一種基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測pedv早期感染的方法
【專利摘要】本發(fā)明專利提供了一種從糞便中快速高效地富集病毒，通過特異性DNA標簽偶聯(lián)的金納米顆粒放大信號，再用PCR快速檢測PEDV早期感染的方法。本方法以位于PEDV全基因組中ORF1a基因為靶序列，設計特異性核酸探針，從中篩選和優(yōu)化出具有高度特異性，富集病毒能力強、易于擴增和檢測的2段探針，利用此2段探針分別功能化的磁性微粒和納米金微粒，建立基于納米微粒的PEDV特異性的PCR檢測技術(shù)；同時，本技術(shù)方法實現(xiàn)了糞便樣品裂解液與功能化磁性微粒直接進行雜交反應的技術(shù)突破，完全省略了樣品核酸的純化步驟，不僅提高了特異性和敏感性，同時進一步簡化了檢測步驟，縮短了檢測時間。本發(fā)明提供的方法不僅省時、省力、成本低，而且可以準確提示動物病毒感染水平。
【專利說明】
-種基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測PEDV早期感染的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設及一種從早期感染豬糞便中快速檢測豬流行性腹瀉病毒(P抓V)低劑量 感染的方法，具體設及一種基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測PEDV早期感染的方法，屬于 獸醫(yī)學檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬病毒性腹瀉病對養(yǎng)豬業(yè)的影響日趨嚴重，給我國的 養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，同時也對運些傳染病的早期快速診斷及防治帶來新的挑 戰(zhàn)。
[0003] 豬病毒性腹瀉的病原主要包括:豬流行性腹瀉病毒(P抓V)、豬傳染性胃腸炎病毒 (TGEV)、豬輪狀病毒(PoRV),其中PEDV近年來在我國呈現(xiàn)暴發(fā)趨勢，成為危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā) 展的主要病原。豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種高度接觸性豬腸道傳染 病，病豬主要W嚴重腹瀉，嘔吐和脫水為臨床特征。任何年齡的豬均易感，哺乳仔豬、架子豬 或育肥豬的發(fā)病率可達100%，尤其哺乳仔豬受害最嚴重。由于P抓與豬傳染性胃腸炎、豬輪 狀病毒感染等的臨床癥狀和病理變化及其相似，僅根據(jù)臨床癥狀和病理變化無法對pm)做 出確診。
[0004] 目前豬流行性腹瀉疾病尚缺乏有效的根治手段，主要靠預防監(jiān)控和隔離處理。目 前針對豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的傳統(tǒng)檢測方法包括:病毒的分離培養(yǎng)、原位核酸雜交、 ELISA、間接免疫巧光、RT-PCR等。運些方法都不同程度的具有操作繁瑣、耗時費力、特異性 差、敏感性低、或檢測范圍局限等缺點。目前檢測PEDV亞基因組S、M、N、0RF3的real-time PCR方法已經(jīng)建立，但用real-time PCR方法定量病毒耗費較高，檢測敏感度比普通的RT-PCR僅能提高數(shù)十倍，因此在生產(chǎn)實踐中受到經(jīng)濟成本的限制。另外，我們發(fā)現(xiàn)，用針對PEDV 全基因組和亞基因組引物，通過RT-PCR和real-time PCR方法定量病毒時，病毒定量結(jié)果明 顯不同，因此針對位于PEDV全基因組的復制酶基因設計特異性探針，并進行早期快速檢測， 可W更準確真實的反應感染早期體內(nèi)的病毒滴度，從而為此疾病的防治提供實時、精確的 指導。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種省時、省力、成本低的基于納米 金標簽放大技術(shù)快速檢測PEDV早期感染的方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下技術(shù)方案：
[0007] -種基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測PEDV早期感染的方法，包括如下步驟：
[000引 Sl陽DV特異性核酸探針設計與篩選：
[0009] 根據(jù)已上傳至NCBI的陽DV的不同毒株使用DNASTAR或VECTOR NTI 9.0軟件進行多 重序列比對，根據(jù)編碼復制酶的ORFla基因 保守區(qū)域設計16段特異性核酸探針，將所設計的 核酸探針分別標記于磁性微粒和納米金顆粒，形成功能化的磁珠和納米金顆粒，并對其進 行優(yōu)化和篩選；
