一種野生斑鱖遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種野生斑鱖遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的檢測(cè)方法，包括以下步驟：a)、分別提取不同群體野生斑鱖的DNA；b)分別對(duì)步驟a)獲得的各野生斑鱖DNA進(jìn)行第一PCR擴(kuò)增和第二PCR擴(kuò)增，獲得各野生斑鱖DNA的第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物；c)分別對(duì)各野生斑鱖DNA的第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，將第一擴(kuò)增產(chǎn)物的Cyt b基因序列和第二擴(kuò)增產(chǎn)物的D?loop基因序列拼接組合，獲得各野生斑鱖目的序列；d)對(duì)所述不同群體各野生斑鱖目的序列進(jìn)行遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。本發(fā)明采用雙基因序列拼接的組合分析，彌補(bǔ)了單基因序列信息量不足的缺點(diǎn)，更客觀真實(shí)反映了物種遺傳多樣性的狀況。
【專利說(shuō)明】
-種野生斑鑛遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及野生斑賴檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種野生斑賴遺傳多樣性和群體遺 傳結(jié)構(gòu)的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 斑賴（Siniperca scherzeri)隸屬驢形目（Perciformes)鶴科（Serranidae)賴屬 (Siniperca)，是東亞特有的名貴淡水魚，廣泛分布于中國(guó)內(nèi)陸各個(gè)流域。其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道 鮮美，無(wú)肌間刺，素有"淡水石斑"之美譽(yù)，深受國(guó)內(nèi)及韓國(guó)、新加坡等地消費(fèi)者歡迎，是我國(guó) 重要淡水出口創(chuàng)匯魚類之一。近年來(lái)，由于水環(huán)境破壞和漁業(yè)資源的不健康使用，野生斑賴 群體已經(jīng)趨于衰退:本課題組在江蘇省蘇州、無(wú)錫、貴州省興義、冊(cè)亨、己結(jié)及云南陸良均沒(méi) 有發(fā)現(xiàn)大量野生斑賴群體。目前對(duì)于斑賴群體遺傳學(xué)和多樣性研究，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種野生斑賴遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的檢 測(cè)方法，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法能夠分析野生斑賴群體的遺傳變異，了解其遺傳多樣性和 種群親緣結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀，其結(jié)果可為將來(lái)斑賴資源的合理管理和保護(hù)利用提供參考。
[0004] 在過(guò)去的四十年中，線粒體DNA(mitochon化ial DNA，mtDNA)標(biāo)記技術(shù)，作為一種 新型的分子工具，已經(jīng)成熟地應(yīng)用在物種進(jìn)化和遺傳多樣性分析中。線粒體DNA在生態(tài)學(xué)和 地理學(xué)中應(yīng)用較多。線粒體DNA的特點(diǎn)在于嚴(yán)格的母系遺傳且容易將突變保留。線粒體DNA 是共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，非編碼區(qū)處于兩個(gè)tRNA中，mtDNA控制區(qū)k〇n化〇1 region)也稱為D環(huán) (displacement-loop region,D-Ioop)就處在運(yùn)個(gè)非編碼區(qū)中，是線粒體基因組中堿基替 換速率最快的區(qū)域，因此非常適合作為魚類遺傳變異的分子標(biāo)記。而切t Kcytoc虹ome b) 基因是線粒體基因組13個(gè)蛋白編碼基因中結(jié)構(gòu)和功能被研究得較為清楚的基因之一，進(jìn)化 速度適中，適合種群水平差異的檢測(cè)。本發(fā)明綜合兩種分子標(biāo)記技術(shù)，分析珠江水系野生斑 賴群體的遺傳變異，了解其遺傳多樣性和種群親緣結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀，其結(jié)果可為將來(lái)斑賴資源的 合理管理和保護(hù)利用提供參考。
