Pcsk9在食管鱗癌診治中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了PCSK9在食管鱗癌診治中的用途。食管鱗癌是常見的消化道惡性腫瘤，實驗證明，PCSK9基因在食管鱗癌組織中表達上調(diào)，PCSK9基因的過表達能促進食管鱗癌細胞的生長，抑制PCSK9基因的過表達可以抑制食管鱗癌細胞的過度增殖。本發(fā)明提供了一種食管鱗癌的診斷方法，同時提供了一種治療食管鱗癌的潛在藥物靶點。
【專利說明】
PCSK9在食管鱗癌診治中的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，設(shè)及PCSK9在食管鱗癌診治中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其具有發(fā)病率高、預后差的特點，全世界 每年新增的食管癌患者超過30萬，每年死于食管癌的患者約20萬人。中國是食管癌發(fā)病率 和死亡率均較高的國家，食管癌在中國的惡性腫瘤死亡率高居前五位，而在美國，食管癌在 惡性腫瘤中的死亡率僅1-2%，排名十位W后。食管癌根據(jù)臨床病理類型分為食管鱗癌和食 管腺癌，而在中國，約有90% W上的患者是食管鱗癌，而且食管癌的發(fā)病也具有非常明顯的 地區(qū)性，高發(fā)區(qū)和低發(fā)區(qū)之間的發(fā)病率可W相差60倍之多，河南省林縣及太行山脈地區(qū)就 屬于典型的食管癌高發(fā)區(qū)。
[0003] 食管鱗癌的治療目前主要W手術(shù)治療為主，再輔W放、化療、生物治療等輔助治 療。盡管在隨著科學技術(shù)的進步，食管鱗癌在診斷和治療技術(shù)水平上都得到了提高，食管鱗 癌的綜合治療模式也已經(jīng)形成，但是治療的效果并不十分令人滿意，食管鱗癌術(shù)后五年的 生存率僅為20~30%。而且由于食管解剖結(jié)構(gòu)的獨特性，在粘膜固有層和粘膜肌層存在著 豐富的淋己管道，運是其他消化道所沒有的，因此，即使是T分期較早的食管癌也會發(fā)生淋 己結(jié)的轉(zhuǎn)移。而且有資料提出，對于已完全切除的食管癌，仍然約有27%的患者在手術(shù)后的 2~3年內(nèi)出現(xiàn)淋己結(jié)轉(zhuǎn)移性復發(fā)。
[0004] 食管鱗癌已經(jīng)成為目前世界上嚴重威脅人類生命健康的疾病之一。與其他的惡性 腫瘤一樣，食管鱗癌的演進是一個復雜的病理過程，它不僅包括了正常細胞的惡變，還包括 了腫瘤細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。但是，到目前為止，食管鱗癌的發(fā)病機制尚不十分清楚，而 對于食管鱗癌的治療目前并沒有較為有效的方法。因此，探討食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤 和轉(zhuǎn)移的確切機制，對于更有效的預防和治療食管鱗癌都具有非常重要的意義。
[0005] PCSK9也稱作神經(jīng)細胞調(diào)亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換酶1，是一種蛋白酶K樣亞麻酶。人PCSK9是一 種分泌蛋白，主要在腎、肝和腸中表達。其具有=個結(jié)構(gòu)域:抑制性前結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域W 及長度為210個殘基的富含半脫氨酸殘基的C末端結(jié)構(gòu)域。PCSK9作為酶原被合成，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 中經(jīng)歷在結(jié)構(gòu)域與催化結(jié)構(gòu)域之間的自身催化裂解。PCSK9與血漿中低密度脂蛋白膽固醇 的水平有關(guān)，其在肝細胞和神經(jīng)元細胞的分化中起作用，在胚胎肝中高表達，且明顯參與膽 固醇的穩(wěn)態(tài)。但是目前并沒有報道表明PCSK9與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，通過研究PCSK9 與食管鱗癌的關(guān)系，W期尋找食管鱗癌有效的分子標記物，對于食管鱗癌的研究具有重要 的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供PCSK9基因在食管鱗癌診治中 的用途。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種基因及其表達產(chǎn)物在制備診斷食管鱗癌的產(chǎn)品中的應用，其 中，所述基因為PCSK9。
[0009] 進一步，所述產(chǎn)品包括通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或忍片檢測 PCSK9基因及其表達產(chǎn)物的表達水平W診斷食管鱗癌的產(chǎn)品。