[0010] 功能化探針的篩選：
[0011] 16段功能化磁珠探針序列為：
[0012]
[0013]
[0014]
[0015]
[0016] 功能化磁珠的篩選過程如下：將所設計的16段特異性核酸探針分別標記磁性微 粒，形成MMPs-pl ,p2,p3,p4,p5,p6,p7,p8,p9,pl0,pll ,口12,口13,口14,口15,口16，制備陽0￥特 異性探針標記的磁性微粒的具體步驟如下所述，將功能化的磁珠與病毒RNA在雜交緩沖液 中40°C解育30min，磁分離，用陽DV特異性的RT-PCR檢測；
[0017] 功能化納米金顆粒的篩選過程如下:將所設計的16段特異性核酸探針分別標記納 米金顆粒，形成AuNPs-oligol ,oligo2 ,oligo3 ,oligo4 ,oligo5 ,oligo6 ,oligo7 ,oligo8, oligo9,oligol0 ,oligolloligol2 ,oligol3 ,oligol4,oligol5 ,oligol6,制備陽 DV 特異性 探針標記的AuNPs的具體步驟如下所述，將不同探針功能化的納米金顆粒與病毒RNA在雜交 緩沖液中50°C解育40min，離屯、沉淀后，用陽DV特異性的RT-PCR檢測。
[0018] 經(jīng)篩選確定的功能化磁珠探針序列為Probe 1:
[0019] 5，NH2-Ti5GCCTCAGAATAGTATGAGACGGCTTC;(76-101)
[0020] 經(jīng)篩選確定的功能化納米金顆粒探針序列為Oligo 2:
[0021] 5' SH-TisCCTGTAGATAGTAGCAAGTGGCTCAGACCGTGATGGAATGGA；(626-651)
[0022] S2制備陽DV特異性探針標記的磁性微粒：
[0023] 特異性探針序列為：
[0024] 5 ' Mfc-TisGCCTCAGAATAGTATGAGACGGCTTC;
[0025] S3制備特異性信號探針標記的納米金顆粒：
[0026] 特異性探針序列為：
[00打]5 ' SH-TisCCTGTAGATAGTAGCAAGTGGCTCAGACCGTGATGGAATGGA;
[002引S4陽DV探針標記的磁性微粒和納米金顆粒與糞便樣本中陽DV病毒RNA的雜交反應 及目標DNA標簽的洗脫：
[0029] S4.1取糞便樣本與PBS緩沖液滿旋混勻，4,000g離屯、IOmin去除糞便殘渣；
[0030] S4.2取處理后的陽DV糞便樣本上清50化L和50化L裂解液至1.5mL離屯、管中，煮沸 15min使病毒RNA釋放，4°C，13400g離屯、5min，取上清備用，其中，裂解液為：lOmmol/L Tris-肥l，lmmol/L 邸TA，15mmol/L NaCl，0.5% SDS，pH 8.0;
[0031] S4.3向步驟S4.2中的糞便樣本裂解液上清中，加入化L標記后的磁性微粒MMPs-pl 和110化雜交緩沖液混勻，40 °C雜交30min，雜交完畢后加入化L標記后的納米金顆粒AuNPs-Ol igo 2混勻，50 °C雜交40min，獲得AuNPs-RNA-MMPs復合物，其中，雜交緩沖液:20 X SSC， 1% Tween-20和2 % SDS;
[0032] S4.4每次取ImL TE緩沖液，磁分離洗2-3次，去除殘留的雜交緩沖液，未結(jié)合的探 針和DNA標簽；
[0033] S4.5用I(K)化新配置的DTT洗脫液與AuNPs-RNA-MMPs復合物在室溫下作用lOmin， 磁分離3min后取上清液，其中，DTT洗脫液為:0.5mol/L DTT,IOmM IYis-HCiamM EDTA，抑 7.5;
[0034] S4.6在洗脫上清液加入1/10體積的NaAc和2倍體積的無水乙醇，沉淀30min;
[00對 S4.7在4。(：條件下，13400g離屯、lOmin，棄上清，加入75%乙醇洗涂兩次；
[0036] S4.8在4°C條件下，13400g離屯、IOmin，棄上清，自然風干，加入10化d地2〇溶解DNA 標簽；
[0037] S5PCR檢測與陽DV特異結(jié)合的DNA標簽：
[003引S5. IW巧光素酶報告基因載體為模板，PCR擴增獲取接頭DNA片段
[0039] 上游引物F: TGGCATTCCGGTACTGTTGG，
[0040] 下游引物R: AGGAGAATAGGGTTGGCACC，
[0041 ] 采用50i^l體系：10Xbuffer扣L，dNTP化L，上游引物化L，下游引物化L，l'aq酶0.5 yl，模板0.化Udd出0 38.0化；
[0042] 反應程序如下:94°C預變性4min;94°C變性1111111，54.8°(：退火3〇3,72°(：延伸6〇3，共 30個循環(huán)；72°C延伸IOmin;
[0043] 將W巧光素酶報告基因載體模板PCR擴增獲取的接頭DNA片段切膠回收，并浸泡于 TE中4°C保存；
[0044] S5.2 W接頭DNA片段和洗脫的DNA標簽為模板，