[0005] 本發(fā)明提供了一種野生斑賴遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的檢測(cè)方法，包括W下步 驟：
[0006] a)、分別提取不同群體野生斑賴的DNA;
[0007] b)分別對(duì)步驟a)獲得的各野生斑賴DNA進(jìn)行第一 PCR擴(kuò)增和第二PCR擴(kuò)增，獲得各 野生斑賴DNA的第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物;所述第一 PCR擴(kuò)增使用的引物包括:山5'-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3 '，L: 5 '-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3 ' ；所述第二PCR擴(kuò)增使用的 引物包括;Pl: 5 '-ACCCCTGGCTCCCAAAGC-3 '，P2:5 '-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3 ' ；
[000引C)分別對(duì)各野生斑賴DNA的第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，將第一 擴(kuò)增產(chǎn)物的切t b基因序列和第二擴(kuò)增產(chǎn)物的D-Ioop基因序列拼接組合，獲得各野生斑賴 目的序列；
[0009] d)對(duì)所述不同群體各野生斑賴目的序列進(jìn)行遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。
[0010] 其中，所述第一PCR擴(kuò)增為Cyt b基因的PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)條件如下：
[0011] 2化濃度為SOngAiL的DNA模板、1化濃度為2.5U/化的Taq DNA聚合酶，2化濃度為 lOmol/化的引物1^化濃度為lOmol/化的引物H，25化PCR 2XReaction Mix，l祉L無(wú)離子 超純水；
[0012] 所述第一PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下：94°C預(yù)變性2min后，94°C45s，58°C45s，72°C Imin，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[001引優(yōu)選的，所述第二PCR擴(kuò)增為D-Ioop基因的PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)條件如下：
[0014] 2化濃度為SOngAiL的DNA模板、1化濃度為2.5U/化的Taq DNA聚合酶，2化濃度為 lOmol/化的引物Pl、2化濃度為lOmol/化的引物P2,2化L PCR 2XReaction Mix，l祉L無(wú)離 子超純水；
[0015] 所述第二PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下：
[0016] 94°C 預(yù)變性 3min 后，941：3〇3,5〇1：3〇3,72°(：1111111，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°(：延伸 10min〇
[0017] 優(yōu)選的，所述步驟C)具體包括：
[0018] 將第一擴(kuò)增產(chǎn)物的切t b基因序列和第二擴(kuò)增產(chǎn)物的D-Ioop基因序列經(jīng)Seq Man n拼接組合。
[0019] 首先采用雙向測(cè)序獲得各第一擴(kuò)增產(chǎn)物的Cyt b基因序列和第二擴(kuò)增產(chǎn)物的D-Ioop基因，經(jīng)Seq ManE (DNASTAR Inc)軟件拼接后進(jìn)行人工校對(duì)，然后將各個(gè)體的D-Ioop 和Cyt b基因序列一一對(duì)應(yīng)拼接組合。
[0020] 優(yōu)選的，所述步驟d)具體包括：
[0021] 檢測(cè)所述不同群體各野生斑賴目的序列的轉(zhuǎn)換、顛換比值，統(tǒng)計(jì)單倍型，并計(jì)算單 倍型多樣性、核巧酸多樣性、平均核巧酸差異數(shù)、群體間的分化指數(shù)、群體遺傳變異的分子 變異等級(jí)和群體核巧酸不配對(duì)分析。