[0010] 其中，所述用RT-PCR診斷食管鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增PCSK9基因的引 物;所述用實時定量PCR診斷食管鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增PCSK9基因的引物;所 述用免疫檢測診斷食管鱗癌的產(chǎn)品包括:與PCSK9蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交 診斷食管鱗癌的產(chǎn)品包括:與PCSK9基因的核酸序列雜交的探針;所述用忍片診斷食管鱗癌 的產(chǎn)品包括:蛋白忍片和基因忍片;其中，蛋白忍片包括與PCSK9蛋白特異性結(jié)合的抗體，基 因忍片包括與PCSK9基因的核酸序列雜交的探針。
[0011] 進一步，所述用實時定量PCR診斷管鱗癌的產(chǎn)品至少包括的一對特異擴增PCSK9基 因的引物序列如沈Q ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
[0012] 進一步，所述基因忍片可用于檢測包括PCSK9基因在內(nèi)的多個基因（例如，與食管 鱗癌相關(guān)的多個基因）的表達水平。所述蛋白質(zhì)忍片可用于檢測包括PCSK9蛋白在內(nèi)的多個 蛋白質(zhì)(例如與食管鱗癌相關(guān)的多個蛋白質(zhì)）的表達水平。通過同時檢測多個食管鱗癌的標 志物，可大大提高食管鱗癌診斷的準確率。
[0013] 本發(fā)明提供了一種診斷食管鱗癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測食管組織中 PCSK9基因的表達水平來診斷食管鱗癌。
[0014] 進一步，所述產(chǎn)品包括忍片、或試劑盒；其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白質(zhì)忍 片;所述基因忍片包括固相載體W及固定在固相載體的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針 包括用于檢測PCSK9基因轉(zhuǎn)錄水平的針對PCSK9基因的寡核巧酸探針;所述蛋白質(zhì)忍片包括 固相載體W及固定在固相載體的PCSK9蛋白的特異性抗體;所述試劑盒包括基因檢測試劑 盒和蛋白免疫檢測試劑盒;所述基因檢測試劑盒包括用于檢測PCSK9基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑； 所述蛋白免疫檢測試劑盒包括PCSK9蛋白的特異性抗體。
[0015] 本發(fā)明所述的基因檢測試劑盒可用于檢測包括PCSK9基因在內(nèi)的多個基因（例如， 與食管鱗癌相關(guān)的多個基因）的表達水平。所述蛋白免疫檢測試劑盒可用于檢測包括PCSK9 蛋白在內(nèi)的多個蛋白質(zhì)(例如與食管鱗癌相關(guān)的多個蛋白質(zhì)）的表達水平。將食管鱗癌的多 個標志物同時進行檢測，可大大提高食管鱗癌診斷的準確率。
[0016] 進一步，所述試劑包括針對PCSK9基因的引物和/或探針。
[0017] 本發(fā)明中針對PCSK9基因的寡核巧酸探針可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或 其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核巧酸序列特異性結(jié) 合，任何長度都可W。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針 的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對 雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不 超過30個堿基對，與目的核巧酸序列互補的長度W15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補 序列最好少于4個堿基對，W免影響雜交效率。
[0018] 本發(fā)明提供了 PCSK9基因及其表達產(chǎn)物在制備治療食管鱗癌的藥物組合物中的應 用。
[0019] 進一步，所述藥物組合物包括PCSK9基因和/或其表達產(chǎn)物的抑制劑。所述抑制劑 包括抑制PCSK9基因表達的物質(zhì)、抑制PCSK9基因表達產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制PCSK9 基因表達產(chǎn)物活性的物質(zhì)。
[0020] 進一步，所述抑制劑是針對PCSK9基因的SiRNA。優(yōu)選的，所述針對PCSK9基因的 SiRNA的序列如沈Q ID NO.9和沈Q ID NO. 10所示。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種治療食管鱗癌的藥物組合物，所述藥物包含PCSK9基因和/或 其表達產(chǎn)物抑制劑。所述抑制劑包括抑制PCSK9基因表達的物質(zhì)、抑制PCSK9基因表達產(chǎn)物 穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制PCSK9基因表達產(chǎn)物活性的物質(zhì)。