[0045] 上游引物:GATGCACATATCGAGGTGG，
[0046] 下游引物:AAGTGTCCACATACGCAC，
[0047] 采用體系：10Xbuffer 2.化L，dNTP化L，上游引物0.化L，下游引物0.化L， Taq酶0.化L，模板包括接頭DNA片段14.5ng，純化的DNA標簽10化，d地2〇加至化化；
[004引反應程序如下：94°C預變性5min; 94°C變性Imin，45 °C連接2min，72 °C延伸50s，共5 個循環(huán);94°C變性40s，57°C退火30s，72°C延伸35s，共30個循環(huán);72°C延伸lOmin;
[0049] 取2扣L PCR擴增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳并使用凝膠成像儀觀察和記 錄結(jié)果。
[0050] 其中，所述步驟S2中，制備PEDV特異性探針標記的磁性微粒的具體步驟如下：
[0化1] S2.1吸取50化濃度為lOmg/mL的未標記磁珠至離屯、管，磁分離2min，棄去上清；
[0052] S2.2向離屯、管中加入10化L TE緩沖液搖勻，磁分離，吸去上清；
[0化3] S2.3重復操作步驟S2.2-次；
[0化4] S2.4將10化L IOOmM MES、抑4.8的緩沖液加入離屯、管中，利用磁分離的方法清洗 磁珠兩次，然后用50iiL上述MES緩沖液重懸磁珠；
[0055] S2.5向20化1.25M EDC-IOOmM MES、抑4.8的溶液中加入10化濃度為100皿〇1/1 的陽DV特異性探針，再加入20化出0，使最終體積達到50化，其中，特異性探針序列為：
[0056] 5 ' Mfc-TisGCCTCAGAATAGTATGAGACGGCTTC;
[0057] S2.6將步驟S2.5中的核酸-EDC溶液加入到步驟S2.4的磁珠中，混勻后室溫解育化 W上或過夜，磁分離，棄去上清；
[0化引 S2.7將10化L TT緩沖液加入步驟S2.6處理后的磁珠中，搖勻，解育SOmin W上，磁 分離，棄去上清，其中，TT緩沖液:1M Tris-肥1，抑8.0,0.1% Tween-20;
[0化9] S2.8重復操作步驟S2.7兩次；
[0060] S2.則尋磁珠重懸于SOiiL TE緩沖液中至磁珠終濃度為lOmg/mL，于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0061 ]其中，所述步驟S3中，制備特異性信號探針標記的納米金顆粒的具體步驟如下：
[0062] S3.1取lOnmol/L，直徑15nm的納米金溶液1.0mL，7500g離屯、50min，去上清液，用 10化L無菌去離子水重懸；
[0063] S3.2加入化L濃度為100皿ol/L特異性探針，特異性信號探針終濃度為3曲lol/L，室 溫解育16h，其中，特異性探針序列為：
[0064] 5 ' SH-TisCCTGTAGATAGTAGCAAGTGGCTCAGACCGTGATGGAATGGA;
[00化]S3.3分S次加入lmol/L化a和0.1mol/L、pH7.2的PB，至化a和PB的終濃度分別 為0.1 mo 1 /L和1 Ommo 1 /L，充分混勻，室溫解育48h W上；
[0066] S3.4用O.Olmol/L PBS溶液W7500g離屯、清洗50min，清洗兩次，去上清液，WlOOiiL 的 O.Olmol/L PBS 重懸，4°C 儲存?zhèn)溆?，其中，PBS 溶液：135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM K出P〇4,8mM K2HP〇4，pH 7.2。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0067] 技術(shù)方案改進：
[006引1.本發(fā)明基于陽DV編碼復制酶蛋白基因 ORFla保守區(qū)域，經(jīng)過一系列篩選標準，如 連續(xù)不超過S個連續(xù)的堿基(A/T/G/C)，GC含量超過40%等，評估其結(jié)合能力、雜交難度和 錯配率，共得到16段核酸序列，并經(jīng)過一系列探針篩選試驗，最終選取MMPs-Pl和AuNPs-01ig02為捕獲PEDV核酸和富集病毒信號的特異性探針。
[0069] 2.本發(fā)明中，糞便樣品經(jīng)洗涂后，直接與裂解液混合煮沸，糞便樣本裂解上清中可 直接加入功能化磁珠和雜交緩沖液，而不需要經(jīng)過核酸的純化沉淀步驟，大大縮短了檢測 時間，并進一步增加了檢測的樣本量和敏感度。
[0070] 3.已申報發(fā)明是針對疑似感染動物血液樣本中TGEV進行檢測，本發(fā)明可從處理后 的糞便樣本中檢測到陽DV病毒的存在，檢測敏感度可達到甚至超過血液樣本。
[0071] 綜上所述，本發(fā)明公開的一種基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測陽DV早期感染的 方法，具有W下有益效果：
