曼氏血吸蟲診斷抗原的篩選與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了曼氏血吸蟲診斷抗原的篩選與應(yīng)用。具體的，所述的抗原來自曼氏血吸蟲，且所述的抗原組合包括兩種或兩種以上來自下組的抗原：(a)如SEQ ID NO.:1?17所示的多肽；(b)將SEQ ID NO:1?17氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基取代、缺失或添加而形成的具有免疫原性的衍生多肽；(c)與SEQ ID NO：1?17所示氨基酸序列的同源性≥90％的、具有免疫原性的多肽；或(d)具有免疫原性的多肽(a)－(c)的片段；其中，所述抗原組合中的抗原針對的抗體不相同。曼氏血吸蟲病血清學(xué)檢測表明，用這些陽性抗原檢測曼氏血吸蟲具有高敏感性和特異性。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的診斷和監(jiān)測曼氏血吸蟲病的方法和試劑盒。
【專利說明】
曼氏血吸蟲診斷抗原的篩選與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明公開了一系列來自于曼氏血吸蟲的具 有特異性診斷作用的抗原組合及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 曼氏血吸蟲是流行程度最廣的血吸蟲病，全球有54個(gè)國家有曼氏血吸蟲流行，包 括了非洲、南美洲以及中亞等廣大地區(qū)，感染人數(shù)超過了 8千萬。與日本血吸蟲相比，曼氏 血吸蟲自然終宿主主要是人等靈長類動(dòng)物，而日本血吸蟲自然終宿主除了人以外，還包括 牛、豬等家畜以及鼠類等四十余種動(dòng)物。此外，曼氏血吸蟲的中間宿主為水生性的雙臍螺， 日本血吸蟲的中間宿主為水陸兩棲性釘螺。日本血吸蟲和曼氏血吸蟲差異還表現(xiàn)在病人病 情上，前者病情較重，后者較輕。最新的基因組研究表明，盡管曼氏血吸蟲和日本血吸蟲基 因具有同源性，但同源性并不高，因此同一基因在不同血吸蟲中的免疫原性可能是不同的。
[0003] 高效低廉且方便的血吸蟲病診斷技術(shù)的缺乏是導(dǎo)致血吸蟲病防治困難的主要 因素之一。精確的診斷技術(shù)不僅可以用于患者確診，還可用于劃分流行區(qū)等級(jí)、評估 流行態(tài)勢和考核防控效果等。目前血吸蟲病診斷方法主要有三種，一是病原學(xué)檢測方 法，二是免疫學(xué)檢測方法，第三種是分子生物學(xué)檢測方法。病原學(xué)檢測方法主要包括蟲 卵檢測法（Kato-Katz Technique)和毛蝴孵化法（Hatching Test);免疫學(xué)檢測方法 主要有間接紅血球凝集試驗(yàn)（Indirect Hemagglutination Assay, IHA)、酶聯(lián)免疫吸 附試驗(yàn)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、環(huán)卵沉淀試驗(yàn)（Circum Oval Precipitating Test，C0PT)以及斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn)（Dotimmunogoldfiltration Assay, DIGFA);分子生物學(xué)方法是通過血吸蟲特異的核酸擴(kuò)增技術(shù)來進(jìn)行診斷。以上方法各有優(yōu) 缺點(diǎn)。病原學(xué)檢測結(jié)果目前仍然是血吸蟲病確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但是病原學(xué)檢測敏感度低，且費(fèi) 時(shí)費(fèi)力，同時(shí)還有污染環(huán)境的危險(xiǎn)。免疫學(xué)方法中的C0PT和IHA特異性高，但敏感性低， 未能廣泛使用。分子生物學(xué)方法檢測敏感性高，但易出現(xiàn)假陽性，同時(shí)該方法對實(shí)驗(yàn)條件 要求較高，目前僅停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段。相比而言，ELISA技術(shù)具有操作簡單、敏感度高、 易標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，并且廣泛應(yīng)用在多種疾病診斷中，因此是血吸蟲病診斷優(yōu)先發(fā)展的方向。 ELISA技術(shù)的關(guān)鍵是抗原的選擇。目前市場上血吸蟲抗體診斷ELISA使用的抗原是蟲卵可 溶性抗原（SEA)，但SEA是粗抗原，成分復(fù)雜，使得SEA-ELISA的特異性較差，容易出現(xiàn)交叉 反應(yīng)，無法區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染。此外，SEA通常要從動(dòng)物肝臟中的蟲卵提取，生產(chǎn)條 件難以控制，這導(dǎo)致SEA成本較高，批次間不穩(wěn)定。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組蛋白具有 產(chǎn)量高、價(jià)格低、ELISA交叉反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，是替代SEA的潛在新型抗原，但重組蛋白ELISA 的關(guān)鍵在于高敏感性、高特異性抗原分子的篩選。