[0022] 進一步，上述的藥物組合物還包括藥學上可接受的載體，運類載體包括(但并不限 于）：稀釋劑、賦形劑如乳糖、氯化鋼、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充劑如淀粉、薦糖等;粘合 劑如單糖漿、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙締化咯燒酬;濕潤 劑如甘油；崩解劑如干淀粉、海藻酸鋼、海帶多糖粉末、瓊脂粉末、碳酸巧和碳酸氨鋼;吸收 促進劑季錠化合物、十二烷基硫酸鋼等;表面活性劑如聚氧化乙締山梨聚糖脂肪酸醋、十二 烷基硫酸鋼、硬脂酸單甘油醋、十六燒醇等;致濕劑如甘油、淀粉等;吸附載體如淀粉、乳糖、 斑脫±、硅膠、高嶺±和皂粘±等;潤滑劑如滑石粉、硬脂酸巧和儀、聚乙二醇、棚酸粉末等。
[0023] 本發(fā)明的藥物組合物可W使用不同的添加劑進行制備，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、抑菌 劑、等滲劑、馨合劑、pH控制劑及表面活性劑。
[0024] 緩沖劑可W包括棚酸、憐酸、乙酸、巧樣酸、谷氨酸及相應的鹽(它們的堿金屬或堿 性稀±金屬鹽，例如鋼鹽、鐘鹽、巧鹽及儀鹽）。等滲劑包括氯化鐘、氯化鋼、糖及甘油。馨合 劑包括乙二胺四乙酸鋼及巧樣酸。
[0025] 抑菌劑包括但不限于有效濃度(例如<l%w/v)的節(jié)醇、苯酪、間甲酪、氯下醇、對徑 基苯甲酸甲醋和/或?qū)交郊姿岜住?br>[00%]穩(wěn)定劑包括人類血清蛋白、1^-氨基酸、糖及纖維素衍生物。心氨基酸還可W包括甘 氨酸、半脫氨酸及谷氨酸中的任意一個。糖類包括單糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖 等;糖醇，例如甘露醇、纖維醇、木糖醇等;二糖，例如薦糖、麥芽糖、乳糖等;多聚糖，例如葡 聚糖、徑丙基淀粉、硫化軟骨素、透明質(zhì)酸等及它們的衍生物。纖維素衍生物包括甲基纖維 素、乙基纖維素、徑乙基纖維素、徑丙基纖維素、徑丙甲基纖維素及徑甲基纖維素鋼。
[0027] 表面活性劑包括離子或非離子表面活性劑，例如聚氧化乙締烷基醋、山梨聚糖單 酷基醋、脂肪酸甘油醋。
[0028] 本發(fā)明的藥物還可包括藥學上可接受的涂層材料包括(但不限于），快速分解涂層 材料、染色劑、腸溶性聚合物、增塑劑、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩 散劑。常見快速分解涂層材料包括0PADRY;腸溶性聚合物包括甲基內(nèi)締酸聚合物、憐徑丙甲 基纖維素苯二甲酸醋、徑丙甲基纖維素乙酸醋、徑丙甲基纖維素班巧酸醋、徑甲乙基纖維 素、乙酷憐苯二甲酸纖維素;增塑劑包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。
[0029] 本發(fā)明藥物的單位劑型可W使多種形式，代表性的劑型包括固體劑型如丸劑、粉 劑、片劑、干粉劑、顆粒、膠囊等;液態(tài)劑型如懸浮液、溶液、乳狀液、馳劑、糖漿等。本發(fā)明所 述藥物可W通過任何途徑給予受體，只要能達到目標組織，其可通過口服或非口服的多種 途徑，如口服給藥、肺內(nèi)給藥、直腸內(nèi)給藥、鼻內(nèi)給藥、皮下給藥、皮內(nèi)給藥、腹腔內(nèi)給藥、肌 內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥。
[0030] 本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、 粘粒、隧菌體、病毒等。
[0031] 本發(fā)明中所述PCSK9蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述PCSK9 蛋白的特異性抗體包括但不限于全長或完整的抗體、抗原結(jié)合片段、任何上述物質(zhì)的衍生 物、嵌合分子、任何上述物質(zhì)與另一種多膚的融合物、或為了選擇性結(jié)合PCSK9功能的目的 而滲入任何上述物質(zhì)的任何可選結(jié)構(gòu)或組成，"完整"抗體或"全長"抗體指包含兩條重鏈和 兩條輕鏈的蛋白。用于檢測蛋白質(zhì)水平的抗體的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā) 明可W使用任何方法來制備所述抗體，如所述的片段可W通過化學法從頭合成或利用重組 DNA技術(shù)合成。
[0032] 在本發(fā)明中，所述固相載體包括塑料制品、微顆粒、膜載體等。所述塑料制品可通 過非共價或物理吸附機制與抗體或蛋白抗原相結(jié)合，最常用的塑料制品為聚苯乙締制成的 小試管、小珠和微量反應板;所述微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒，其直徑多為 微米，由于帶有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的功能團，易與抗體(抗原）形成化學偶聯(lián)，結(jié)合容量大;所 述膜載體包括硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜及尼龍膜等微孔濾膜。