[0072] 1.針對陽DV特異性核酸探針設計、篩選及優(yōu)化，可提高此方法的特異性，敏感性和 重復性。
[0073] 2.不需要經(jīng)過從糞便中提取RNA，再反轉(zhuǎn)的繁瑣步驟。
[0074] 3.糞便樣本裂解后，裂解液可直接與探針功能化的磁珠進行雜交反應，不需要從 裂解液中沉淀純化病毒核酸，步驟更為簡便。
[0075] 4.在PEDV感染早期，病毒滴度低的情況下，可從糞便中快速高效地富集病毒，并在 此基礎(chǔ)上進一步通過特異性DNA標簽偶聯(lián)的金納米顆粒將核酸樣本信號放大，使核酸樣本 達到PCR檢測所需的核酸模板濃度，具有省時、省力、成本低等特點。
【附圖說明】
[0076] 圖1是基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測PEDV早期感染的方法流程圖；
[0077] 圖2是基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測陽DV早期感染方法靈敏度分析核酸電泳 圖；
[0078] 圖3是基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測陽DV早期感染方法特異性分析核酸電泳 圖；
[0079] 圖4是不同功能化磁珠和納米金顆粒捕獲核酸能力對比。
【具體實施方式】
[0080] 本發(fā)明根據(jù)位于PEDV全基因組，編碼復制酶的ORFla基因設計了特異性探針，可W 更準確反應感染性病毒粒子水平。另外，雖然基于DNA標簽檢測TGEV早期血液樣本的方法已 經(jīng)建立，但是本方法可檢測豬糞便中的PEDV，同時本方法根據(jù)ORFla基因保守區(qū)域設計了 16 段特異性探針，通過一系列試驗從而篩選和優(yōu)化出特異性強，富集病毒及擴增能力高的2段 核酸探針，進一步提高此方法的特異性，敏感性和重復性。同時，本技術(shù)方法在檢測方法上 進一步進行了改進，樣本裂解后可直接與功能化磁珠進行雜交，而不需要經(jīng)過核酸的沉淀 純化步驟，大大縮短了檢測時間。
[0081 ]請參見圖1，是基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測PEDV早期感染的方法流程圖。
[0082] -種基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測PEDV早期感染的方法，包括如下步驟：
[0083] Sl陽DV特異性核酸探針設計與篩選：
[0084] 根據(jù)已上傳至化tional Center for Biotechnology Information(NCBI)的陽DV 的不同毒株使用DNASTAR或VECTOR NTI 9.0軟件進行多重序列比對，根據(jù)編碼復制酶的 ORFla基因保守區(qū)域分別設計16段特異性核酸探針，將所設計的核酸探針分別標記于磁性 微粒和納米金顆粒，形成功能化的磁珠(MMPs)和納米金顆粒(AuNPs),并對其進行優(yōu)化和篩 選；
[0085] 功能化探針的篩選：
[0086] 其中，16段功能化磁珠探針序列為：
[0087]
[008引
[0089]
[0090]
[0091]
[0092] 功能化磁珠的篩選過程如下：將所設計的16段特異性核酸探針分別標記磁性微 粒，形成MMPs-pl ,p2,p3,p4,p5,p6,p7,p8,p9,pl0,pll ,口12,口13,口14,口15,口16，制備陽0￥特 異性探針標記的磁性微粒的具體步驟如下所述，將功能化的磁珠與病毒RNA在雜交緩沖液 中40°C解育30min，磁分離，用陽DV特異性的RT-PCR檢測；
[0093] 功能化納米金顆粒的篩選過程如下:將所設計的16段特異性核酸探針分別標記納 米金顆粒，形成AuNPs-oligol ,oligo2 ,oligo3 ,oligo4 ,oligo5 ,oligo6 ,oligo7 ,oligo8, oligo9,oligol0,oligoll ,oligol2,oligol3,oligol4,oligol5,oligol6,制備陽DV特異性 探針標記的AuNPs的具體步驟如下所述，將不同探針功能化的納米金顆粒與病毒RNA在雜交 緩沖液中50°C解育40min，離屯、沉淀后，用陽DV特異性的RT-PCR檢測。
[0094] 實驗結(jié)果表明：MMP-Pl和歷P-p2具有較高的捕獲PEDV RNA的能力，OligOl和 〇lig〇2標記的納米金顆粒具有較高與病毒核酸結(jié)合的能力。因此選用MMP-Pl和oligo2-AuNPs用于豬流行性腹瀉病毒UNDP-PCR檢測。
[00M]即確定的功能化磁珠探針序列為Probe 1:
[0096] 5'NH2-T15GCCTCAGAATAGTATGAGACGGCTTC;(76-101)
[0097] 確定的功能化納米金顆粒探針序列為Oligo 2:
