一種南瓜片測定煙草疫霉致病力的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種南瓜片測定煙草疫霉致病力的方法，包括以下步驟：（1）煙草疫霉菌絲塊制備；（2）南瓜片制備；（3）接種；（4）致病力測定與評價。本發(fā)明方法簡便易行，病原菌致病性表現(xiàn)穩(wěn)定，重復性好，結果可靠，可準確地反映煙草疫霉的致病力及其致病強度；在實際操作中，可批量進行，具有占用空間小、節(jié)約勞動成本、縮短實驗周期的優(yōu)點。因此，本發(fā)明方法適合推廣應用。
【專利說明】
-種南瓜片測定煙草疫霉致病力的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于植物保護技術領域，具體設及一種南瓜片測定煙草疫霉致病力的方 法。
【背景技術】
[0002] 煙草疫霉(Phyto地thora nicotianae)是導致煙草黑腔病的一種致病性卵菌，對 煙草生產(chǎn)危害嚴重，是影響煙草產(chǎn)量和品質的主要病原菌之一。目前，關于煙草疫霉致病力 的測定主要存在如下=種方法:（1)創(chuàng)傷和非創(chuàng)傷煙苗莖基部貼接菌絲塊法測定致病力(王 革，鄭小波，陸家云等.云南省煙草黑腔病菌致病力分化的研究，南京農(nóng)業(yè)大學學報.1997， 20(4): 30-35.); (2)菌谷/游動抱子接種煙苗測定致病力(YC/T 41-1996煙草品種抗病性 鑒定、梁元存，劉延榮，王玉軍等.煙草黑腔病菌致病性分化和煙草品種的抗病性差異，植 物保護學報.2003, 30(2): 143-147.); (3)菌絲塊創(chuàng)傷貼接活體或離體葉片測定致病力 (馬國勝.煙草黑腔病菌生理生態(tài)及對甲霜靈抗性監(jiān)測與遺傳研究.安徽.安徽農(nóng)業(yè)大學. 2002)。由于菌絲塊接種葉片發(fā)病快，比較適合測定病菌的致病力，而不能區(qū)分病菌的致病 強度，不適合于同時測定病菌的致病力及其致病強度。另外兩種方法均利用盆栽的活體煙 苗測定，由于培育煙苗時間長、占用空間大，導致費工、費時、成本高，不利于大規(guī)模實驗，并 且煙苗在溫室中生長，溫濕度控制范圍相對較寬，環(huán)境因素造成發(fā)病輕重上的一些波動，實 驗穩(wěn)定性、重復性有待提高。因此，開發(fā)一種能縮短時間、節(jié)省空間的測定病菌致病力及其 致病強度的方法意義重大。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種南瓜片測定煙草疫霉致病力的方法。
[0004] 本發(fā)明的目的是運樣實現(xiàn)的，包括煙草疫霉菌絲塊制備、南瓜片制備、接種、致病 力測定與評價步驟，具體包括： A、 煙草疫霉菌絲塊制備:將煙草疫霉接種至OA培養(yǎng)基平板，于25~28 °C下黑暗培養(yǎng)7~10 天，將平板菌絲切成菌絲塊； B、 南瓜片制備:將南瓜進行清洗、表面消毒，削除外果皮，去除內果皮和皮飄、種子，取 中果皮切成片塊得到南瓜片，置于滅菌的培養(yǎng)床上； C、 接種:將A步驟獲得的菌絲塊菌絲面緊貼于南瓜片上； D、 致病力測定與評價:將接種后的南瓜片于濕度80~85%、溫度25~28°C條件下黑暗培 養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況，記錄菌落大小和發(fā)病面積，W病斑長度區(qū)分致病力及其致病強度。