[0033] 在本發(fā)明中，所述RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指在進化過程中高度保守 的、由雙鏈RNA(doub 1 e-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。使 用RNAi技術(shù)可W特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和 傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。W細胞為基礎(chǔ)的RNAi篩選在功能基因?qū)W研究方面 具有許多優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在大多數(shù)細胞類型都能使用RNAi方法，并且相對較容易下調(diào)或沉 默任何目的基因的表達。
[0034] 在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細胞"包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物 細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如C冊細胞、COS細胞等。
[0035] 在本發(fā)明的上下文中，叩CSK9基因"包括人PCSK9基因 W及人PCSK9基因的任何功 能等同物的多核巧酸。PCSK9基因包括與目前國際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫GeneBank中PCSK9基 因（NCJ)OOOOI . 11 )DNA序列具有70% W上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0036] 優(yōu)選地，PCSK9基因的編碼序列包括W下任一種DNA分子：
[0037] (1)序列表中沈Q ID NO. 1所示的DNA序列；
[0038] (2)在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0039] (3)與（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、優(yōu)選地，90% W上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0040] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述PCSK9基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[0041 ]在本發(fā)明的上下文中，PCSK9基因表達產(chǎn)物包括人PCSK9蛋白W及人PCSK9蛋白的 部分膚。所述PCSK9蛋白的部分膚含有與食管鱗癌相關(guān)的功能域。
[0042] "PCSK9蛋白"包括PCSK9蛋白W及PCSK9蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物 包括PCSK9蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物或其突變體。突變體包 括等位變異體、天然突變體、誘導突變體、其氨基酸序列通過缺失、替代、增加和/或插入發(fā) 生變異的突變體、在高或低的嚴緊條件下能與人PCSK9的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。
[0043] 優(yōu)選地，PCSK9蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：
[0044] (I)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0045] (2)將SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個數(shù)通常為1-50個，較佳地1-30 個，更佳地1-20個，最佳地1-10個。
[0046] (3)與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又稱為序列同一性）， 優(yōu)選地，與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少約90 %至95 %的同源性，常為96 %、97 %、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多膚。
[0047] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述PCSK9蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)。
[0048] 通常，一個蛋白質(zhì)中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技 術(shù)人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€別添加、缺失、插 入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基 酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0049] 氨基酸序列的修飾可W源自自發(fā)突變或遺傳后修飾，也可W人工誘導天然基因產(chǎn) 生。通過添加一個或多個氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是PCSK9蛋白的融合蛋白。對于與 PCSK9蛋白融合的膚或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留PCSK9蛋白的生物學活 性即可。