[0098] 5' SH-TisCCTGTAGATAGTAGCAAGTGGCTCAGACCGTGATGGAATGGA；(626-651)
[0099] S2制備陽DV特異性探針標記的磁性微粒(MMPs):
[0100] 制備如下探針序列標記的磁性微粒：
[0101] 5 ' Mfc-TisGCCTCAGAATAGTATGAGACGGCTTC;
[0102] 本實施例中，制備PEDV特異性探針標記的磁性微粒的具體步驟如下：
[0103] S2.1吸取50化濃度為lOmg/mL的未標記磁珠至離屯、管，磁分離2min，棄去上清；
[0104] S2.2向離屯、管中加入100化TE(IM Tris Buffer pH 8.0,ImM邸TA)緩沖液搖勻， 磁分離，吸去上清；
[01化]S2.3重復操作步驟S2.2-次；
[0106] S2.4將10化L IOOmM MES、抑4.8的緩沖液加入離屯、管中，利用磁分離的方法清洗 磁珠兩次，然后用SOiiL上述MES緩沖液重懸磁珠；
[0107] S2.5向20化1.25M EDC-IOOmM MES、抑4.8的溶液中加入10化濃度為100皿〇1/1 的陽DV特異性探針，再加入20化出0，使最終體積達到50化，其中，特異性探針序列為：
[0108] 5 ' Mfc-TisGCCTCAGAATAGTATGAGACGGCTTC;
[0109] S2.6將步驟S2.5中的核酸-EDC溶液加入到步驟S2.4的磁珠中，混勻后室溫解育化 W上或過夜，磁分離，棄去上清；
[0110] S2.7將 100化 TT緩沖液（IM Tris-肥 1，pH 8.0,0.1% Tween-20)加入步驟S2.6處 理后的磁珠中，搖勻，解育30min W上，磁分離，棄去上清；
[0111] S2.8重復操作步驟S2.7兩次；
[0112] S2.則尋磁珠重懸于50化TE緩沖液中至磁珠終濃度為lOmg/mL，于4°C保存?zhèn)溆?保 存期為6個月）。
[0113] S3制備特異性信號探針標記的納米金顆粒(AuNPs):
[0114] 制備如下探針序列標記的納米金顆粒：
[0115] 5 ' SH-TisCCTGTAGATAGTAGCAAGTGGCTCAGACCGTGATGGAATGGA;
[0116] 本實施例中，制備特異性信號探針標記的納米金顆粒的具體步驟如下：
[0117] S3.1取lOnmol/L，直徑15nm的納米金溶液1.0mL，7500g離屯、50min，去上清液，用 10化L無菌去離子水重懸；
[011引 53.2加入化1^農(nóng)度為100^1101/1特異性探針，特異性信號探針終濃度為3曲101/1，室 溫解育16h，其中，特異性探針序列為：
[0119] 5 ' SH-TisCCTGTAGATAGTAGCAAGTGGCTCAGACCGTGATGGAATGGA;
[0120] S3.3分S次加入lmol/L化a和0.1mol/L、pH7.2的PB，至化a和PB的終濃度分別 為0.1 mo 1 /L和1 Ommo 1 /L，充分混勻，室溫解育48h W上；
[0121] 53.4用0.01111〇1/1?85(135111]\1化(：1，2.7111]\11((：1，1.5111]\11(出口〇4，日11(1811111(2冊〇4， pH 7.2)溶液W7500g離屯、清洗50min，清洗兩次，去上清液，WlOO化的O.Olmol/L PBS重懸， 4°C儲存?zhèn)溆?保存期為6個月）。
[0122] S4 PEDV探針標記的磁性微粒和納米金顆粒與糞便中PEDV病毒RNA的雜交反應及 目標DNA標簽的洗脫：
[0123] S4.1取糞便樣本與PBS緩沖液滿旋混勻，4,000g離屯、IOmin去除糞便殘渣；
[0124] S4.2取處理后的PEDV糞便樣本上清500化和500化裂解液（lOmmol/L Tris-HCl, 1111111〇1/1￡014，15111111〇1/1化(：1，0.5%505，抑8.0)至1.51111^離屯、管中，煮沸15111111使病毒 RNA釋放，4°C，U400g離屯、5min，取上清備用；
[01巧]S4.3向步驟S4.2中的糞便樣本裂解液上清中，加入化L標記后的磁性微粒MMPs-Pl 和110化雜交緩沖液(20 X SSC，1 % Tween-20和2% SDS)混勻，40°C雜交30min，雜交完畢后 加入2化標記后的納米金顆粒AuNPs-Ol igo2混勻，50 °C雜交40min，獲得AuNPs-RNA-MMPs復 合物；
[0126] S4.4每次取ImL TE緩沖液，磁分離洗2-3次，去除殘留的雜交緩沖液，未結(jié)合的探 針和DNA標簽；
[0127] S4.5用100化新配置的DTT洗脫液（0.5mol/L DTTaomM IYis-HCiamM 抓TA,pH 7.5)與AuNPs-RNA-MMPs復合物在室溫下作用lOmin，磁分離3min后取上清液；
[01 %] S4.6在洗脫液上清液加入1/10體積的NaAc和2倍體積的無水乙醇，沉淀30min;
