穩(wěn)定，一般維 持在3~14mg/L，腎臟機能受損時，肌酢的正常排泄受到阻礙，血清中肌酢含量增加，因此血 清肌酢含量是反映腎臟功能的重要指標。Jaffe在1886年發(fā)現(xiàn)肌酢和苦味酸在堿性環(huán)境中 反應時，可生成一種紅色物質，Green-wald第1個系統(tǒng)地研究了化ffe反應的化學過程，認為 Jaffe反應的紅色產(chǎn)物是肌酢與苦味酸之間生成1:1和1;2的絡合物。一些肌酢的同系物或 衍生物如脈基乙酸內(nèi)酷胺，5-甲基脈基乙酸內(nèi)酷胺W及乙酷乙酸、丙酬酸、膽紅素、乙內(nèi)酷 脈等物質均能和苦味酸發(fā)生反應，運些物質稱為"假肌酢"，可導致肌酢測定結果偏高，大量 的假肌酢存在于紅細胞中，因此，肌酢的測定不宜采用全血法測定，目前肌酢主要是利用肌 酢在肌酢氨基水解酶、肌酸脈基水解酶、肌氨酸氧化酶、過氧化物酶等酶及顯色劑和水、氧 的共同作用下生成釀亞胺(紅色），在505nm波長下測定其吸光度A，其A值的大小和樣品中肌 酢的含量成正比的原理而設計的。肌氨酸氧化酶法靈敏度高，線性范圍寬，試劑穩(wěn)定性好。 其主要干擾物為樣品中肌酸，為去除肌酸的干擾，可采用雙試劑在試劑中去除肌酸的干擾。 肌酢酶偶聯(lián)肌氨酸氧化酶法的指示系統(tǒng)是化inder反應，Trinder系統(tǒng)明顯受維生素 C的干 擾。毛細管電泳是近10年來才進入實際應用的一種儀器分析方法，分離效率高，分析速度 快，樣品用量少，自動化程度高。Seki等采用柱切換技術檢測血清中的肌酢，同位素稀釋質 譜法（ID/MS)通過向樣品溶液中加入一種同位素標記物作為內(nèi)標物，在溶質與標記物溶液 充分平衡W后，對樣品進行預處理，利用GC或LC-MS現(xiàn)憶標記物與溶質的峰強度比來測定肌 酢的濃度。
[0003] 本發(fā)明的技術方案是：血清中內(nèi)源性N出在谷氨酸脫氨酶催化下與a-酬戊二酸、 NADH反應生成NAD+后，加入試劑n肌酢亞氨基水解酶水解肌酢生成N-甲基乙內(nèi)酷脈和畑3， 生成的N也在谷氨酸脫氨酶催化下與a-酬戊二酸、NADH反應生成NAD% W第一步反應為空白， W第二步反應生成的MD+計算出肌酢的含量，如反應式（1)(2)(3),本發(fā)明方法不同于一步 法，一步法易受內(nèi)源性N也的干擾而使結果偏高，本發(fā)明采用兩步酶法克服了內(nèi)源性N也的干 擾，同時也克服了血清試劑本底顏色的干擾，目前，臨床實驗室常采用肌酢氧化酶法測定肌 酢，但此法所用工具酶多，雜酶干擾大，易受還原性物質干擾，因此，本發(fā)明克服了上述缺 點。
[0004] 反應過程為：
[0005] 第一步反應
[0006]
[0007]
[000引
[0009]
[0010] 解決的問題是：我們所用的僅W肌酢亞氨基水解酶為第二試劑的兩步酶測定方 法，由于第一步反應體系中有谷氨酸脫氨酶、a-酬戊二酸、NADH有效成分，血清中內(nèi)源性N出 與試劑I在谷氨酸脫氨酶作用下反應生成NAD%加入試劑n于37°C溫浴4~7分鐘，肌酢經(jīng)肌 酢亞氨基水解酶水解后生成N曲，N曲在谷氨酸脫氨酶作用下反應生成NAD%在34化m波長處 反應速度與同樣處理過的標準品比較，第二步反應NADH變化即為血清中肌酢的含量。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0011] 為了能簡單及準確地測定肌酢，本發(fā)明提供一種經(jīng)濟方便易行，準確性高、不受內(nèi) 源性N出影響的血清兩步酶測定方法。
