Senp3基因及其表達(dá)產(chǎn)物作為食管癌的診治靶標(biāo)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了SENP3基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以作為食管癌診治的分子標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)組織中SENP3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的含量可以判斷受試者是否患有食管癌或者診斷受試者是否存在患有食管癌的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明通過(guò)研究體外培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞的增殖情況發(fā)現(xiàn)SENP3基因的表達(dá)抑制可以抑制食管癌細(xì)胞增殖，并且通過(guò)抑制SENP3蛋白的功能同樣可以抑制食管癌細(xì)胞的增殖，上述研究結(jié)果表明SENP3基因及其表達(dá)產(chǎn)物是治療食管癌的一個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】
SENP3基因及其表達(dá)產(chǎn)物作為食管癌的診治革田標(biāo)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地設(shè)及SENP3基因在食管癌的診斷、治療中的用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 食管癌化C)是目前世界上最為常見(jiàn)的十種惡性腫瘤之一(每年有超過(guò)300,000新 發(fā)病例），食管癌的預(yù)后較差，五年生存率不到10%。在消化系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率第二，僅次于 胃癌，占所有惡性腫瘤的2%，且發(fā)病率和死亡率居高不下，在各種惡性腫瘤引起的死亡患 者中占第六。在所有食管癌患者中，中老年人群所占比重較高，且具有易發(fā)性，總體來(lái)說(shuō)，年 齡低于30歲，發(fā)病率低，30歲W后發(fā)病率與年齡的增長(zhǎng)成正相關(guān)。中國(guó)是食管癌高發(fā)區(qū)，每 年新增250000名患者，但160000的食管癌患者死亡?，F(xiàn)有的治療食管癌的方式主要有手術(shù) 切除、放射治療、化學(xué)藥物治療等，W上治療措施的應(yīng)用不能有效提高患者的生存率和生活 質(zhì)量。因此對(duì)食管癌進(jìn)行研究，探明其可能發(fā)生機(jī)制及尋找診斷和治療新途徑等乃當(dāng)務(wù)之 急。目前廣大的醫(yī)學(xué)工作者致力于在基因水平進(jìn)行干預(yù)，為食管癌的治療帶來(lái)了新希望。有 文獻(xiàn)報(bào)道食管癌的發(fā)生發(fā)展是多基因共同作用的結(jié)果。目前在食管癌組織中已發(fā)現(xiàn)多種表 達(dá)異常的基因和蛋白，如DCR3基因、？〔魁、68?1、51413、〔￥化^01、￥66及食管癌相關(guān)基因4 等，目前運(yùn)方面研究較多，但運(yùn)些基因在臨床上的價(jià)值微乎其微，不能對(duì)食管癌患者治療效 果和預(yù)后做出有效的判斷提，因此新的的基因或標(biāo)志物急需研究證實(shí)和尋找，例如在肝癌 患者中外周血查AFP就具有較高的敏感性。當(dāng)患者自訴有進(jìn)行性吞咽困難癥狀時(shí)，一般已經(jīng) 是食管癌中晚期。因此早期診斷食管癌是目前提高患者生存率和治愈率的有效方法，特別 是與食管癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)記物被認(rèn)為是早期診斷的有效方法之一

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種可用于食管癌早期診斷的分子標(biāo)志物。相比現(xiàn)有的食 管癌的診斷方法，使用基因標(biāo)志物來(lái)診斷食管癌的具有及時(shí)性、特異性和靈敏性，從而使患 者在疾病早期就能知曉疾病風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0005] 本發(fā)明提供了檢測(cè)SENP3基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷食管癌的工具中的應(yīng)用。
[0006] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)SENP3基因表達(dá)的產(chǎn)品包括檢測(cè)SENP3基因 mRNA水平的產(chǎn)品、和/ 或檢測(cè)SENP3蛋白水平的產(chǎn)品。
[0007] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)SENP3基因表達(dá)的產(chǎn)品包括:通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢 、原位雜交或忍片檢測(cè)SENP3基因表達(dá)W診斷食管癌的產(chǎn)品。
[000引進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增SENP3基因的引 物;所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增SENP3基因的引物;所述 用免疫檢測(cè)診斷食管癌的產(chǎn)品包括:與SENP3蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診斷 食管癌的產(chǎn)品包括:與SENP3基因的核酸序列雜交的探針;所述用忍片診斷食管癌的產(chǎn)品包 括:蛋白忍片和基因忍片;其中，蛋白忍片包括與SENP3蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因忍片包 括與SENP3基因的核酸序列雜交的探針。
[0009] 所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增SENP3基因的引 物如沈Q ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
[0010] 所述檢測(cè)SENP3基因表達(dá)的產(chǎn)品可W是檢測(cè)SENP3基因表達(dá)的試劑、也可W是包含 所述試劑的試劑盒、忍片、試紙等，也可W是使用所述試劑的高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0011] 所述診斷食管癌的工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)；高 通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷食管癌的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的 基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜， 容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知SENP3基因的異常與食 管癌相關(guān)也屬于SENP3基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種診斷食管癌的工具，所述工具包括檢測(cè)SENP3基因表達(dá)的試 劑;所述試劑包括檢測(cè)SENP3基因 mRNA的引物和/或探針、檢測(cè)SENP3蛋白的抗體。