[0005] 本發(fā)明方法簡便易行，病原菌致病性表現(xiàn)穩(wěn)定，重復性好，結果可靠，可準確地反 映煙草疫霉的致病力及其致病強度;在實際操作中，可批量進行，具有占用空間小、節(jié)約勞 動成本、縮短實驗周期的優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0006] 下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不W任何方式對本發(fā)明加 W限制， 基于本發(fā)明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0007] 本發(fā)明所述的南瓜片測定煙草疫霉致病力的方法，包括煙草疫霉菌絲塊制備、南 瓜片制備、接種、致病力測定與評價步驟，具體包括： A、 煙草疫霉菌絲塊制備:將煙草疫霉接種至OA培養(yǎng)基平板，于25~28 °C下黑暗培養(yǎng)7~10 天，將平板菌絲切成菌絲塊； B、 南瓜片制備:將南瓜進行清洗、表面消毒，削除外果皮，去除內果皮和皮飄、種子，取 中果皮切成片塊得到南瓜片，置于滅菌的培養(yǎng)床上； C、 接種:將A步驟獲得的菌絲塊菌絲面緊貼于南瓜片上； D、 致病力測定與評價:將接種后的南瓜片于濕度80~85%、溫度25~28°C條件下黑暗培 養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況，記錄菌落大小和發(fā)病面積，W病斑長度區(qū)分致病力及其致病強度。 [000引 A步驟中所述的菌絲塊的直徑或邊長為5~8mm。
[0009] B步驟中所述的清洗是用水清除南瓜表面的灰塵和附著物，驚干。
[0010] B步驟中所述的表面消毒是采用70%酒精進行擦拭消毒。
[0011] B步驟中所述的片塊的大小為3~5cm X 3~4cm X 3~5mm。
[0012] B步驟中所述的培養(yǎng)床為培養(yǎng)皿上墊上海綿和濾紙得到。
[0013] C步驟還包括加^ 1 Oml的滅菌水至培養(yǎng)床底部W滲透、濕潤培養(yǎng)床。
[0014] 本發(fā)明所述的南瓜片測定煙草疫霉致病力的方法，具體操作如下： A、 煙草疫霉菌絲塊制備:將煙草疫霉接種至OA培養(yǎng)基平板，于25~28 °C下黑暗培養(yǎng)7~10 天至菌絲長滿整個平板，將平板菌絲切成直徑或邊長5-8mm的菌絲塊； B、 南瓜片制備:將健康的老熟南瓜清洗表面灰塵和附著物后，在無菌條件進行表面消 毒，削除南瓜果實蠟質堅硬的外果皮、去內果皮和瓜飄及種子，取中果皮，切成約長度3-5cm X寬度3-4cmX厚度3-5 mm的片塊，置于滅菌的培養(yǎng)床(培養(yǎng)皿上墊海綿和濾紙)上； C、 接種;取A步驟獲得的煙草疫霉菌絲塊菌絲面緊貼于南瓜片的中屯、，加適量的滅菌水 至培養(yǎng)床底部，讓其滲透、濕潤培養(yǎng)床； D、 致病力測定與評價:接種后的南瓜片在相對濕度80~85%、溫度25~28°C下黑暗培養(yǎng)， 每天觀察發(fā)病情況，記錄第3天南瓜片上菌落大小和發(fā)病面積，W第3天病斑長度區(qū)分致 病力及其致病強度。
[0015] 下面W具體實施案例對本發(fā)明做進一步說明： 1、材料與方法 1.1煙草疫霉菌絲塊制備 將煙草疫霉接種至OA培養(yǎng)基平板，于25~28°C下黑暗培養(yǎng)7~10天至菌絲長滿整個平板， 用直徑為5 mm的打孔器分別從已培養(yǎng)好的菌落邊緣打取菌餅。
[0016] 1.2南瓜片制備 選擇健康的老熟南瓜，清洗表面灰塵和附著物后，置于超凈臺中，75 %酒精表面消毒。 用75 %酒精消毒的刀削除南瓜果實蠟質堅硬的外果皮、去內果皮和瓜飄及種子，取中果皮， 切成長度3 cmX寬度3 cmX厚度0.5 cm的方片塊，置于滅菌的培養(yǎng)床(培養(yǎng)皿上墊海綿和 濾紙)上，培養(yǎng)床底部加入適量的滅菌水。
[0017] 1.3 接種 將含有煙草黑腔病菌菌餅的菌絲面分別緊貼于南瓜片的中屯、接種，接種空白培養(yǎng)基餅 片作為對照，每菌株接種3片南瓜作為1個處理，重復3次，W接種同樣大小的空白培養(yǎng)基餅 片作為對照。