[0004] 為了篩選新的診療靶點(diǎn)，1994年，世界衛(wèi)生組織（WHO)啟動(dòng)了血吸蟲基因組計(jì) 劃。近幾年來，血吸蟲組學(xué)研究取得了巨大進(jìn)展，曼氏血吸蟲和日本血吸蟲的基因組草圖 已經(jīng)繪制完成，注釋了超過一萬條基因。同時(shí)EST數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫也已建立。這 些重要的數(shù)據(jù)庫不僅可以用于在分子水平研究血吸蟲的生長發(fā)育機(jī)制，探討血吸蟲-宿主 相互作用機(jī)理，更重要的是可以服務(wù)于血吸蟲病防治新方法的研究，篩選新型診斷分子、候 選疫苗分子和藥物新靶點(diǎn)等。在大量血吸蟲基因和蛋白得到鑒定后，人們已經(jīng)不能滿足 于在單個(gè)基因水平上研究基因的生物學(xué)功能，血吸蟲研究已經(jīng)進(jìn)入了"組學(xué)"時(shí)代。但是， 目前還沒有辦法能直接從血吸蟲基因組、蛋白質(zhì)組或轉(zhuǎn)錄組中明確哪些分子是我們所需 要的靶標(biāo)。因此迫切需要一些新的技術(shù)能將組學(xué)數(shù)據(jù)與具體的研究領(lǐng)域結(jié)合。免疫組學(xué) (immunomics)就是銜接免疫學(xué)和基因組學(xué)的交叉學(xué)科。它利用免疫學(xué)的技術(shù)手段從基因 組、蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組中篩選出與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的一組分子，我們把這組分子稱 為免疫組（immunome)。免疫組中的分子具有用于疾病免疫學(xué)診斷巨大潛在價(jià)值，因此免疫 組學(xué)研究是血吸蟲后基因組時(shí)代研究的重要內(nèi)容，其成果必將會(huì)直接指導(dǎo)血吸蟲疾病診斷 研發(fā)。龐大浩瀚的血吸蟲基因組數(shù)據(jù)，為我們?nèi)嫔钊氲匮芯垦x提供了強(qiáng)大的信息平 臺(tái)。如何從基因組中篩選出可用于血吸蟲病尤其是曼氏血吸蟲診斷和防治的新靶標(biāo)，已成 為當(dāng)前血吸蟲研究人員迫切需要解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一類用于曼氏血吸蟲的陽性抗原的組合及其用途。
[0006] 本發(fā)明第一方面，提供了一種曼氏血吸蟲抗原組合，所述的抗原組合包括兩種或 兩種以上來自下組的抗原：
[0007] (a)如 SEQ ID N0. : 1-17 所示的多肽；
[0008] (b)將SEQ ID N0:1-17氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基取代、缺失或添加 而形成的具有免疫原性的衍生多肽；
[0009] (C)與SEQ ID NO :1-17所示氨基酸序列的同源性> 90%的、具有免疫原性的多 肽；或
[0010] ⑷具有免疫原性的多肽（a) - (c)的片段；
[0011] 其中，所述抗原組合中的抗原針對的抗體不相同。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗原組合含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17 種選自 SEQ ID NO. :1-17 的多肽。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗原組合中至少含有兩種或兩種以上選自SEQ ID NO. :1、3、6、8、10、12、13、15、或17所示的多肽。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗原組合至少含有兩種或兩種以上選自SEQ ID N0. : 1、 8、14、15、或17所示的多肽。
[0015] 本發(fā)明第二方面，提供了一種分離的多核苷酸組合，所述的多核苷酸組合中的多 核苷酸分別編碼本發(fā)明第一方面所述抗原組合中的抗原。
[0016] 本發(fā)明第三方面，提供了一種載體，所述載體含有本發(fā)明第二方面所述的多核苷 酸組合。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體還可以含有SEQ ID NO. :1-17中任一所述的抗原。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合包括兩種或多種所述的多核苷酸。
[0019] 本發(fā)明第四方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有本發(fā) 明第三方面所述的載體或染色體整合有本發(fā)明第二方面所述多核苷酸組合中的多核苷酸。
[0020] 本發(fā)明第五方面，提供了一種制備曼氏血吸蟲抗原組合的方法，所述方法包括步 驟：
[0021] (a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞；
[0022] (b)從培養(yǎng)物中分離出曼氏血吸蟲陽性蛋白抗原。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括將（b)中獲得的抗原進(jìn)行混合，從而制備成 曼氏血吸蟲抗原組合。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗原組合可以是混合物，或是含有多個(gè)獨(dú)立抗原的組合 形式。
[0025] 本發(fā)明第六方面，提供了曼氏血吸蟲抗原或本發(fā)明第一方面所述抗原組合的用 途，用于制備診斷曼氏血吸蟲的試劑或試劑盒，其中，所述的曼氏血吸蟲抗原包括一種或多 種選自SEQ ID NO. :1-17所述的多肽。