[0012] 本發(fā)明采用的技術方案是:將試劑分為兩部分，其中試劑n中僅有肌酢亞氨基水 解酶有效組分，試劑I中含有谷氨酸脫氨酶、Q-酬戊二酸、NADH有效成分;其測定方法為:血 清先與試劑I于37°C溫浴3~5分鐘，血清中內(nèi)源性N出在谷氨酸脫氨酶作用下反應生成NA護， 加入試劑n于37°C溫浴4~7分鐘，肌酢經(jīng)肌酢亞氨基水解酶水解后生成NH3，N出在谷氨酸脫 氨酶作用下反應生成NA護，在340皿波長處反應速度與同樣處理過的標準品比較，第二步反 應NADH變化即為血清中肌酢的含量。
[OOU]肌酢濃度=FXAODcrMt
[0014] A ODcr/ A t是單位時間內(nèi)肌酢產(chǎn)生的速率，F(xiàn)是校正因數(shù)。
[0015] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比有如下優(yōu)點：
[0016] 1.本發(fā)明的方法檢測時不受內(nèi)源性N出影響。由于內(nèi)源性N出在加入試劑I就完成反 應，不會參與第二步反應，因此排除了內(nèi)源性N出的影響，使N出的生成肌酢成等比關系，檢測 數(shù)據(jù)能真實反映肌酢的狀況。
[0017] 2.本發(fā)明使用方法和范圍與原有兩步酶法相同，不增加實驗人員的負擔，不增加 試劑成本，本方法能用于血清和尿液肌酢檢測，如采用單一試劑肌酢的紫外分光測定方法 易受內(nèi)源性N出的干擾而使測定結果偏低。
[0018] 如上所述，本發(fā)明是一種經(jīng)濟方便易行，準確性更高的肌酢檢測方法。今后可廣泛 應用于臨床檢測。
【附圖說明】
[0019] 圖1是本發(fā)明測定健康人體血清中肌酢紫外分光測定方法的反應曲線圖。
【具體實施方式】：
[0020] 下面通過實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0021] 實施例1
[0022] 試劑的組成：
[0023] a.試劑 I:
[0024] Tris-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L，谷氨酸脫氨酶 2500U/L，a-酬戊二酸 100mmol/L，NADH 1.3mmol/L，P;roclin-300 20化1。
[0025] b.試劑 n:
[00%] 試劑n內(nèi)含化is-鹽酸緩沖液lOOmmol/L，肌酢亞氨基水解酶1000U/L，Proclin- 300 20化1。
[0027] C.標準液:265皿ol/L肌酢標準血清(市售）。
[002引其中Proclin-300為液體高效防腐劑。
[0029] 實施例2
[0030] 測定程序
[0031 ]雙試劑法:在日本OLYMPUS AU2700全自動化生化分析儀上，儀器自動將化1樣品加 入到22扣1試劑I中混勻，37 °C解育3分鐘，加入75iil試劑n混勻，37 °C解育5.1分鐘，全自動 分析儀在340nm波長處檢測，儀器自動計算出肌酢結果，反應參數(shù)見表1。
[0032]表1.本發(fā)明自動化生化分析儀測試條件 [00331
1234567891011 肌酢濃度=F X A ODcr/ A t 2 其中A ODcr/At是單位時間內(nèi)肌酢產(chǎn)生的速率，F(xiàn)是校正因數(shù)，測定方法為帶標準 的速率法，其實時反應曲線如附圖1所示。 3 下面通過采用本方法與肌酢氧化酶法測定肌酢比較來說明本研究方法的準確性。 4 1.檢測對象：待檢者102例，其中男58人，平均年齡43.5歲；女性44人，平均年齡 42.5歲，至腹靜脈義血2 mL。 5 2.采用方法及試劑 6 2.1 試劑： 7 (1)本發(fā)明方法采用實施例1中的試劑I、試劑n。 8 (2)肌酢氧化酶方法采用北京利德曼生化股份有限公司生產(chǎn)的肌酢試劑盒。 9 2.2.儀器：（1)日本Olympus AU2700型全自動生化分析儀。 10 2.3.方法 11 2.3.1肌酢氧化酶法樣品：試劑=1:60:20，37°C，樣品與試劑I溫浴3分鐘，加入試 劑n后，反應5.1分鐘，600nm波長處終點法測定。