[0022] 獲得各野生斑賴目的序列后，用軟件Clus化1_X對(duì)所獲得拼接序列進(jìn)行比對(duì)分析； 用軟件DAMBE檢測(cè)轉(zhuǎn)換、顛換比值，使用TN9分析檢驗(yàn)是否達(dá)飽和，統(tǒng)計(jì)單倍型并作圖；使用 軟件DNASP4.0計(jì)算單倍型多樣性巧aplotype diversity,Hd)、核巧酸多樣性(nucleotide 山乂6'31*7，^)，和平均核巧酸差異數(shù)化)=項(xiàng)群體遺傳多樣性指標(biāo)，群體間的分化指數(shù)巧-statistics，F(xiàn)st)，群體遺傳變異的分子變異等級(jí)分析（analysis of molecular variance，AM0VA) W及群體核巧酸不配對(duì)分析圖（Mismatch-distribution analysis);公 式Nm= [ (1/Fst)-I ]/2計(jì)算得到群體間的基因流;NETW0RK4610構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖； MEGA5.1軟件統(tǒng)計(jì)DNA序列的堿基組成、轉(zhuǎn)換/顛換和平均轉(zhuǎn)換/顛換率、單突變位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信 息位點(diǎn)；個(gè)體間、群體間和群體內(nèi)的遺傳變異率由Kimura雙參數(shù)模型化imuraS-parameter) 計(jì)算所得；用鄰接法(nei曲bor-joining,NJ)和最大似然法(maximum-1 ike-1 ihood，ML)構(gòu) 建聚類關(guān)系樹。
[0023] 本發(fā)明采用雙基因序列拼接的組合分析，彌補(bǔ)了單基因序列信息量不足的缺點(diǎn)， 更客觀真實(shí)反映了物種遺傳多樣性的狀況。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖I為CR+切t b基因序列的NJ(A)和ML(B)分子系統(tǒng)樹(數(shù)值表示1000次重復(fù)抽樣 的百分比），其中圖IA為CR+切t b基因序列的NJ分子系統(tǒng)樹，圖IB為CR+切t b基因序列的ML 分子系統(tǒng)樹。
[0025] 圖2為珠江水系3個(gè)斑賴群體的核巧酸不配對(duì)分析圖，其中，圖2A為珠江水系斑賴 群體核巧酸不配對(duì)分析圖，圖2B為都勻斑賴群體核巧酸不配對(duì)分析圖，圖2C為紅水河斑賴 群體核巧酸不配對(duì)分析圖，圖2D為貝嶺斑賴群體核巧酸不配對(duì)分析圖；
[0026] 圖3為mtDNA CR+切t b單倍型的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，其中，mv表示理論分析出但沒(méi)有實(shí) 際觀測(cè)到的單倍型;H表示單倍型，圓圈面積表示單倍型分布的頻率。
【具體實(shí)施方式】
[0027] W下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主 題的范圍僅限于W下的實(shí)施例，凡基于本
【發(fā)明內(nèi)容】
所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[002引1材料與方法
[0029] 1.1試驗(yàn)材料
[0030] 2013年6月至2013年8月，分別于珠江水系的廣西流域紅水河江段(編號(hào)服H群體）、 貴州流域都勻江段(編號(hào)DY)和東江貝嶺楓樹巧水庫(kù)(編號(hào)化)采集斑賴樣本，共114尾，均為 野生群體。野外現(xiàn)場(chǎng)取魚背部肌肉，經(jīng)95%乙醇脫水后，置于無(wú)水乙醇中帶回實(shí)驗(yàn)室，低溫 保存。
[0031] 1.2試驗(yàn)方法
[0032] 基因組DNA的提取方法采用《分子實(shí)驗(yàn)克隆指南》Sambrook J，Russell D W， Russell D !.Molecular cloning:a laboratory manual(3-volume set)[M]. Cold Spring Harbor,New York: :Cold spring harbor laboratory press,2001.的方法。PCR反 應(yīng)在Bio-Rad PCR儀上進(jìn)行。
[0033] Cyt b和D-Ioop引物由北京六合華大有限公司廣州分公司合成。