[0026] 本發(fā)明第七方面，提供了一種檢測曼氏血吸蟲的試劑盒，所述的試劑盒包括：容器 或載體；以及位于所述容器內(nèi)或載體上的如本發(fā)明第一方面所述的抗原組合構(gòu)成的檢測試 劑。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括酶結(jié)合液、反應(yīng)底物和任選的說明書，較佳 地，所述的試劑盒還可包括選自下組的組分：反應(yīng)終止液、樣本稀釋液、和洗滌液。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括固相載體以及包被于所述固相載體上的SEQ ID NO. : 1-17任一所述抗原或其組合，優(yōu)選地，為本發(fā)明第一方面所述的抗原組合。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒或試劑用于檢測待測樣本是否感染曼氏血吸蟲。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述待測樣本來自曼氏血吸蟲病流行區(qū)人群。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述待測樣本來自?；蚱渌溉閯?dòng)物，例如，人。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明還提供了一種抗體，所述的抗體能分別和一種或多種選 自SEQ ID NO. :1-17所述的多肽特異性結(jié)合。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗體分別能與SEQ ID N0. :1、3、6、8、10、12、13、15、或17 所示的多肽特異性結(jié)合。
[0034] 本發(fā)明第八方面，提供了一種抗原-抗體復(fù)合物，所述的復(fù)合物包括：
[0035] (i) 一種或多種選自SEQ ID NO. :1-17的多肽；
[0036] (ii)與（ii)中的多肽特異性結(jié)合的抗體。
[0037] 本發(fā)明第九方面，提供了一種所述抗原-抗體復(fù)合物的用途，所述復(fù)合物用于：
[0038] (a)制備檢測曼氏血吸蟲的試劑或試劑盒；和
[0039] (b)用作檢測曼氏血吸蟲的陽性對照。
[0040] 本發(fā)明第十方面，提供了一種診斷性或非診斷性檢測樣本中是否感染曼氏血吸蟲 的方法，包括步驟：
[0041] (1)制備SEQ ID N0. : 1-17中任一所示的曼氏血吸蟲抗原或其抗原組合；
[0042] (2)將步驟（1)得到的抗原或其抗原組合與待檢測的樣本接觸；
[0043] (3)檢測樣本中是否含有本發(fā)明第九方面所述的抗原-抗體復(fù)合物；
[0044] 其中，若步驟（3)中的樣本出現(xiàn)所述的抗原-抗體復(fù)合物，則表明所述的樣本感染 了曼氏血吸蟲。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述陽性抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO :1-17所示。
[0046] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地在曼氏血吸蟲中篩選到17個(gè)能被 曼氏血吸蟲病人血清識(shí)別的陽性抗原，其中5-10個(gè)屬于強(qiáng)陽性抗原。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，這些 抗原對檢測曼氏血吸蟲具有高敏感性和特異性?；诒景l(fā)明，可用于制備診斷和檢測曼氏 血吸蟲病的試劑或試劑盒。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0048] 血吸蟲及其組學(xué)研究
[0049] 血吸蟲嚴(yán)重危害人類及其他哺乳動(dòng)物的健康，其中曼氏血吸蟲是六種感染人的血 吸蟲中，流行范圍最廣、感染和受威脅人數(shù)最多、傷殘調(diào)整生命年負(fù)擔(dān)最重的寄生蟲。目前 在全世界 54個(gè)國家流行。急性血吸蟲病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，對于曼氏血吸蟲的治療也因 受地域和人群的不同而不能取得良好的防治效果。
[0050] 為了篩選新的診斷和治療靶點(diǎn)，1994年世界衛(wèi)生組織（WHO)啟動(dòng)了血吸蟲基因組 計(jì)劃，并且在近幾年，曼氏血吸蟲研究取得了巨大進(jìn)展，曼氏血吸蟲的基因組草圖已經(jīng)繪制 完成，并注釋了超過一萬條基因，同時(shí)EST數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫也已建立。這些重要的 數(shù)據(jù)庫不僅可以用于在分子水平研究曼氏血吸蟲的生長發(fā)育機(jī)制，探討曼氏血吸蟲-宿主 相互作用機(jī)理，更重要的是可以服務(wù)于血吸蟲病防治新方法的研究、篩選新型診斷分子、候 選疫苗分子和藥物新靶點(diǎn)等。但是，目前還沒有辦法能直接從曼氏血吸蟲基因組、蛋白質(zhì)組 或轉(zhuǎn)錄組中明確哪些分子是我們所需要的靶標(biāo)。因此迫切需要一些新的技術(shù)能將組學(xué)數(shù)據(jù) 與具體的研究領(lǐng)域結(jié)合。免疫組學(xué)（immunomics)就是銜接免疫學(xué)和基因組學(xué)的交叉學(xué)科， 它利用免疫學(xué)的技術(shù)手段從基因組、蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組中篩選出與宿主免疫系統(tǒng)相互作用 的一組分子，即免疫組（immunome)。免疫組中的分子具有用于疾病免疫學(xué)診斷巨大潛在價(jià) 值，是曼氏血吸蟲后基因組時(shí)代研究的重要內(nèi)容。如何從免疫組中篩選出可用于曼氏血吸 蟲病診斷和防治的新靶標(biāo)，已成為本領(lǐng)域研究人員迫切需要解決的問題。
[0051] 曼氏血吸蟲