[0050] 本發(fā)明的PCSK9蛋白也包括對SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要 經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留PCSK9蛋白的生物學活性即可。在此類修飾蛋白質(zhì)中突變 的氨基酸數(shù)目通常是10個或者更少，例如6個或者更少，例如3個或者更少。
[0051] 在本發(fā)明的上下文中，"治療食管鱗癌"根據(jù)疾病的狀態(tài)變化來分，可W包括疾病 的緩解、疾病的完全治愈;根據(jù)藥物發(fā)揮的作用不同，可W包括抑制細胞生長、促進細胞調(diào) 亡。
[0052] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0053] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子標志物一PCSK9,通過檢測受 試者食管組織中PCSK9的表達，可W判斷受試者是否患有食管鱗癌，同時本發(fā)明提供了治療 食管鱗癌的分子祀點，通過祀向于分子標志物來治療疾病具有敏感性和特異性，同時本發(fā) 明對食管鱗癌的病理研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0054] 圖1顯示利用QPCR檢測PCSK9基因在食管鱗癌組織中的表達情況；
[0化5] 圖2顯示利用QPCR檢測SiRNA對PCSK9基因表達的影響；
[0056] 圖3顯示軟瓊脂克隆形成實驗檢測SiRNA對細胞增殖的影響；
[0057] 圖4顯示MTT法檢測PCSK9基因?qū)θ耸彻荀[癌胞增殖的影響。
[005引具體的實施方式
[0059]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。W下實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York = Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0060] 實施例1篩選與食管鱗癌相關(guān)的基因標志物
[0061] 1、樣品收集
[0062] 各收集6例食管鱗癌癌旁組織和食管鱗癌組織樣本。上述所有標本的取得均通過 組織倫理委員會的同意。
[0063] 2、RNA樣品的制備(利用E.Z.N.A.貨miRNAkit進行操作）
[0064] 上述獲得的組織剪碎后投入液氮中并研磨至粉末狀，按照試劑盒中的說明書提取 分離RNA。具體如下：
[00化]1)RNA的分離：
[0066] A.組織勻漿或細胞中加入RNA-S〇lv@Reagent II Iml;
[0067] B.室溫放置3min，加入0.2ml氯仿后劇烈搖動15s;
[006引 C.置于冰上防止IOmin;
[0069] D.12000g，4°C 離屯、15min;
[0070] E.轉(zhuǎn)移80%的水相進入新的2ml EP管中，加入1/2量的無水乙醇，振搖；
[0071] F.將小于700]il的上述液體轉(zhuǎn)移至H舊ind忠 .RNA Mini column，振搖后1000 Og室溫 離屯、60s。
[0072] 2)RNA 純化：
[007；3] A.向 H舊ind聯(lián)RNA Mini column方口入SOOiil RWC Wash Buffer，1000 Og離屯、30s;
[0074] B.加入50化1 RWB Wash Buffer, 1000 Og離屯、30s，重復兩次后采取最大離屯、完全 干燥H舊ind及RNA Mini column;
[0075] C.向柱子加入15iil預熱至70°C的DEPC水，室溫放置2min后全速離屯、。
[0076] 3、高通量轉(zhuǎn)錄組測序
[0077] 1 )RNA-seq 讀段定位
[0078] 首先將低質(zhì)量的讀段去除得到清潔讀段，然后利用Top化t Vl. 3.1將清潔片段與 UCSC H. sapiens參考基因組化gl9)進行匹配，H. sapiens UCSC hgl9版的預先構(gòu)建的索引 從Top化t主頁下載，并作為參考基因組，利用Top化t與基因組匹配時，允許每個讀段(默認 到20)有多個匹配位點，最多2次錯配。Top化t根據(jù)外顯子區(qū)域和GT-AG剪切信號建立可能的 剪切位點庫，根據(jù)運些剪切位點庫將沒有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用 Top化t方法的系統(tǒng)默認參數(shù)。
[0079] 2)轉(zhuǎn)錄豐度評估
[0080] 匹配上的讀段文件通過Cufflinks vl.0.3處理，Qifflinks vl.0.3將RNA-seq片 段數(shù)目進行標準化計算轉(zhuǎn)錄本的相對豐度。FPKM值指的是每一百萬測序片段中匹配到特定 基因化b長的外顯子區(qū)域的片段數(shù)目。通過貝葉斯推理方法計算FPKM估計值的置信區(qū)間。 Cufflinks使用的參考的GTF注釋文件從Ensembl數(shù)據(jù)庫下載（Homo_ sapiens.GRQi37.63.gtf)。