[0129] 54.7在4°(：條件下，13400旨離屯、1〇111山棄上清，加入75%乙醇洗涂兩次；
[0130] S4.8在4°C條件下，13400g離屯、lOmin，棄上清，自然風干，加入10化d地2〇溶解DNA 柄簽。
[0131] S5 PCR檢測與陽DV特異結(jié)合的DNA標簽：
[0132] S5. IW巧光素酶報告基因載體為模板，PCR擴增獲取接頭DNA片段
[0133] 上游引物尸:166〔41701^^'4口'61766(58-77)，
[0134] 下游引物3:4664644146661766〔40：(967-948)，
[0135] 采用50i^l體系：10Xbuffer扣L，dNTP化L，上游引物化L，下游引物化L，l'aq酶0.5 ^1，模板〇.化1，(1地2〇38.0化；
[0136] 反應程序如下:94°C預變性4min;94°C變性lmin，54.8°C退火30s，72°C延伸60s，共 30個循環(huán)；72°C延伸IOmin;
[0137] 將W巧光素酶報告基因載體模板PCR擴增獲取的接頭DNA片段切膠回收，并浸泡于 TE中4°C保存；
[0138] S5.2 W接頭DNA片段和洗脫的DNA標簽為模板，
[0139] 上游引物:GATGCACATATCGAGGTGG，
[0140] 下游引物:AAGTGTCCACATACGCAC，
[0141] 采用體系：10Xbuffer 2.化L，dNTP化L，上游引物0.化L，下游引物0.化L， Taq酶0.化L，模板包括接頭DNA片段14.5ng，純化的DNA標簽10化，d地2〇加至化；
[0142] 反應程序如下:94°C預變性5min;94°C變性lmin，45°C連接2min，72°C延伸50s，共5 個循環(huán);94°C變性40s，57°C退火30s，72°C延伸35s，共30個循環(huán);72°C延伸IOmin;
[0143] 取25化PCR擴增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳并使用凝膠成像儀觀察和記 錄結(jié)果。
[0144] 請參見圖1。基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測PEDV早期感染方法流程圖。
[0145] 請參見圖2。圖2體現(xiàn)了基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測PEDV早期感染方法靈敏 度分析。圖中：（A)基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測倍比稀釋的糞便樣本；（B)普通RT-PCR 方法檢測倍比稀釋的糞便樣本。
[0146] 由圖2得到的結(jié)論是:基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測PEDV早期感染的方法靈 敏度為25拷貝/g,普通RT-PCR方法的靈敏度為IO 4拷貝/g。此發(fā)明靈敏度是普通RT-PCR的 400倍。
[0147] 請參見圖3。圖3體現(xiàn)了基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測PEDV早期感染方法特異 性分析。圖中：Lane MJrans 2K Plus DNA Marker; lane 1:P抓V; lane 2:健康豬糞便樣 本；lane 3:PCV2;lane 4:PPV;lane 5:TGEV;lane 6:PRRSV;lane 7:CSFV。
[0148] 由圖3得到的結(jié)論是:基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測PEDV早期感染的方法具 有很強的特異性，與其他病毒不會發(fā)生交叉反應。
[0149] 請參見圖4。不同功能化磁珠和納米金顆粒捕獲核酸能力對比。圖中：（A)M:化ans 2K Plus DNA Marker；l:Pl；2:P2；3:P3；4:P4；5:P5；6:P6；7:P7；8:P8；9:P9；10:P10；ll: P11；12:P12；13:P13；14:P14；15:P15；16:P16.(B)MiTrans 2K Plus DNA Marker；!: oligol；2:oligo2；3:oligo3；4:oligo4；5:oligo5；6:oligo6；7:oligoT；8:oligoS；9: oligo9；10:oligol0；11:oligoll；12:oligol2；13:oligol3；14:oligol4；15:oligol5；16: oligol6〇
[0150] 由圖4得出的結(jié)論是:P1和01igo2是具有高度特異性，富集病毒能力強、易于擴增 和檢測的2段探針。