[0013] 所述工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0014] 其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白質(zhì)忍片;所述基因忍片包括固相載體W及固定 在固相載體的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括用于檢測(cè)SENP3基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì) SENP3基因的寡核巧酸探針;所述蛋白質(zhì)忍片包括固相載體W及固定在固相載體的SENP3蛋 白的特異性抗體;所述基因忍片可用于檢測(cè)包括SENP3基因在內(nèi)的多個(gè)基因（例如，與食管 癌相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)忍片可用于檢測(cè)包括SENP3蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋 白質(zhì)(例如與食管癌相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過(guò)將多個(gè)與食管癌的標(biāo)志物同時(shí)檢 ，可大大提高食管癌診斷的準(zhǔn)確率。
[001引其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒;所述基因檢測(cè)試 劑盒包括用于檢測(cè)SENP3基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括SENP3蛋白的 特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或忍片 方法檢測(cè)SENP3基因表達(dá)水平過(guò)程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對(duì)SENP3基因的 引物和/或探針。根據(jù)SENP3基因的核巧酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可W用于檢測(cè)SENP3基因表 達(dá)水平的引物和探針。
[0016] 所述試紙包括檢測(cè)SENP3基因表達(dá)的試劑。
[0017] 所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括檢測(cè)SENP3基因表達(dá)的試劑。
[0018] 與SENP3基因的核酸序列雜交的探針可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它 衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒(méi)有限制，只要完成特異性雜交、與目的核巧酸序列特異性結(jié)合， 任何長(zhǎng)度都可W。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述探針的 長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜 交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超 過(guò)30個(gè)堿基對(duì)，與目的核巧酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度W15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)序 列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，W免影響雜交效率。
[0019] 進(jìn)一步，所述SENP3蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述SENP3蛋 白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，，嵌合抗體、scFv、 化6、尸(曰6'）2、尸乂等。只要所述片段能夠保留與56肥3蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平 的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可W使用任何方法來(lái)制備所述抗體。
[0020] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)SENP3基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和 SEQ ID NO.4所示的引物對(duì)。
[0021] 本發(fā)明還提供了 SENP3基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑在制備治療食管癌的藥物 中的應(yīng)用。所述抑制劑包括抑制SENP3基因表達(dá)的試劑、和/或抑制SENP3基因表達(dá)產(chǎn)物的試 劑。
[0022] 進(jìn)一步，所述抑制SENP3基因表達(dá)的試劑包括抑制基因轉(zhuǎn)錄的試劑、抑制基因翻譯 的試劑;所述抑制SENP3基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括抑制SENP3基因 mRNA的試劑、抑制SENP3蛋 白的試劑。所述抑制SENP3基因 mRNA的試劑包括抑制mRNA穩(wěn)定性的試劑、抑制mRNA翻譯活性 的試劑。所述抑制SENP3蛋白的試劑包括抑制SENP3蛋白穩(wěn)定性的試劑、抑制SENP3蛋白活性 的試劑、抑制SENP3蛋白功能的試劑。
[0023] 進(jìn)一步，抑制SENP3基因 mRNA的試劑包括針對(duì)SENP3基因 mRNA的雙鏈核糖核酸;抑 審傾NP3蛋白功能的試劑包括SENP3抗原蛋白的腫瘤疫苗、抑制SENP3蛋白功能的抗體。所述 抗體可W是多克隆抗體，或是單克隆抗體。