[0052] 曼氏血吸蟲是六種感染人的血吸蟲中，流行范圍最廣、感染和受威脅人數(shù)最多、傷 殘調(diào)整生命年負(fù)擔(dān)最重的寄生蟲。主要流行于非洲（包括埃及、蘇丹、埃塞俄比亞、肯尼亞、 坦桑尼亞、莫桑比克、津巴布韋、贊比亞、剛果等），南美洲（巴西、圭亞那、多米尼加、加勒比 海等國），亞洲（阿拉伯半島）。曼氏血吸蟲通常在衛(wèi)生條件惡劣的發(fā)展中國家和貧困國家 流行，含有蟲卵的人糞是主要的傳染源。易感人群以漁民、農(nóng)民、小孩為主。流行區(qū)居民因 反復(fù)感染有部分免疫力。非流行區(qū)居民初次感染者可引起急性曼氏血吸蟲病。
[0053] 陽性抗原
[0054] 在本發(fā)明中，術(shù)語"抗原"或"陽性抗原"可互換使用，都指能夠與曼氏血吸蟲抗體 特異結(jié)合的蛋白或多肽?？乖侵改軌虼碳C(jī)體產(chǎn)生（特異性）免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng) 答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細(xì)胞在體外結(jié)合，發(fā)生免疫效應(yīng)（特異性反應(yīng)）的物質(zhì)?？乖幕?本特性有兩種，一是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物發(fā)生反 應(yīng)，也就是抗原性。
[0055] 如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來（如果是天然的物質(zhì)，原 始環(huán)境即是天然環(huán)境）。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和蛋白是沒有分離純化 的，但同樣的多聚核苷酸或蛋白如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化 的。"分離的陽性抗原"是指所述抗原基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其 它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化陽性抗原?；旧霞兊牡鞍卓?原在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。抗原的純度能用氨基酸序列分析。
[0056] 本發(fā)明的抗原可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從 原核或真核宿主（例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞）中產(chǎn)生。根據(jù)重組生 產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的抗原可以是糖基化的和非糖基化的。本發(fā)明的抗原還可包括 或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
[0057] 本發(fā)明還包括抗原的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語"片段"、"衍生物" 和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明的天然抗原相同的生物學(xué)功能或活性的抗原。本發(fā)明 的抗原片段、衍生物或類似物可以是（i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基（優(yōu)選 保守性氨基酸殘基）被取代的抗原，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳 密碼編碼的，或（ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的抗原，或（iii)抗原與另 一個(gè)化合物（比如延長抗原半衰期的化合物，例如聚乙二醇）融合所形成的抗原，或（iv) 附加的氨基酸序列融合到此抗原序列而形成。這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練 技術(shù)人員公知的范圍。
[0058] 在本發(fā)明中，術(shù)語"抗原"還包括具有相同功能的變異形式。這些變異形式包括 (但并不限于）：一個(gè)或多個(gè)（通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10 個(gè)）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)（通常為 20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi)）氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相 近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末 端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。
[0059] 修飾（通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu)）形式包括：體內(nèi)或體外的抗原的化學(xué)衍生形式如乙 ?；?、羧基化、糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨 酸，磷酸蘇氨酸）的序列。
[0060] 抗原組合
[0061] 術(shù)語"抗原組合"指的是將本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的曼氏血吸蟲陽性抗原為了診斷或?qū)φ漳?的，進(jìn)行所需要的形式組合。例如，將兩種或兩種以上選自SEQ ID NO. :1-17所述多肽或其 衍生多肽的抗原進(jìn)行組合，可以提高曼氏血吸蟲的診斷特異性和陽性診斷率。