[0151] 本發(fā)明針對PEDV特異性核酸探針設計、篩選及優(yōu)化，提高了此方法的特異性，敏感 性和重復性。在PEDV感染早期，病毒滴度低的情況下，可從糞便中快速高效地富集病毒，并 在此基礎(chǔ)上進一步通過特異性DNA標簽偶聯(lián)的納米金顆粒將核酸樣本信號放大，使核酸樣 本達到PCR檢測所需的核酸模板濃度，具有省時、省力、成本低等特點。而且可W準確反應動 物病毒感染水平。此外，糞便樣本裂解后，裂解液可直接與探針功能化的磁珠進行雜交反 應，不需要從裂解液中沉淀純化病毒核酸，步驟更為簡便。
[0152] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在 不脫離本發(fā)明的前提下，還可W對本發(fā)明做出的若干改進和補充，運些改進和補充，也應視 為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測PEDV早期感染的方法，其特征在于，包括如 下步驟： S1PEDV特異性核酸探針設計與篩選： 根據(jù)已上傳至NCBI的PEDV的不同毒株使用DNASTAR或VECTOR NTI 9.0軟件進行多重序 列比對，根據(jù)編碼復制酶的ORFla基因保守區(qū)域設計16段特異性核酸探針，將所設計的核酸 探針分別標記于磁性微粒和納米金顆粒，形成功能化的磁珠和納米金顆粒，并對其進行優(yōu) 化和篩選； 功能化探針的篩選： 16段功能化磁珠探針序列為：16段功能化納米金顆粒探針序列為：功能化磁珠的篩選過程如下：將所設計的16段特異性核酸探針分別標記磁性微粒，形 成 MMPs-pl，p2，p3，p4，p5，p6，p7，p8，p9，pl0，pll，pl2，pl3，pl4，pl5，pl6，制備PEDV特異性 探針標記的磁性微粒的具體步驟如下所述，將功能化的磁珠與病毒RNA在雜交緩沖液中40 °C孵育30min，磁分離，用PEDV特異性的RT-PCR檢測； 功能化納米金顆粒的篩選過程如下:將所設計的16段特異性核酸探針分別標記納米金 顆粒，形成AuNPs-oligol，oligo2,oligo3,oligo4,oligo5,oligo6,oligo7,oligo8, oligo9,oligol0,oligolloligol2,oligol3,oligol4,oligol5,oligol6,制備PEDV 特異性 探針標記的AuNPs的具體步驟如下所述，將不同探針功能化的納米金顆粒與病毒RNA在雜交 緩沖液中50°C孵育40min，離心沉淀后，用PEDV特異性的RT-PCR檢測； 經(jīng)篩選后確定的功能化磁珠探針序列為Probe 1: 5 'NH2-Ti5GCCTCAGAATAGTATGAGACGGCTTC;(76-101) 經(jīng)篩選后確定的功能化納米金顆粒探針序列為Oligo 2: 5' SH-T15CCTGTAGATAGTAGCAAGTGGCTCAGACCGTGATGGAATGGA；(626-651) S2制備PEDV特異性探針標記的磁性微粒： 特異性探針序列為： 5. NH2-T15GCCTCAGAATAGTATGAGACGGCTTC; S3制備特異性信號探針標記的納米金顆粒： 特異性探針序列為： 5，SH-TisCCTGTAGATAGTAGCAAGTGGCTCAGACCGTGATGGAATGGA; S4PEDV探針標記的磁性微粒和納米金顆粒與糞便樣本中PEDV病毒RNA的雜交反應及目 標DNA標簽的洗脫： S4.1取糞便樣本與PBS緩沖液渦旋混勻，4，OOOg離心10min去除糞便殘渣； S4.2取處理后的PEDV糞便樣本上清500yL和500yL裂解液至1.5mL離心管中，煮沸15min 使病毒RNA釋放，4°C，13400g離心5min，取上清備用，其中，裂解液為：10mmol/L Tris-HCl， lmmol/L EDTA，15mmol/L NaCl，0.5%SDS，pH 8.0; S4.3向步驟S4.2中的糞便樣本裂解液上清中，加入2yL標記后的磁性微粒MMPs-pl和 110yL雜交緩沖液混勻，40°C雜交30min，雜交完畢后加入2yL標記后的納米金顆粒AuNPs-01 igo 2混勻，50°C雜交40min，獲得AuNPs-RNA-MMPs復合物；其中，裂解液上清為上一步 S4.2中獲得的病毒核酸，整個序列不確定，但是具有PEDV病毒的保守序列；雜交緩沖液:20 X SSC，1 % Tween-20和2 % SDS; S4.4每次取lmL TE緩沖液，磁分離洗2-3次，去除殘留的雜交緩沖液，未結(jié)合的探針和 DNA標簽； S4.5用100yL新配置的DTT洗脫液與AuNPs-RNA-MMPs復合物在室溫下作用lOmin，磁分 離3min后取上清液，其中，DTT洗脫液為：0.5mol/L DTT，10mM Tris-HCl，lmM EDTA，pH 7.5; S4.6在洗脫上清液加入1/10體積的NaAc和2倍體積的無水乙醇，沉淀30min; S4.7在4 °C條件下，13400g離心10min，棄上清，加入75 %乙醇洗滌兩次； S4.8在4°C條件下，13400g離心10min，棄上清，自然風干，加入10yL ddH20溶解DNA標簽； S5PCR檢測與PEDV特異結(jié)合的DNA標簽： S5.1以熒光素酶報告基因載體為模板，PCR擴增獲取接頭DNA片段 上游引物F: TGGCATTCCGGTACTGTTGG， 下游引物R: AGGAGAATAGGGTTGGCACC， 采用50μ1 體系：10Xbuffer 5yL，dNTP 4yL，上游引物lyL，下游引物lyL，Taq酶0·5μ1， 模板0.5yL，ddH20 38.0yL; 反應程序如下：94°C預變性4min;94°C變性lmin，54.8°C退火30s，72°C延伸60s，共30個 循環(huán);72°C延伸lOmin; 將以熒光素酶報告基因載體模板PCR擴增獲取的接頭DNA片段切膠回收，并浸泡于TE中 4°C保存； S5.2以接頭DNA片段和洗脫的DNA標簽為模板， 上游引物:GATGCACATATCGAGGTGG， 下游引物:AAGTGTCCACATACGCAC， 采用 25μ 1 體系：10 X buf f er 2 · 5yL，dNTP 2yL，上游引物Ο · 5yL，下游引物Ο · 5yL，Taq酶 0.2yL，模板包括接頭DNA片段14.5ng，純化的DNA標簽10yL，ddH20加至25yL; 反應程序如下:94°C預變性5min;94°C變性lmin，45°C連接2min，72°C延伸50s，共5個循 環(huán);94°C變性40s，57°C退火30s，72°C延伸35s，共30個循環(huán)；72°C延伸lOmin; 取25yL PCR擴增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳并使用凝膠成像儀觀察和記錄結(jié) 果。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測PEDV早期感染的方 法，其特征在于，所述步驟S2中，制備PEDV特異性探針標記的磁性微粒的具體步驟如下： S2.1吸取50μ]^ξ度為10mg/mL的未標記磁珠至離心管，磁分離2min，棄去上清； S2.2向離心管中加入100yL TE緩沖液搖勻，磁分離，吸去上清； S2.3重復操作步驟S2.2-次； 52.4將10(^1^10〇11^1^5、？!14.8的緩沖液加入離心管中，利用磁分離的方法清洗磁珠 兩次，然后用50yL上述MES緩沖液重懸磁珠； S2.5向20yL 1.25M EDC-100mM MES、pH 4.8的溶液中加入 10yL濃度為 100ymol/L的 PEDV特異性探針，再加入20yL H20，使最終體積達到50yL，其中，特異性探針序列為： 5. NH2-T15GCCTCAGAATAGTATGAGACGGCTTC; S2.6將步驟S2.5中的核酸-EDC溶液加入到步驟S2.4的磁珠中，混勻后室溫孵育3h以上 或過夜，磁分離，棄去上清； S2.7將100yL TT緩沖液加入步驟S2.6處理后的磁珠中，搖勻，孵育30min以上，磁分離， 棄去上清，其中，TT緩沖液：1M Tris-HCl，pH 8.0,0.1%Tween-20; S2.8重復操作步驟S2.7兩次； S2.9將磁珠重懸于50yL TE緩沖液中至磁珠終濃度為10mg/mL，于4 °C保存?zhèn)溆谩?. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米金標簽放大技術(shù)快速檢測PEDV早期感染的方 法，其特征在于，所述步驟S3中，制備特異性信號探針標記的納米金顆粒的具體步驟如下： S3.1取10nmol/L，直徑15nm的納米金溶液1.0mL，7500g離心50min，去上清液，用100yL 無菌去離子水重懸； S3.2加入3μL濃度為100μmOl/L特異性探針，特異性信號探針終濃度為3μmOl/L，室溫孵 育16h,其中，特異性探針序列為： 5，SH-TisCCTGTAGATAGTAGCAAGTGGCTCAGACCGTGATGGAATGGA; 33.3分三次加入1111〇1/1他(：1和0.1111〇1/14!17.2的？8，至他(：1和？8的終濃度分別為 0.1mol/L和10mmol/L，充分混勻，室溫孵育48h以上； 33.4用0.01111〇1/1^?1^溶液以750(^離心清洗50111；[11，清洗兩次，去上清液，以10(^1^的 0.01mol/L PBS重懸，4°C儲存?zhèn)溆茫渲?，PBS溶液：135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4， 8mM K2HP〇4，pH 7·2〇
【文檔編號】C12Q1/70GK105861746SQ201610231624
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月14日
【發(fā)明人】童德文, 黃勇, 邢娜, 趙曉民
【申請人】西北農(nóng)林科技大學