[0034] Cyt b 引物序列如下：H15915:5'-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3'，L:5'-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3 '。
[0035] D-Ioop 引物[8]如下：PI:日'-ACCCCTGGCTCCCAAAGC-3'，P2:5'-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3'。
[0036] 切t b反應(yīng)條件如下：DNA模板化L(約SOngAU)、Taq DNA聚合酶（2.SUAUHiiL，引 物L(fēng)和H(10化/mol)各化L，PCR 2XReaction Mix(含KCl、Tris-HCl、MgCl2、dNTPs和漠酪藍(lán)） 2扣L，無(wú)離子超純水1祉L。擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性2min后，941：453,581：453,72°(：1111111，共 進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0037] D-Ioop反應(yīng)條件如下：DNA模板化L(約50ngAU)，Taq DNA聚合酶（2.抓AU)化L，引 物Pl和P2(10化/mol)各化L，PCR 2XReaction Mix2化L，無(wú)離子超純水1祉L。擴(kuò)增條件為： 94°C 預(yù)變性 3min 后，941：3〇3,5〇1：3〇3,72°(：1111111，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°(：延伸1〇111111。每 次PCR反應(yīng)均設(shè)無(wú)菌水替代模板DNA的空白對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%TAE瓊脂糖凝膠電泳分離， Golden View染色，凝膠成像系統(tǒng)BIORAD化iversal化odn檢測(cè)、拍照。
[0038] 1.3測(cè)序與數(shù)據(jù)分析：
[0039] PCR產(chǎn)物純化和測(cè)定由華大基因有限公司完成，各樣品均采用雙向測(cè)序獲得斑賴 D-Ioop和切t b序列，經(jīng)Seq ManIUDNASTAR Inc)軟件拼接后進(jìn)行人工校對(duì)，然后將各個(gè)體 的D-Ioop和切t b基因序列--對(duì)應(yīng)拼接組合。用軟件Clustal_X對(duì)所獲得拼接序列進(jìn)行比 對(duì)分析；用軟件DAM邸檢測(cè)轉(zhuǎn)換、顛換比值，使用TN9分析檢驗(yàn)是否達(dá)飽和，統(tǒng)計(jì)單倍型并作 圖；使用軟件DNASP4.0計(jì)算單倍型多樣性Waplotype diversity，Hd)、核巧酸多樣性 (nucleotide diversity，!!），和平均核巧酸差異數(shù)化)S項(xiàng)群體遺傳多樣性指標(biāo)，群體間的 分化指數(shù)（F-StatiStiCS，F(xiàn)st)，群體遺傳變異的分子變異等級(jí)分析（analysis of molecular variance，AM0VA) W及群體核巧酸不配對(duì)分析圖（Mismatch-distribution analysis);公式Nm= [(l/Fst)-l]/2計(jì)算得到群體間的基因流;肥TWO服4610構(gòu)建單倍型網(wǎng) 絡(luò)關(guān)系圖;MEGA5.1軟件統(tǒng)計(jì)DNA序列的堿基組成、轉(zhuǎn)換/顛換和平均轉(zhuǎn)換/顛換率、單突變位 點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)；個(gè)體間、群體間和群體內(nèi)的遺傳變異率由Kimura雙參數(shù)模型化imura2-parameter)計(jì)算所得；用鄰接法（nei曲bor-joining,NJ)和最大似然法（maximum-1 ike-lihoocUML)構(gòu)建聚類關(guān)系樹。
[0040] 2結(jié)果與分析
[0041 ] 2.1Cyt b+D-loop組合序列信息