[0062] 通常，可以選擇多種陽性抗原進(jìn)行組合，以提高確診率，當(dāng)然，也可以挑選少數(shù)個(gè) 強(qiáng)陽性抗原進(jìn)行組合，以最經(jīng)濟(jì)的選擇進(jìn)行大范圍的篩查。
[0063] 為了制備本發(fā)明的抗原組合，可采取常規(guī)的基因工程的方法，例如在載體中引入 一個(gè)或數(shù)個(gè)本發(fā)明抗原的編碼序列，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞，或在載體中僅引入一個(gè)本發(fā)明抗原 的編碼序列，并構(gòu)成載體的組合后共同導(dǎo)入宿主細(xì)胞，這些方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 知。
[0064] 抗原編碼序列
[0065] 編碼本發(fā)明抗原的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基 因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼 鏈。術(shù)語"編碼本發(fā)明抗原的多核苷酸"可以是包括編碼此抗原的多核苷酸，也可以是還包 括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
[0066] 本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的 等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插 入變異體。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50%，較佳地至少 70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多 核苷酸可雜交的多核苷酸。
[0067] 本發(fā)明的核苷酸序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法 獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來 設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為 模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序 列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離 得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通 常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段?？梢酝耆ㄟ^化學(xué)合 成來得到編碼本發(fā)明抗原（或其片段，或其衍生物）的DNA序列。然后可將該DNA序列引 入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子（或如載體）和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成 將突變引入本發(fā)明抗原序列中。
[0068]應(yīng)用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增 DNA/RNA 的方法（Saiki, et al. Sciencel985 ;230 :1350-1354) 被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適 當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。
[0069] 抗原制備方法
[0070] 本發(fā)明抗原的制備方法有以下步驟：
[0071] (1).用編碼本發(fā)明陽性抗原的多核苷酸（或變異體），或用含有該多核苷酸的重 組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
[0072] (2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
[0073] (3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化本發(fā)明抗原。
[0074] 本發(fā)明中，多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方 法能用于構(gòu)建含抗原編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。包含上述適 當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其 能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0075] 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì) 菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、C0S、293細(xì)胞、或 Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常 規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期 后收獲，用CaCl 2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果 需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷 酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0076] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明抗原蛋白。