[0045] 2.3.2本發(fā)明方法樣品：試劑I:試劑n=l:75: 25。37 °C，樣品與試劑I溫浴3分鐘， 加入試劑n后，反應5.1分鐘，340nm波長處速率法測定。
[0046] 2.3.3本發(fā)明方法與肌酢氧化酶法測定結果統(tǒng)計學比較:兩種方法測定結果比較 無顯著性差異(t = 3.3689，P〉0.05，n = 102);
[0047] Y才趙肋法=0.9869柵WWW貓-0.1128，r2 = 0.9866，兩種方法呈良好相關性，本發(fā)明 方法技術指標為:線性范圍達1.1~4500皿01/L，平均回收率為99.2 %，高、中、低批內(nèi)變異 系數(shù)和批間變異系數(shù)分別為0.46%~2.30%和097%~2.45%，健康人群的血清肌酢參考 范圍為55~10祉mol/L(男性）、46~89WH01(女性）。本專利具有選擇性好、靈敏度高、測定簡 便、抗干擾能力強等優(yōu)點，可用于血、尿肌酢檢測，可滿足不同層次的臨床實驗室需要，適合 臨床推廣應用。
[0048] 經(jīng)過W上比較可看出，本發(fā)明采用肌酢亞氨基水解酶偶聯(lián)谷氨酸脫氨酶法雖與現(xiàn) 有試劑配方組成基本相同，但因谷氨酸脫氨酶、Q-酬戊二酸、NADH有效成分同在試劑I中，試 劑II僅有肌酢亞氨基水解酶，所W血清加入試劑后發(fā)生的反應與單一試劑方法的反應所包 含的待測物N出的含量不同，測定結果不同，實際效果也完全不一樣。因此，本發(fā)明通過改變 試劑I、n的組分能夠保證血清中肌酢檢測的準確性，本方法所用工具酶少，干擾少，結果更 加可靠。
【主權項】
1. 一種血清中肌酐的紫外分光測定方法，其特征在于將試劑分為兩部分，其中試劑π 中僅有肌酐亞氨基水解酶有效組分，試劑I中含有谷氨酸脫氫酶、α-酮戊二酸、NADH有效成 分;其測定方法為:血清先與試劑I于37°C溫浴3~5分鐘，血清中內(nèi)源性ΝΗ 3與試劑I在谷氨 酸脫氫酶作用下反應生成NAD+，加入試劑Π 于37°C溫浴4~7分鐘，肌酐經(jīng)肌酐亞氨基水解 酶水解后生成NH3，NH3在谷氨酸脫氫酶作用下反應生成NAD+，在340nm波長處反應速度與同 樣處理過的標準品比較，第二步反應NADH變化即為血清中肌酐的含量。2. -種血清中肌酐的紫外分光測定方法，其特征在于試劑I內(nèi)含Tris-鹽酸緩沖液80~ 120mmol/L，谷氨酸脫氫酶2000~3000U/L，a-酮戊二酸80~120mmol/L，NADH 1 · 2~ 1.4mmol/L，Proclin-300150~250μ1;試劑Π 內(nèi)含Tris-鹽酸緩沖液80~120mmol/L，肌酐亞 氨基水解酶800 ~1200U/L，Proclin-300 150 ~250μ1。3. -種血清中肌酐的紫外分光測定方法，其特征在于試劑I及試劑Π 中防腐劑選自 Proclin-300〇4. 一種血清中肌酐的紫外分光測定方法，其特征在于試劑I和試劑Π 中Tris-鹽酸緩沖 液的pH值為7.8 ±8.2。5. -種血清中肌酐的紫外分光測定方法，其特征在于測定所用各物品的體積比為:樣 品：試劑I:試劑II = 1:70~80:20~30。
【文檔編號】C12Q1/32GK105861631SQ201610398750
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月6日
【發(fā)明人】李立和, 孫長青, 王輝, 劉冰, 楊朕
【申請人】天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院