[0042] 用MEGA5.1軟件將各個(gè)體904bp的D-Ioop和1103bp的切t b基因序列--對(duì)應(yīng)拼 接，得到總長(zhǎng)2007bp的拼接組合序列。由MEGA5.1對(duì)2007bp的組合序列進(jìn)行分析:所有群體 的基因組成中，4、1\(：、6的含量分別為：28.4%、28.9%、27.0%、15.7%，其中，4巧的含量 (56.3%)較高于C+G的含量(42.7%);在114尾樣本中共檢測(cè)到78個(gè)單倍型，748個(gè)突變位 點(diǎn)，550個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，222個(gè)單突變位點(diǎn)；其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)出現(xiàn)55個(gè)，顛換位點(diǎn)26個(gè)，缺失/ 插入44個(gè)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)得到轉(zhuǎn)換/頻率R為2.11，轉(zhuǎn)換數(shù)高于顛換數(shù)，詳見表1。
[0043] 表1 3個(gè)不同水域的班賴線粒體基因的組成和多樣性
[0044]
[0045] 由軟件DAMBE計(jì)算得到:在114個(gè)個(gè)體中檢測(cè)出78個(gè)單倍型，由轉(zhuǎn)換、顛換對(duì)遺傳距 離圖可知:轉(zhuǎn)換、顛換數(shù)為縱軸，WTN93模型（Tamura&Nei，1993)校正的距離為橫軸做散點(diǎn) 圖。序列間的轉(zhuǎn)換、顛換數(shù)分歧增大并且呈線性分布，說(shuō)明了序列間替換沒(méi)有達(dá)到飽和，可 W用于后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析。
[0046] 2.2Cyt b+D-loop組合遺傳變異分析
[0047] 3個(gè)不同水域的斑賴群體組合序列各個(gè)體內(nèi)的轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)W及遺傳變異率由軟 件MEGA5計(jì)算得到。3個(gè)不同水域群體的平均轉(zhuǎn)換數(shù)為54,平均顛換數(shù)25,3個(gè)群體斑賴(BL、 DY、HSH)群體間的遺傳距離值為0.035~0.089，群體內(nèi)的遺傳距離分別是0.003、0.064和0， 總平均遺傳距離為0.048(不含外群），詳見表2。
[004引表2 3個(gè)不同水域斑腑D-looD+Cvt b組合序列描體內(nèi)、群體間遺傳距離
[0049]
[0050] 利用DNASP4.0計(jì)算得到3個(gè)不同地理水域群體的斑賴線粒體基因 D-Ioop+切t b的 遺傳多樣性參數(shù)，得到3個(gè)不同地理群體組合序列的單倍型多樣性化)、核巧酸多樣性(K)和 平均核巧酸差異數(shù)化），詳見表3。
[0051] 表3 3個(gè)斑賴群體相關(guān)遺傳多樣性參數(shù)
[0化2]
[0053] 3個(gè)群體間的Fst及Nm值分別見表4,都勻群體和紅水河群體之間的Fst及Nm分別為 0.07016和6.62656，差異顯著。而有著較遠(yuǎn)地理距離的群體，如貝嶺群體和都勻群體的Fst達(dá) 到了0.65327，差異極顯著；貝嶺群體和紅水河群體的Fst達(dá)到了0.97485，差異極顯著。
[0054] 表4群體間的Fst(對(duì)角線下方)和Nm(對(duì)角線上方）
L(K)56」**表示差異極顯著，*表示差異顯著。下同。
[0057]對(duì)S個(gè)群體兩兩之間進(jìn)行群體間的分子變異等級(jí)分析(AMOVA)，詳見表5。
[005引表5群體間遺傳變異的分子變異等級(jí)分析(AMOVA)
[nnWI
[0060] 結(jié)果表明：3個(gè)群體總的遺傳分化指數(shù)Fst = 0.64110(P = 0.0000<0.05)，表明群體 間存在著顯著性遺傳變異，其中64.11%遺傳變異存在于群體間，群體內(nèi)的遺傳變異對(duì)總的 遺傳變異貢獻(xiàn)較小，僅35.89%。從表中可W看出，都勻群體和紅水河群體的遺傳分化指數(shù) Fst=O .06352(P = 0.04497±0.006K0.05)，雖然差異顯著，但是其93.65%的遺傳變異存在 于群體內(nèi)。而貝嶺群體與都勻群體和紅水河群體的Fst分別為0.65218(P = 0.000±0.000< 0.0 l)和0.96544(P = 0.000 ±0.000<0.0 l)，進(jìn)一步說(shuō)明了地理距離較遠(yuǎn)的貝嶺群體與其他 群體存在遺傳分化。
[00W] 2.3分子系統(tǒng)樹
[0062] 用MEGA5.1中的"腫'法和"ML"法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，W石斑魚化pinephelussp)D-loop+Cyt b組合序列為外群，用Bootstrap 1000給出各支的置f曰度。都勻群體和紅水河群 體混結(jié)果混雜在一起，而貝嶺群體全部聚為一支其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)見圖1，圖1為CR+切t b基因序 列的NJ(A)和ML(B)分子系統(tǒng)樹(數(shù)值表示1000次重復(fù)抽樣的百分比），其中，圖IA為CR+切t b基因序列的NJ分子系統(tǒng)樹，圖IB為CR+Cyt b基因序列的ML分子系統(tǒng)樹。