[001引1.4致病力測定與評價 接種后的南瓜片在相對濕度80~85%、溫度25~28°C下黑暗培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況，記 錄第3天南瓜片上菌落大小和發(fā)病面積，W第3天病斑長度區(qū)分致病力及其致病強度。實 驗數(shù)據(jù)WExcel進行常規(guī)計算，方差分析則采用DPS 7.05軟件分析。
[0019] 2、結果與分析 觀察發(fā)現(xiàn)，隨機取來自云南10個縣的煙草黑腔病菌菌株均能侵染南瓜引起發(fā)病。病斑 從菌餅處開始擴散，南瓜片出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，接種的南瓜片表面會逐漸形成一層白色的菌絲。 表1表明，病斑長度從19.88-29.31mm不等，根據(jù)病斑長度及LSD多重比較結果可將10個菌株 分為3類:第1類致病強度較強包含4個菌株(Pn26、化20、？1123、？1111);第2類病強度中等包含 5個菌株(？1125、化16、？118、？1113、化6);第3類致病強度弱包含1個菌株(？1115)。聚類分析結果 發(fā)現(xiàn)，云南煙草黑腔病菌對南瓜致病力的分化與菌株所處地理位置無明顯的相關性。
[0020] 表1不同地區(qū)煙草疫霉致病力的比較
注:表中"±"前面的數(shù)字表示病斑長度平均值，后面的數(shù)字代表標準差； 小寫字母表示p<0.05水平上的差異顯著性，大寫字母表示P<0.Ol水平上的差異顯著 性。
【主權項】
1. 一種南瓜片測定煙草疫霉致病力的方法，其特征在于包括煙草疫霉菌絲塊制備、南 瓜片制備、接種、致病力測定與評價步驟，具體包括： A、 煙草疫霉菌絲塊制備:將煙草疫霉接種至0A培養(yǎng)基平板，于25~28 °C下黑暗培養(yǎng)7~10 天，將平板菌絲切成菌絲塊； B、 南瓜片制備:將南瓜進行清洗、表面消毒，削除外果皮，去除內果皮和皮瓤、種子，取 中果皮切成片塊得到南瓜片，置于滅菌的培養(yǎng)床上； C、 接種:將A步驟獲得的菌絲塊菌絲面緊貼于南瓜片上； D、 致病力測定與評價：將接種后的南瓜片于濕度80~85%、溫度25~28°C條件下黑暗培 養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況，記錄菌落大小和發(fā)病面積，以病斑長度區(qū)分致病力及其致病強度。2. 根據(jù)權利要求1所述的南瓜片測定煙草疫霉致病力的方法，其特征在于A步驟中所述 的菌絲塊的直徑或邊長為5~8mm。3. 根據(jù)權利要求1所述的南瓜片測定煙草疫霉致病力的方法，其特征在于B步驟中所述 的清洗是用水清除南瓜表面的灰塵和附著物，晾干。4. 根據(jù)權利要求1所述的南瓜片測定煙草疫霉致病力的方法，其特征在于B步驟中所述 的表面消毒是采用70%酒精進行擦拭消毒。5. 根據(jù)權利要求1所述的南瓜片測定煙草疫霉致病力的方法，其特征在于B步驟中所述 的片塊的大小為3~5cm X 3~4cm X 3~5mm〇6. 根據(jù)權利要求1所述的南瓜片測定煙草疫霉致病力的方法，其特征在于B步驟中所述 的培養(yǎng)床為培養(yǎng)皿上墊上海綿和濾紙得到。7. 根據(jù)權利要求1所述的南瓜片測定煙草疫霉致病力的方法，其特征在于C步驟還包括 加1~10ml的滅菌水至培養(yǎng)床底部以滲透、濕潤培養(yǎng)床。
【文檔編號】C12Q1/04GK105861620SQ201610276471
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】方敦煌, 黃昌軍, 劉萍花, 肖炳光, 陳學軍, 楊大海
【申請人】云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院