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞， 培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng) 宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)）誘導(dǎo)選擇的 啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0077] 抗原蛋白可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其 物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化抗原蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技 術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理 (鹽析方法）、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析（凝膠過濾）、吸附層析、離子交 換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
[0078] 抗原篩選方法
[0079] 本發(fā)明基于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)融合蛋白表達(dá)的方法進(jìn)行高通量蛋白抗 原篩選，包括步驟：（1)利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測曼氏血吸蟲表達(dá)序列標(biāo)簽（EST)數(shù)據(jù)庫 中含有信號(hào)肽的蛋白，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，數(shù)據(jù)庫優(yōu)選NCBI的蛋白質(zhì)序列，預(yù)測軟 SiRnalP3. 0 (http://www. cbs. dtu. dk/services/SiRnalP/) ; (2)擴(kuò)增各信號(hào)膚蛋 白對應(yīng)的目的基因，將目的基因克隆至表達(dá)載體，較佳地表達(dá)載體為GST表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌后誘導(dǎo)菌體表達(dá)抗體-GST融合蛋白；（3)將融合蛋白置于螯合了 GSH的多孔板的孔 中，捕獲GST融合蛋白；(4)將含有曼氏血吸蟲抗體的血清置于多孔板的中，進(jìn)行抗原抗體 檢測，篩選形成特異性抗原-抗體復(fù)合物的孔，所對應(yīng)的候選蛋白即為曼氏血吸蟲陽性抗 原。在另一優(yōu)選例中，可以同時(shí)將5-100種（較佳地10-80種）GST融合蛋白置于多孔板的 孔中，從而實(shí)現(xiàn)高通量篩選。
[0080] 試劑盒
[0081] 本發(fā)明還提供了一種檢測曼氏血吸蟲的試劑盒。一般地，本發(fā)明的試劑盒包括以 下組分：容器或載體；以及位于所述容器內(nèi)或載體上的本發(fā)明第一方面所述的陽性抗原。 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括酶結(jié)合液、反應(yīng)底物和任選的說明書。較佳地，所述的 試劑盒還可包括選自下組的組分：反應(yīng)終止液、樣本稀釋液、和洗滌液。一種優(yōu)選的可用于 檢測曼氏血吸蟲的試劑盒包括：容器以及位于容器內(nèi)的包被液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠 抗人IgG(H+L)抗體、底物液TMB、稀濃硫酸反應(yīng)終止液和樣本稀釋液。更佳地，還含有空白 對照、陽性和陰性對照和作以監(jiān)控檢測過程是否符合標(biāo)準(zhǔn)。
[0082] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0083] 1.抗原靈敏度高，不受檢測樣本感染度的影響，在EPG < 10的情況下依然能夠檢 出，敏感度較高。
[0084] 2.高特異性，本發(fā)明的抗原檢測待測樣本，其假陽率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于市售的SEA法。
[0085] 3.操作簡便，抗原可以使用通用的ELISA法讀取熒光強(qiáng)度值。
[0086] 4.結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性高。
[0087] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室指南（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和分?jǐn)?shù)按 重量計(jì)算。
[0088] 實(shí)施例1曼氏血吸蟲重要抗原的篩選
[0089] 1.預(yù)測曼氏血吸蟲的分泌蛋白：從NCBI下載曼氏血吸蟲EST數(shù)據(jù)庫，以及對應(yīng)的 蛋白質(zhì)序列；將蛋白質(zhì)序列導(dǎo)入信號(hào)肽在線預(yù)測軟件SignalP3. 0(http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)進(jìn)行預(yù)測；根據(jù)預(yù)測結(jié)果，按照p值大于0. 1，選定預(yù)測為信號(hào)肽蛋 白的序列。