[0081] 3)差異表達基因的檢測
[0082] 將下載的Ensembl GTF文件和通過TopHat匹配的原始文件傳輸?shù)紺uffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的轉(zhuǎn)錄本的表達豐度，檢測差異表 達。在化ffi壯巧俞出中只有q值<0.01，測試顯示成功的比較才被認為是差異表達。
[008；3] 4、結(jié)果
[0084] RNA-seq結(jié)果顯示，PCSK9基因在食管鱗癌組織中的表達量顯著高于食管癌癌旁組 織中的表達量。
[00化]實施例2QPCR測序驗證PCSK9基因的差異表達
[0086] 1、對PCS腳基因差異表達進行大樣本QPC閲金證。按照實施例1中的樣本收集方式選 擇正常食管組織和食管鱗癌組織各50例。
[0087] 2、RNA提取步驟如實施例1所述。
[0088] 3、逆轉(zhuǎn)錄：
[0089] 1)反應體系：
[0090]
[0091] 2)逆轉(zhuǎn)錄反應條件
[0092] 按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中逆轉(zhuǎn)錄反應條件進行。
[0093] 42°C~55°C60min，99°C2min，5°C5min。
[0094] 3)聚合酶鏈反應 [00巧]1)引物設(shè)計
[0096] 根據(jù)Genebank中PCSK9基因和GAPDH基因的編碼序列設(shè)計QPCR擴增引物，由博邁德 生物公司合成。具體引物序列如下：
[0097] PCSK9 基因：
[009引正向引物為5'-TTCCTGGTGAAGATGAGT-3'（SEQ ID N0.3);
[0099] 反向引物為5'-GTCCTCCTCGATGTAGTC-3'（沈Q ID N0.4)。
[0100] p-actin 基因：
[0101] 正向引物為5'-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3'（沈Q ID N0.5);
[0102] 反向引物為5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（沈Q ID N0.6)。
[0103] 2)按照表1配制PCR反應體系：
[0104] 表1PCR反應體系 「01051

[0106] 3)PCR反應條件：94°C5min，（94°C30s，58°C40s，72°C40s)X35個循環(huán)，72°C5min。 WSYBR Green作為巧光標記物，在Li曲t切cler巧光定量PCR儀上進行PCR反應，通過融解 曲線分析和電泳確定目的條帶，A A CT法進行相對定量。
[0107] 5、統(tǒng)計學方法
[0108] 實驗都是按照重復3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標準差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P<0.05時具 有統(tǒng)計學意義。
[0109] 6、結(jié)果
[0110] 結(jié)果如圖1所示，與食管癌癌旁組織相比，PCSK9基因在食管鱗癌組織中表達上調(diào)， 差異具有統(tǒng)計學意義(P<〇. 05)，同RNA-S巧結(jié)果一致。
[0111] 實施例3PCSK9基因的過表達
[0112] 1、細胞培養(yǎng)
[0113] 人食管鱗癌細胞株KYSE 150, W含10%胎牛血清和1%P/S的培養(yǎng)基DMM在37°C、 5 % C〇2、相對濕度為90 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25 %含EDTA的膜蛋白酶常 規(guī)消化傳代。
[0114] 2、SiRNA 設(shè)計
[0115] 針對PCSK9基因的SiRNA序列：
[0116] 陰性對照SiRNA序列(SiRNA-NC):
[0117] 正義鏈為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'（沈Q ID N0.7)，
[011 引反義鏈為5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3'（沈Q ID N0.8);
[0119] SiRNAl-PCSKQ：
[0120] 正義鏈為5'-UCAUUGAUGACAUCUUUGGCA-3'（沈Q ID N0.9)，
[01別]反義鏈為5'-CCAAAGAUGUCAUCAAUGAGG-3'（沈Q ID N0.10);
[0122] siRNA2-PCSK9：
[0123] 正義鏈為5'-UGUUUGAAUGGUGAAAUGCCC-3'（SEQ ID N0.11)，
[0124] 反義鏈為5'-GCAUUUCACCAUUCAAACAGG-3'（沈Q ID N0.12);