[0024] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述針對(duì)SENP3基因 mRNA的雙鏈核糖核酸是siRNA。 為了確保SENP3基因能夠被高效剔除或沉默，根據(jù)SENP3基因的mRNA序列設(shè)計(jì)了 SiRNA特異 性片段。SiRNA的設(shè)計(jì)根據(jù)已發(fā)表的通用設(shè)計(jì)原則化化ashir et.al 2001 ,Schwarz et.al 2003,趾vorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al 2004，Ui-Tei et.al 2004)，通過(guò)在線工具完成設(shè)計(jì)，該在線工具為：siRNASelectionProgram of肺itehead Institute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和 BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITR0GEN(winner of the 2004Frost&SulIivan Excellence in Research AwarcUhttps ://rnaidesigner. invitrogen. com/sirna/)。為了 進(jìn)一步提高SiRNA片斷的有效性，綜合兩個(gè)在線設(shè)計(jì)工具的優(yōu)點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)用于篩選的SiRNA片 斷。最后，通過(guò)同源性比對(duì)(NCBI BLAST)來(lái)過(guò)濾S iRNA序列，W提高S iRNA片斷的特異性并減 少RNAi干擾的脫祀效應(yīng)。
[0025] 優(yōu)選地，所述SiRNA的序列如沈Q ID NO.7和沈Q ID NO.8所示。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種用于治療食管癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括上面所 述的SENP3基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑。
[0027] 本發(fā)明的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體，其中該載體可為賦形劑、稀釋 劑、增稠劑、填充劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、油脂或非油脂的基劑、表面活性劑、懸浮劑、膠 凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、著色劑或香料其中之一或兩者W上的混合。
[0028] 本發(fā)明的藥物組合物可用于制造治療食管癌的藥劑。
[0029] 本發(fā)明的藥物組合物首選應(yīng)用于哺乳動(dòng)物，其中該哺乳動(dòng)物優(yōu)選為人類病患。
[0030] 本發(fā)明的藥物組合物可例如W 口服、注射等方式給予至該人類病患體內(nèi)。
[0031] 本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療食管癌的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可W 大大提到治療的成功率。
[0032] 在本發(fā)明的上下文中/'SENP3基因"包括SENP3基因 W及SENP3基因的任何功能等 同物的多核巧酸。SENP3基因包括與目前國(guó)際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank中SENP3基因 (NC_000017.11)DNA序列具有70%W上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0033] 優(yōu)選地，沈NP3基因的編碼序列包括W下任一一種DNA分子：
[0034] (1)序列表中沈Q ID NO. 1所示的DNA序列；
[0035] (2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0036] (3)與（1)或(2)限定的DNA序列具有70 %、優(yōu)選地，90 % W上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0037] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述SENP3基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[003引在本發(fā)明的上下文中，SENP3基因表達(dá)產(chǎn)物包括SENP3蛋白W及SENP3蛋白的部分 膚。所述SENP3蛋白的部分膚含有與食管癌相關(guān)的功能域。
[0039] "SENP3蛋白"包括SENP3蛋白W及SENP3蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物 包括SENP3蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變 體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與SENP3的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。
[0040] 優(yōu)選地，SENP3蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：
[0041] (1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0042] (2)將SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，較佳地1-30 個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)。
[0043] (3)與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又稱為序列同一性）， 更優(yōu)選地，與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多膚。
[0044] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述SENP3蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)。
[0045] 通常，已知的是，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0046] 通過(guò)添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是SENP3蛋白的融合 蛋白。對(duì)于與SENP3蛋白融合的膚或者蛋白質(zhì)沒(méi)有限制，只要所得的融合蛋白保留SENP3蛋 白的生物學(xué)活性即可。
[0047] 本發(fā)明的SENP3蛋白也包括對(duì)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要 經(jīng)過(guò)修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留SENP3蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類修飾蛋白質(zhì)中突變 的氨基酸數(shù)目通常是10個(gè)或者更少，例如6個(gè)或者更少，例如3個(gè)或者更少。