[0090] 2.基因克?。撼樘嵫x的總RNA ;通過RT-PCR擴(kuò)增目的基因，回收目的片段，酶 切，將目的片段克隆到市售的表達(dá)載體PGEX-4T-1 ;轉(zhuǎn)化市售大腸桿菌ToplO,陽性克隆經(jīng) 測序確認(rèn)序列正確。
[0091] 3.重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)：抽提質(zhì)粒，將pGEX-4T-l重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化市售的大腸桿菌 B121 ;挑取單克隆，接種96孔細(xì)菌深孔培養(yǎng)板，37°C，250rpm培養(yǎng)過夜后按1 %比例接種96 孔細(xì)菌深孔培養(yǎng)板，每孔含有l(wèi)ml2XYT (含100μ g/ml Amp)液體培養(yǎng)基，37°C 250rpm培養(yǎng) 約三小時(shí)，至0D6。。= 0. 4-1.0 ;加入IPTG至終濃度lmmol/L，37°C，250rpm誘導(dǎo)目的蛋白表 達(dá)；誘導(dǎo)表達(dá)6h，停止培養(yǎng)；收集菌體，-80°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0092] 4.包涵體的溶解：反復(fù)凍融菌體2次；加入300 μ 1 B_PER(另加入DNase、RNase、 PMSF)裂解菌體，吹打混勻，轉(zhuǎn)至EP管中；13, OOOrpm室溫離心5min ;移出上清至新的Ep管 中，冷凍保存?zhèn)溆?，沉淀即為包涵體；用含1% Triton-XlOO的PBS作為洗滌液，洗滌包涵體 并混勻，13, OOOrpm室溫離心，5min，棄上清；重復(fù)洗滌步驟，再一次離心棄上清；用包涵體 溶解液溶解包涵體，lml誘導(dǎo)菌液大約能得到0. lg包涵體沉淀，加入lml溶解液，吹打混勻， 室溫?fù)u過夜，充分溶解包涵體。
[0093] 5.包涵體復(fù)性：將溶解后的溶液以13, OOOrpm室溫離心5min，取上清；在96孔深 孔培養(yǎng)板中，每孔加入50 μ 1變性所得溶液和lml復(fù)性液；混勻，室溫?fù)u過夜；離心收集上 清。
[0094] 6.血清吸附：將pGEX-4T-l質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌B121 (DE3)，按照前面的表達(dá)方法制 備GST表達(dá)菌液以及B121菌液各100ml，離心收集菌體，用10ml PBS重懸，超聲破碎后收集 上清備用；將lml柱體積GSH填料、3ml GST表達(dá)上清和9ml PBS混合，室溫混lh，lOOOrpm 離心收集沉淀，再用l〇ml PBS洗滌五次，此時(shí)填料上結(jié)合了 GST蛋白；用10ml PBS重懸 GST/填料，分裝1. 9ml每管；加100 μ 1病人血清到分裝管中，室溫混勻5h，此步驟是吸附血 清中抗GST的抗體；lOOOrpm離心5min，去除填料，收集上清，此時(shí)血清稀釋度是1 :20 ;將 3mlB121 (DE3)裂解上清加入2ml的GST吸附過的血清中，室溫混勻5h，此步驟是吸附抗細(xì) 菌蛋白的抗體，此時(shí)血清稀釋度是1:50 ; 13000rpm離心10min，每管分裝500 μ 1，凍存?zhèn)溆谩?br>[0095] 7.血清陽性克隆的篩選：在GSH-微孔板中，每孔加20 μ 1復(fù)性蛋白液和 80μ 1PBS，4°C過夜孵育；同時(shí)設(shè)GST表達(dá)菌液作為陰性對照，PBS作為空白對照，在篩選到 陽性蛋白后，以此克隆作為陽性對照。
[0096] ?831'郵3+吐溫）洗滌五次；20(^15%奶粉/^31'，室溫封閉211刊31'洗滌五次； 吸附過的血清按照1:20用5%奶粉稀釋，最終血清的稀釋度是1:1000 ; 100 μ 1/孔，37°C結(jié) 合lh ;PBST洗滌五次；按照1:20, 000,稀釋HRP酶標(biāo)記的鼠抗人IgG (H+L)抗體，100 μ 1/ 孔，37°C結(jié)合lh ;PBST洗滌5次；加100 μ 1市售商品Super Signal ELISA Femto進(jìn)行檢 測，在425nm處讀取熒光強(qiáng)度值；計(jì)算樣本和陰性對照熒光強(qiáng)度的比值R，根據(jù)R大小判斷 是否為陽性蛋白，若R > 2,則判定為陽性，R的計(jì)算公式如下：
[0097]
[0098] 結(jié)果篩選到SEQ ID NO :1-17所示的抗原。
[0099] 實(shí)施例2強(qiáng)陽性克隆診斷敏感性的比較
[0100] 選強(qiáng)陽性抗原，分別吸附到GSH-微孔板上，同時(shí)設(shè)GST(谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶） 表達(dá)菌液作為陰性對照，PBS作為空白對照；PBST洗滌五次；200 μ 15%奶粉/PBST，室溫封 閉2h ;PBST洗滌五次；吸附過的血清按照1 :20用5%奶粉稀釋，最終血清的稀釋度是1 : 1000 ;100μ 1/孔，37°C結(jié)合lh ;PBST洗滌五次；按照1 :20,000,稀釋HRP酶標(biāo)記的鼠抗人 IgG(H+L)抗體，100μ 1/孔，37°C結(jié)合 lh ;PBST 洗滌 5 次；加 100μ 1 市售商品 Super Signal ELISA Femto進(jìn)行檢測，在425nm處讀取熒光強(qiáng)度值；計(jì)算R值。并與樣本每克肝卵數(shù)目 (EPG)比較，檢測抗原的敏感性。
[0101] 結(jié)果可見，本發(fā)明陽性抗原均具有一定的敏感性。