[0125] 將細胞按5 X IO5/孔接種到六孔細胞培養(yǎng)板中，在37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中細胞培養(yǎng) 2 4 h，在無雙抗、含10 % F B S的D M E M培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2 0 0 0 (購自于 Invi trogen公司）的說明書轉(zhuǎn)染，實驗分為對照組化YSE 150)陰性對照組(SiRNA-NC)和實 驗組（20nM) (SiRNAl-PCSK9、siRNA2-PCSK9、），其中陰性對照組SiRNA與PCSK9基因的序列無 同源性，濃度為20nM/孔，同時分別進行轉(zhuǎn)染。
[01%] 3、9口0?檢測口〔51(9基因的轉(zhuǎn)錄水平 [0127] 3.1細胞總RNA的提取
[012引采用TRIzol Reagentdnvi化Ogen Cat.No. 15596-018)總RNA提取試劑，按說明書 提供方法提取KYSE 150細胞的總RNA。
[01巧]1)取細胞，用濃度為0.0 lM的PBS沖洗3次。
[0130] 2)加入適量TRIzol試劑，室溫放置5min裂解細胞，吹打均勻。
[0131] 3) Wlml/管分裝至1.5ml EP管中。每管加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置2-：3min。
[0132] 4)4°C、12000rpm離屯、15min。
[0133] 5)將上層水相移至干凈EP管中，加入0.5ml異丙醇，輕輕混勻，室溫放置lOmin。
[0134] 6)4。(：、7500巧111離屯、1〇111111。
[OUS] 7)棄上清，75 %乙醇洗涂RNA沉淀，7500巧m離屯、5min。
[0136] 8)室溫干燥RNA沉淀，5-1 Omin后溶于適量DEPC水。
[0137] 9)質(zhì)量分數(shù)為1 .0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RM樣本的完整性，應用Bio-化Otometer對提取的RNA進行定量測定。
[013引 3.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實施例2。
[0139] 3.3QPCR擴增步驟同實施例2。
[0140] 4、統(tǒng)計學方法
[0141] 實驗都是按照重復3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標準差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，干擾PCSK9基因表達組與對照組之間的差異采 用t檢驗，認為當P<0.05時具有統(tǒng)計學意義。
[0142] 5、結(jié)果
[0143] 結(jié)果如圖 2顯示，相比KYSE 150、轉(zhuǎn)染空載siRNA-NC、siRNA2-PCSK9組，SiRNAl-PCSK9組能夠顯著降低PCSK9基因的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
[0144] 實施例4軟瓊脂克隆形成實驗
[0145] 1、用0.25%膜蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的細胞，輕輕吹打使之成為單細 胞懸液，離屯、收集細胞沉淀。
[0146] 2、用含20 %胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，適當稀釋后計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為5 Xl〇3 個/ml。
[0147] 3、制備兩個濃度分別為1.2%和0.7%的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40 °(：水浴中。
[0148] 4、1.2%的瓊脂糖和2 X DMEM培養(yǎng)基1:1混合，加入2 X抗生素和20%的小牛血清， 取3mr混合液注入直徑6cm平皿中放置5min冷卻凝固，作為底層瓊脂置于C〇2溫箱中備用。
[0149 ] 5、在無菌試管中1:1混合0.7 %的瓊脂糖和2 X DMEM培養(yǎng)基，再向管中加入0.2ml濃 度為5X IO3個/ml的穩(wěn)定感染細胞懸液，充分混勻，注入上述平皿中，逐漸形成雙瓊脂層，每 個實驗組重復4個樣本。
[0150] 6、待上層瓊脂凝固后，置入37 °C 5 % C〇2溫箱中培養(yǎng)，每3天加培養(yǎng)基1.5ml。
[0151] 7、培養(yǎng)14天后取出培養(yǎng)皿，用Iml濃度為0.005%的龍膽紫染色90min。把平皿放置 在倒置顯微鏡下觀察，每組細胞隨機選取10個低倍視野，鏡下技術(shù)形成的細胞克隆數(shù)。
[0152] 8、結(jié)果
[0153] 結(jié)果如圖3所示，與其他組相比，siRNAl-PCSK9組單細胞克隆集落形成數(shù)顯著降 低。
[0154] 實施例5PCSK9基因?qū)θ耸彻荀[癌胞增殖的影響
[0155] 采用MTT實驗檢測PCSK9基因?qū)κ彻荀[癌細胞增殖能力影響。
[0156] 1、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟同實施例3。
[0157] 2、步驟：
[015引（1)將對數(shù)增殖期的KYSE 150細胞接種于96孔板中，每孔約4X IO3個。