[004引在本發(fā)明的上下文中，"診斷食管癌"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有食管癌、也 包括判斷受試者是否存在患有食管癌的風(fēng)險(xiǎn)。
[0049] 在本發(fā)明的上下文中，"治療食管癌"從疾病的狀態(tài)變化來(lái)分，可W包括疾病的緩 解、疾病的完全治愈，還包括用于評(píng)價(jià)疾病的治療效果。
[0050] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0051] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 SENP3基因表達(dá)與食管癌相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)受試者組織中SENP3的 表達(dá)，可W判斷受試者是否患有食管癌、或者判斷受試者是否存在患有食管癌的風(fēng)險(xiǎn)，從而 指導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。
[0052] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標(biāo)記物-SENP3基因，相比傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，基因診斷 更及時(shí)、更特異、更靈敏，能夠?qū)崿F(xiàn)食管癌的早期診斷，從而降低食管癌的死亡率。
【附圖說(shuō)明】
[0053] 圖1顯示利用基因忍片檢測(cè)SENP3基因在食管癌組織與正常組織中的表達(dá)情況； [0化4]圖2顯示利用Western blot檢測(cè)SENP3蛋白在食管癌組織與正常組織中的表達(dá)情 況；
[0化5] 圖3顯示利用QPCR檢測(cè)SiRNA對(duì)沈NP3基因的干擾效率；
[0化6] 圖4顯示利用Western blot檢測(cè)SiRNA對(duì)沈NP3蛋白表達(dá)的影響；
[0057]圖5顯示抑制SENP3蛋白功能對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響。
[005引具體的實(shí)施方式
[0059] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。W下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York = Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0060] 實(shí)施例1 SENP3基因的差異表達(dá)
[0061] 1、實(shí)驗(yàn)材料；
[0062] 食管癌組織為醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的標(biāo)本，正常組織為胃鏡室鏡下取出的標(biāo)本， 手術(shù)切除的食管腫瘤組織離體后立即取材，取材時(shí)均佩戴一次性無(wú)菌手套，應(yīng)用高壓滅菌 的手術(shù)刀片切取。
[0063] 所有病例均經(jīng)病理確診。包括食管癌組織40例，正常食管組織30例。其中食管鱗癌 34例，食管腺癌6例。W正常食管組織作為對(duì)照組。所有患者術(shù)前均病理證實(shí)，術(shù)前均未行放 療、化療等治療，且無(wú)其他部位的腫瘤等。所有組織均在手術(shù)半小時(shí)內(nèi)液氮保存后，移入-80 度冰箱凍存。
[0064] 2、食管癌組織和正常食管上皮組織的RNA的獲取
[00化]使用化i Z01-步法提取食管癌組織和正常食管組織的總RNA，通過(guò)化no化op ND-1000讀取260nm和28化m處的吸光度值(A)測(cè)定RNA溶液的純度。經(jīng)1 %甲醒變性瓊脂糖凝膠 電泳，紫外透射光下觀察，檢測(cè)RNA的完整性。
[0066] 3、基因忍片雜交及掃描
[0067] 總RNA經(jīng)線性化擴(kuò)增后，cy3-UTP標(biāo)記，巧光標(biāo)記后的cRNAs采用歴EASY Mini Kit 純化，用Amhion的RNA化agmen化tion Reagents對(duì)標(biāo)記好的cRNAs進(jìn)行片段化處理。采用美 國(guó)Agilent公司的人全基因表達(dá)譜忍片(4x 44K基因），在忍片雜交爐中65°C雜交17h，然后 洗脫、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner掃描儀掃描。
[0068] 4、忍片數(shù)據(jù)處理與分析
[0069] 雜交后的忍片經(jīng)忍片掃描儀讀取數(shù)據(jù)點(diǎn)后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件，對(duì)于兩組比值 的自然對(duì)數(shù)絕對(duì)值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達(dá)基因。
[0070] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0071]采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，P< 0.05差異有顯著性意義。
[007^ 6、結(jié)果
[0073] 結(jié)果顯示（如圖1所示），與正常食管組織相比，食管癌組織中SENP3基因的mRNA水 平顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇.05)。
[0074] 實(shí)施例2 SENP3蛋白的差異表達(dá) [00巧]1、研究對(duì)象同實(shí)施例1。
[0076] 2、提取組織總蛋白
[0077] 按照化i如化組織/細(xì)胞總蛋白提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白提取的操作。
[0078] 3、Weste;rn blot檢測(cè)
[0079] 將提取的蛋白定量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗解育、二抗解育、 顯色。
[0080] 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0081 ]將蛋白條帶的灰度值使用Image J軟件進(jìn)行分析，We-actin為內(nèi)參，將SENP3蛋白 條帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。
[00劇 5、結(jié)果
[0083] 結(jié)果如圖2所示，與正常食管組織相比，食管癌組織中SENP3蛋白的表達(dá)水平顯著 增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇. 05)。
[0084] 實(shí)施例3抑制SENP3基因表達(dá)