[0063] 單倍型多樣性和核巧酸多樣性是體現(xiàn)物種遺傳多樣性的重要指標(biāo)。物種遺傳多樣 性的作用表現(xiàn)在種群對(duì)環(huán)境的適應(yīng)和生存能力:群體遺傳多樣性的下降會(huì)對(duì)整個(gè)種群的生 殖、生長(zhǎng)、生理和進(jìn)化等各項(xiàng)性狀產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響。物種的遺傳多樣性越高，對(duì)環(huán)境的 適應(yīng)和生存能力就越強(qiáng)，能夠在環(huán)境發(fā)生變異的時(shí)候存活下來(lái)，得W保存物種并開拓新的 生存區(qū)域。研究表明生物種群的遺傳變異程度與種群的進(jìn)化速率成正比，因此，遺傳多樣性 的研究可W掲示該種群多個(gè)方面的生存生長(zhǎng)狀況，W便對(duì)該種群的現(xiàn)狀有直接的認(rèn)識(shí)。
[0064] 單倍型多樣性化d)是指在種群中隨機(jī)抽取到兩個(gè)不同單倍型的頻率，單倍型多樣 性高說(shuō)明該種群發(fā)生較多的變異。本發(fā)明中，=個(gè)群體的單倍型多樣性化d)數(shù)值范圍在 0.05~0.93之間，其中貝嶺群體最高Hd = 0.93333、都勻群體冊(cè)=0.78947、紅水河群體最低 冊(cè)= 0.05714。貝嶺群體和都勻群體屬于高單倍型，而紅水河群體屬于低單倍型。
[0065] 核巧酸多樣性(Pi)與單倍型多樣性數(shù)值共同組成遺傳多樣性指標(biāo)，并且對(duì)于反映 線粒體DNA多態(tài)性更加精確。本發(fā)明中，貝嶺群體Pi = 4.87692、都勻群體Pi = 96.83131、紅 水河群體Pi = O.〇5714"Grant研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單倍型多樣性和核巧酸多樣性的數(shù)值與 物種擴(kuò)張事件有重要聯(lián)系。貝嶺群體和都勻群體的Hd和Pi數(shù)值都高于臨界值化d = 0.5、Pi = 0.005)，屬于"高單倍型高核巧酸多樣性"類型。運(yùn)說(shuō)明運(yùn)兩條水系的斑賴群體可能是由 之前一個(gè)大而穩(wěn)定的群體經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的時(shí)間和地殼的運(yùn)動(dòng)，最后分散在運(yùn)兩條不同的流域 中。而紅水河群體屬于"低單倍型高核巧酸"類型，運(yùn)說(shuō)明該物種很有可能正在經(jīng)歷"瓶頸效 應(yīng)"，可能由于環(huán)境的劇烈變化或者遭遇危機(jī)，導(dǎo)致該群體的數(shù)量正在大幅減少，等位基因 發(fā)生劇變，可能溯臨滅絕的危機(jī)。同時(shí)根據(jù)Tajima中性檢驗(yàn)，Simonsen,化.；化urchill, GA.；Aquadro,CF.(Sep 1995)."Properties of statistical tests of neutrality for DNA polymo巧hism data.".Genetics 141(1):413-29.PMC 1206737.PMID 8536987.S個(gè) 群體的化jima'D和化值均小于0,說(shuō)明種群可能是負(fù)選擇的結(jié)果，即出現(xiàn)有害的變異，或受 到環(huán)境壓力，導(dǎo)致種群數(shù)量出現(xiàn)減少的趨勢(shì)。W上的分析均說(shuō)明了珠江水系斑賴群體正受 到選擇壓力，而且紅水河斑賴群體遺傳多樣性偏低。
[0066] 中性檢驗(yàn)結(jié)合核巧酸不配對(duì)分析圖見圖2,圖2為珠江水系3個(gè)斑賴群體的核巧酸 不配對(duì)分析圖，可W分析該群體是否在歷史上發(fā)生擴(kuò)張。其中，圖2A為珠江水系斑賴群體核 巧酸不配對(duì)分析圖，圖2B為都勻斑賴群體核巧酸不配對(duì)分析圖，圖2C為紅水河斑賴群體核 巧酸不配對(duì)分析圖，圖2D為貝嶺斑賴群體核巧酸不配對(duì)分析圖。結(jié)果表明，本發(fā)明中計(jì)算所 得貝嶺群體和紅水河群體化' S Fs的絕對(duì)值明顯大于化jima'D的絕對(duì)值，且均達(dá)到了極顯 著的水平(P<〇.01)，結(jié)合核巧酸不配對(duì)分析圖單峰現(xiàn)象，都說(shuō)明運(yùn)兩個(gè)群體均在近期發(fā)生 了種群擴(kuò)張事件。