[0159] (2)設(shè) S個PCSK9siRNA 組，分別是 siRNAl-PCSK9 組、SiRNAl-NC和KY 沈 150 對照組， 每組細胞設(shè)=個復孔，其中S iRNAl-PCSK9組、S iRNAl-NC組進行瞬時轉(zhuǎn)染。
[0160] (3)分別在轉(zhuǎn)染后2地，4她，72h，在各組細胞中加入20山MTT溶液(5mg/L)，室溫下 靜置地后，停止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)基。
[0161] (4)往各孔中加入15化1 DMS0,輕輕晃動96孔板，充分溶解殘留的甲瑣結(jié)晶。
[0162] (5)在570nm處記錄吸光值，注意設(shè)置含培養(yǎng)基和MTT但不含細胞的調(diào)零孔。
[0163] 3、統(tǒng)計學方法
[0164] 實驗都是按照重復3次來完成的，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析，兩者之 間的差異采用t檢驗，認為當P<0.05時具有統(tǒng)計學意義。
[01化]4、結(jié)果
[0166] 圖4所示的結(jié)果顯示：siRNAl-PCSK9組的細胞生長速度明顯低于轉(zhuǎn)染SiRNA-NC組 的細胞生長速度，差異具有統(tǒng)計學意義(P<〇.05)。上述結(jié)果表明PCSK9表達有利于食管鱗癌 細胞的生長，通過抑制PCSK9基因的表達可W抑制食管鱗癌細胞的增殖。
[0167] 上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應當指出，對于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對本發(fā)明進行若干改進 和修飾，運些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種基因及其表達產(chǎn)物在制備診斷食管鱗癌的產(chǎn)品中的應用，其特征在于，所述基 因為PCSK9。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括通過RT-PCR、實時定量PCR、 免疫檢測、原位雜交或芯片檢測PCSK9基因及其表達產(chǎn)物的表達水平以診斷食管鱗癌的產(chǎn) 品。3. -種診斷食管鱗癌的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品能夠通過檢測食管組織中PCSK9基 因的表達水平來診斷食管鱗癌。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包括芯片、或試劑盒;其中，所述 芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片;所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核 苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測TMIGD2基因轉(zhuǎn)錄水平的針對PCSK9基因的寡核 苷酸探針;所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的PCSK9蛋白的特異性抗體； 所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒;所述基因檢測試劑盒包括用于檢 測PCSK9基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測試劑盒包括PCSK9蛋白的特異性抗體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑包括針對PCSK9基因的引物和/或 探針。 6. PCSK9基因及其表達產(chǎn)物在制備治療食管鱗癌的藥物組合物中的應用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于，所述藥物組合物包括PCSK9基因和/或其表 達產(chǎn)物的抑制劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述抑制劑包括抑制PCSK9基因表達的物 質(zhì)、抑制PCSK9基因表達產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制PCSK9基因表達產(chǎn)物活性的物質(zhì)。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于，所述抑制劑是針對PCSK9的siRNA。10. -種治療食管鱗癌的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括權(quán)利要求7-9 任一項所述的抑制劑。
【文檔編號】A61K31/7088GK105861679SQ201610282186
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】肖楓, 王欣月, 楊承剛
【申請人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司