[0085] UsiRNA設(shè)計(jì)合成
[0086] 針對(duì) SENP3 的 SiRNA 序列：
[0087] SiRNAl-沈NP3:
[008引 正義鏈為5'-ACGUUUGAAGGAAUUCGUCCA-3'（沈Q ID N0.7);
[0089] 反義鏈為5'-GACGAAUUCCUUCAAACGUAU-3'（沈Q ID N0.8)，
[0090] siRNA2-沈 NP3:
[0091] 正義鏈為5'-AACUAUUGAAGAAAUGCACCU-3'（沈Q ID N0.9);
[0092] 反義鏈為5'-GUGCAUUUCUUCAAUAGUUUC-3'（SEQ ID N0.10)，
[0093] siRNA3-沈NP3:
[0094] 正義鏈為5'-UAGAUACUUGGCAAUAUGCUU-3'（沈Q ID N0.11);
[0095] 反義鏈為5'-GCAUAUUGCCAAGUAUCUACA-3'（沈Q ID N0.12)
[0096] 陰性對(duì)照SiRNA序列(SiRNA-NC):
[0097] 正義鏈為5'-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3'（沈Q ID N0.13);
[009引反義鏈為5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3'（沈Q ID N0.14)。
[0099] 2、食管癌細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
[0100] 2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0101] 食管癌細(xì)胞系ECA109接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中、將其放置于37 °C、5 % CO播養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)80 %融合時(shí)，用0.化％膜蛋白酶消化傳代。
[0102] 2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0103] 將食管癌細(xì)胞按1 X 10^孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中細(xì) 胞培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購(gòu)自于Invitrogen公司）的說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分 為、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(20nM)，其中，陰性對(duì)照組SiRNA與SENP3基因的序列無(wú)同源性，濃 度為20nM/孔，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染。
[0104] 2、利用QPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)S iRNA的干擾效率。
[0105] 2.1提取細(xì)胞總RNA利用常規(guī)方法進(jìn)行操作。
[0106] 2.2逆轉(zhuǎn)錄
[0107] 利用TAKARA公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄。
[010引 2.3 QPCR
[0109] (1)引物設(shè)計(jì)
[0110] 根據(jù)Genbank中SENP3基因和GAPDH基因的編碼序列設(shè)計(jì)QPCR擴(kuò)增引物，由上海生 工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。具體引物序列如下：
[0111] 沈 NP3 基因：
[0112] 正向引物為5'-CATATTGCCAAGTATCTAC-3'（沈Q ID N0.3);
[0113] 反向引物為5'-GTCACTGTCATTATTCTG-3'（沈Q ID N0.4),
[0114] GAro 蠟因：
[0115] 正向引物為5'-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID N0.5);
[0116] 反向引物為5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（沈Q ID N0.6)。
[0117] (2)按照表1配審化CR反應(yīng)體系：
[011引其中，SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系購(gòu)自Invitrogen公司。
[0119] 表1 PCR反應(yīng)體系 rni9ni
[0121] (3)PCR反應(yīng)條件：95°CIOmin，（95°C 15s，60°C40s)*45個(gè)循環(huán)。Wsybr Green作為 巧光標(biāo)記物，在Li曲t切cler巧光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)融解曲線分析和電泳確 定目的條帶，A A CT法進(jìn)行相對(duì)定量。
[0122] 2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0123] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，干擾SENP3基因表達(dá)組與對(duì)照組之間的差異采 用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0124] 2.5 結(jié)果
[0125] 結(jié)果如圖3所示，與siRNA2-沈NP3、siRNA3-沈NP3相比，siRNAl-SENP3能夠更有效 的抑制SENP3基因的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，使用siRNAl-SENP3進(jìn)行后續(xù)的實(shí) 驗(yàn)。
[01%] 3、Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SiRNAl-沈NP3的干擾效率 [0127] 步驟同實(shí)施例2。
[012引結(jié)果如圖4所示，與轉(zhuǎn)染SiRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染SiRNAl-SENPS的細(xì)胞中沈NP3蛋白 的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
[0129] 實(shí)施例4 SENP3基因的表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖能力的測(cè)定
[0130] 使用Cell Counting kit-8(cck-8)試劑盒用于檢測(cè)食管癌細(xì)胞增殖
[0131] 1、步驟
[0132] 按照前面實(shí)施例的方法進(jìn)行食管癌細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，細(xì)胞分為二個(gè)實(shí)驗(yàn)組：