[0067] 化eeland根據(jù)Fst的大小劃分了群體的分化程度，是代表種群遺傳分化的重要指 標(biāo)。Fst<0.05,說(shuō)明不同種群間不存在分化現(xiàn)象;若Fst<0.25,則種群間處于中等分化程度； 若Fst〉0.25,則種群已處于高度分化。本研究中，貝嶺群體與都勻群體和紅水河群體的Fst已 分別達(dá)到0.9和0.6，已處于高度分化狀態(tài)，運(yùn)是因?yàn)樗鼈兊牡乩砦恢幂^遠(yuǎn)。而紅水河群體與 都勻群體的Fst也達(dá)到0.07,處于中度分化。同時(shí)參考分子變異分析(AMOVA)結(jié)果，貝嶺群體 與都勻群體和紅水河群體間存在極顯著的遺傳差異，群體間遺傳貢獻(xiàn)率分別達(dá)到了 65.22%和96.54%;而都勻群體和紅水河群體群體間貢獻(xiàn)率較少，群體內(nèi)遺傳貢獻(xiàn)率達(dá)到 了 93.65%，說(shuō)明兩個(gè)群體主要的遺傳變異發(fā)生在各自群體內(nèi)部。通過(guò)將=個(gè)群體作為一個(gè) 大群體進(jìn)行分析，其Fst為0.6411(p<0.01)，運(yùn)說(shuō)明將S個(gè)水系的斑賴群體作為一個(gè)大群體 已產(chǎn)生了高度分化，且差異極顯著。
[0068] Nm基因流表明了種群間的基因交流或者隔離程度，從另一角度反映了種群分化情 況：當(dāng)Nm<l時(shí)，表明群體間基因可能受到出現(xiàn)交流限制；當(dāng)Nm〉l時(shí)，表明群體出現(xiàn)遺傳漂變， 但是不會(huì)造成遺傳分化。當(dāng)NmM時(shí)，表明種群間個(gè)體可W任意交配，且當(dāng)Nm巧時(shí)，群體間能 維持一個(gè)均一的基因庫(kù)。本發(fā)明中，貝嶺群體與都勻群體和紅水河群體的Nm值均小于1，說(shuō) 明貝嶺群體已與二者產(chǎn)生了一定的遺傳分化，但并不至亞種階段，運(yùn)與AMOVA分析結(jié)果一 致;都勻群體和紅水河群體的Nm大于5,說(shuō)明其個(gè)體之間可能發(fā)生過(guò)基因交流，未達(dá)到分化 的狀態(tài)，該結(jié)果與Fst檢驗(yàn)相符。
[0069] 種群間的遺傳距離是衡量群體間的親緣關(guān)系的重要指標(biāo)。遺傳距離越大，群體的 親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。Shaklee提出，魚類在屬間、種間和種群間S級(jí)水平上的平均遺傳距離分別 為0.9,0.3和0.05為標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明中，貝嶺群體與其他兩個(gè)群體的親緣關(guān)系較大，分別有 0.054和0.089均達(dá)到種間水平;都勻群體與紅水河群體遺傳距離僅0.035處于種群間的水 平(見表2)。其中，可W發(fā)現(xiàn)都勻群體自身的遺傳距離0.064已達(dá)到種間水平，說(shuō)明該群體內(nèi) 部的互相交流比較頻繁。
[0070] 在ML法構(gòu)建的斑賴群體組合序列系統(tǒng)發(fā)育分析中，發(fā)現(xiàn)貝嶺群體表現(xiàn)出特殊的遺 傳分化并單獨(dú)形成一條分支;都勻群體和紅水河群體分布在多個(gè)分支里，說(shuō)明其有一定的 親緣聯(lián)系。圖3所示的肥TWORK分析結(jié)果也顯示了單倍型的分布為兩條分支，有明顯的地理 分布特征，圖3為mtDNA CR+切t b單倍型的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，其中，mv表示理論分析出但沒(méi)有 實(shí)際觀測(cè)到的單倍型;H表示單倍型，圓圈面積表示單倍型分布的頻率。
[0071] 本發(fā)明采用雙基因序列拼接的組合分析，彌補(bǔ)了單基因序列信息量不足的缺點(diǎn)， 更客觀真實(shí)反映了物種遺傳多樣性的狀況。