[0133] 組1:轉(zhuǎn)染SiRNA-NC細(xì)胞組；
[0134] 組2:轉(zhuǎn)染SiRNAl-沈NP3細(xì)胞組。
[0135] 轉(zhuǎn)染2地后，W2.5 XioVml密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)=復(fù) 孔，每孔加入IOyl的CCK-8溶液，37°C，5 %C〇2培養(yǎng)箱中解育4h;然后按照試劑盒說(shuō)明，選擇 450nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度值(OD值）。
[0136] 2、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0137] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[013引3、結(jié)果
[0139] 結(jié)果如表2所示，與轉(zhuǎn)染SiRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNAl-SENP3細(xì)胞組細(xì)胞增殖緩 慢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沈NP3基因表達(dá)促進(jìn)了食管癌細(xì)胞 的增殖。
[0140] 表2食管癌細(xì)胞OD值 「ni/M 1 10142」實(shí)施例5食管癌細(xì)胞抗體中和實(shí)驗(yàn)
[0143] 1、步驟：
[0144] 將食管癌細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2*103個(gè)細(xì)胞/孔/200iU，細(xì)胞貼壁 后進(jìn)行如下處理：
[0145] 實(shí)驗(yàn)組1(對(duì)照組）：食管癌細(xì)胞中加入無(wú)關(guān)單抗(1:50);
[0146] 實(shí)驗(yàn)組2:食管癌細(xì)胞中加入抗人沈NP3單抗(1:50)。
[0147] 將細(xì)胞在37°C、5%C02培養(yǎng)箱解育24小時(shí)后，加入化-TdRQ此i/孔），再培養(yǎng)24小 時(shí)，收集細(xì)胞，加液體閃爍液，的十?dāng)?shù)儀檢測(cè)cpm值。
[014引2、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0149]實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[01加 ]3、結(jié)果
[0151] 結(jié)果如圖5所示，相比于對(duì)照組，加入抗人SENP3單抗的細(xì)胞組細(xì)胞增殖減緩。上述 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制SENP3蛋白的功能可W抑制食管癌細(xì)胞增殖。
[0152] 上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，運(yùn)些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)SENP3基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷食管癌的工具中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括:通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、 免疫檢測(cè)、原位雜交、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)SENP3基因表達(dá)以診斷食管癌的產(chǎn)品；所 述用RT-PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增SENP3基因的引物;所述用實(shí)時(shí)定量 PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增SENP3基因的引物;所述用免疫檢測(cè)診斷食管 癌的產(chǎn)品包括:與SENP3蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診斷食管癌的產(chǎn)品包括： 與SENP3基因的核酸序列雜交的探針;所述用芯片診斷食管癌的產(chǎn)品包括:蛋白芯片和基因 芯片;其中，蛋白芯片包括與SENP3蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與SENP3基因的核 酸序列雜交的探針。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至 少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增SENP3基因的引物如SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示。4. 一種診斷食管癌的工具，其特征在于，所述工具包括檢測(cè)SENP3基因表達(dá)的試劑；所 述試劑包括檢測(cè)SENP3基因 mRNA的引物和/或探針、檢測(cè)SENP3蛋白的抗體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的工具，其特征在于，所述檢測(cè)SENP3基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物對(duì)。 6. SENP3基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑在制備治療食管癌的藥物中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制劑包括抑制SENP3基因表達(dá)的試 劑、和/或抑制SENP3基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制SENP3基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括 抑制針對(duì)SENP3基因的s iRNA、和/或SENP3蛋白的抗體。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述針對(duì)SENP3基因的siRNA序列如SEQ ID NO .7和SEQ ID NO .8所示。10. -種用于治療食管癌的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)所述的抑制劑。
【文檔編號(hào)】A61K45/00GK105861741SQ201610472221
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】田子強(qiáng), 溫士旺, 蘇鵬, 徐延昭
【申請(qǐng)人】河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院