[0072] 最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是：W上實(shí)施例僅用W說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制;盡 管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然 可W對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替 換;而運(yùn)些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精 神和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種野生斑鱖遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的檢測(cè)方法，包括以下步驟： a) 、分別提取不同群體野生斑鱖的DNA; b) 分別對(duì)步驟a)獲得的各野生斑鱖DNA進(jìn)行第一 PCR擴(kuò)增和第二PCR擴(kuò)增，獲得各野生 斑鱖DNA的第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物；所述第一 PCR擴(kuò)增使用的引物包括：!1:5'-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3 '，L: 5 '-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3 ' ；所述第二PCR擴(kuò)增使用的 引物包括;PI: 5 '-ACCCCTGGCTCCCAAAGC-3 '，P2:5 '-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3 ' ； c) 分別對(duì)各野生斑鱖DNA的第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，將第一擴(kuò)增 產(chǎn)物的Cyt b基因序列和第二擴(kuò)增產(chǎn)物的D-loop基因序列拼接組合，獲得各野生斑鱖目的 序列； d) 對(duì)所述不同群體各野生斑鱖目的序列進(jìn)行遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第一 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下： 2μ!4^度為50ng/yL的DNA模板、lyL濃度為2.5U/yL的Taq DNA聚合酶，2以]^濃度為lOmol/ yL的引物L(fēng)、2yU^度為lOmol/yL的引物H，25yL PCR 2XReaction Mix，18yL無(wú)離子超純水； 所述第一PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下：94°C預(yù)變性2min后，94°C45s，58°C45s，72°Clmin， 共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第二PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下： 2μ!4^度為50ng/yL的DNA模板、lyL濃度為2.5U/yL的Taq DNA聚合酶，2以]^濃度為lOmol/ yL的引物Pl、2yU^度為lOmol/yL的引物P2,25yL PCR 2XReaction Mix，18yL無(wú)離子超純 水； 所述第二PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下： 94°C預(yù)變性3min后，941€3〇8,5〇1€3〇8,72°(：1111丨11，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°(：延伸 10min〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟c)具體包括： 將第一擴(kuò)增產(chǎn)物的Cyt b基因序列和第二擴(kuò)增產(chǎn)物的D-loop基因序列經(jīng)Seq Mann拼 接組合。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟d)具體包括： 檢測(cè)所述不同群體各野生斑鱖目的序列的轉(zhuǎn)換、顛換比值，統(tǒng)計(jì)單倍型，并計(jì)算單倍型 多樣性、核苷酸多樣性、平均核苷酸差異數(shù)、群體間的分化指數(shù)、群體遺傳變異的分子變異 等級(jí)和群體核苷酸不配對(duì)分析。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105861683SQ201610294121
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月4日
【發(fā)明人】劉麗
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)