[0102] 實(shí)施例3強(qiáng)陽性抗原的表達(dá)和純化
[0103] 1. pET28 (a)表達(dá)載體的構(gòu)建：從重組pGEX-4T-l上酶切下強(qiáng)陽性抗原基因，將其 連接到PET28 (a)載體上，通過Kan+平板篩選陽性克隆。
[0104] 2.強(qiáng)陽性抗原蛋白的表達(dá)：將重組pET28 (a)載體轉(zhuǎn)化B121 (DE3)表達(dá)菌株，挑取 陽性克隆制備種子液，按照1%接種到三角燒瓶中，37°C 250rpm搖瓶培養(yǎng)3h ;加 IPTG誘導(dǎo) 表達(dá)，IPTG終濃度為ImM，繼續(xù)37°C 250rpm培養(yǎng)5h。
[0105] 3.細(xì)菌細(xì)胞裂解：收集細(xì)菌，將細(xì)菌凍融兩次；將凍融兩次后的細(xì)菌用10ml細(xì)菌 蛋白提取試劑B_PER(另加入DNase、RNase、PMSF等）裂解菌體，轉(zhuǎn)移到燒杯中，緩慢攪拌 30min，超聲處理10min。
[0106] 4.包涵體的處理：洗滌包涵體：15000rpm離心10min，收集沉淀；將沉淀用100ml 包涵體洗滌液重懸：先打散沉淀，轉(zhuǎn)移到燒杯中，然后超聲l_2min，徹底沖散沉淀，緩慢攪 拌 30min (洗滌液配方：0· 5M 尿素，0· 1M NaH2P04,0. 01MTris-HCl，0. 5% Triton-X100，pH = 8· 0) 〇
[0107] 溶解包涵體：將沉淀用100ml包涵體溶解液溶解：超聲l-2min，徹底沖散沉淀，緩 慢攪拌30min ; 15000rpm離心10min，收集上清（溶解液配方：8M尿素 ，(λ 1M NaH2P04, (λ 01M Tris-HCl，pH = 8· 0)。
[0108] 5. Ni柱純化：Ni柱用溶解液平衡；按照1ml柱體積對應(yīng)10ml蛋白液，將二者混合， 200rpm，室溫孵育30min ;將混合液上柱，收集柱后液體；用10倍柱體積洗滌液洗滌，收集洗 滌液（Ni 柱洗滌液配方：8M 尿素，0. 1M NaH2P04,0. 01M Tris-HCl，10mM 咪唑，pH = 8. 0);用 10倍柱體積洗脫液洗脫：收集洗脫液，lml/管（Ni柱洗脫液配方：8M尿素，0. 1M NaH2P04， 0. 01M Tris-HCl，500mM咪唑，pH = 8. 0) ;SDS-PAGE檢測每個(gè)收集管中的蛋白純度。
[0109] 6.蛋白復(fù)性：將純化的蛋白溶液按照體積比1:10,在復(fù)性液中透析復(fù)性，4°C，每 隔5小時(shí)換新鮮的復(fù)性液，換3次；將經(jīng)過復(fù)性的蛋白按照體積比1:10,在含10%甘油的 PBS中透析，4°C，每隔5小時(shí)換新鮮的透析液，換3次；SDS-PAGE檢測；濃縮管濃縮蛋白溶液 至lml左右，測定蛋白濃度。
[0110] 由此可獲得高純度的重組強(qiáng)陽性抗原蛋白。
[0111] 實(shí)施例4制備曼氏血吸蟲病酶聯(lián)免疫診斷試劑盒
[0112] 1.包被抗原的固相載體：將蛋白抗原包被在聚苯乙烯反應(yīng)孔中，包被液配方： 1. 5g Na2C03和NaHC03溶解在1000ml蒸餾水中。
[0113] 2.制備酶結(jié)合液采用HRP酶標(biāo)記的鼠抗人IgG(H+L)抗體（Promega)。
[0114] 3.制備酶的底物液：TMB A液（每ml0.005 %醋酸鈉-檸檬酸緩沖液中含有 3. 2 μ 11. 5% H202,4°C避光保存）；TMB B 液（TMB0.0 8g，加入 40ml DMS0 溶解后，加 60ml 甲 醇，混勻后加100ml0. 005%醋酸鈉-檸檬酸緩沖液，避光振蕩1小時(shí)，室溫放置3小時(shí)，4°C 避光保存）；用前，A液和B液等體積混合。
[0115] 4.制備酶反應(yīng)終止液：于600ml ddH20中緩慢滴加100ml濃硫酸，不斷攪拌，定容 至 900ml。
[0116] 5.制備樣本稀釋液：5%奶粉/PBST。
[0117] 6.制備洗滌液：PBST。
[0118] 實(shí)施例5檢測方法及操作程序
[0119] 1.樣本稀釋：用樣本稀釋液按照1 :100稀釋待檢血清。
[0120] 2.加樣反應(yīng)：樣本檢測孔每孔加100 μ 1稀釋后的血清樣本，每個(gè)樣本平行檢測2 個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)陽性、陰性和空白對照個(gè)2復(fù)孔，取陽性和陰性對照品各100 μ 1加入孔內(nèi)， 空白對照僅加樣本稀釋液。37 °C，避光孵育60分鐘。
[0121] 3.洗滌：甩干孔內(nèi)液體，每孔用洗滌液注滿，靜置2分鐘，甩干，重復(fù)洗滌4次，最 后一次拍干。
[0122] 4.加酶：每孔加100 μ 1辣根過氧化物酶（HRP酶）標(biāo)記的鼠抗人IgG(H+L)抗體， 37°C避光孵育1小時(shí)，如上洗滌，拍干。
[0123] 5.顯色：每孔加100 μ 1酶底物顯色液，37°C避光孵育10分鐘；加終止液50 μ 1，立 即用酶標(biāo)儀檢測。
[0124] 6.讀數(shù)及數(shù)據(jù)處理：用空白對照調(diào)零，于波長450nm處讀取0D值；待測孔0D值大 于或等于陰性對照2. 1倍者為陽性，當(dāng)陰性對照0D值低于0. 05時(shí)按0. 05計(jì)算。
[0125] 實(shí)施例6試劑盒特異性
[0126] 收集正常人，評價(jià)在正常人群中本試劑盒（陽性抗原-ELISA)的假陽性率，并與常 用的市售試劑盒SEA-ELISA進(jìn)行比較。正常人群中SEA-ELISA和陽性抗原-ELISA假陽性 率比較結(jié)果顯示，陽性抗原-ELISA比SEA-ELISA具有更好的特異性。
[0127] 實(shí)施例7試劑盒敏感性
[0128] 樣品采集：收集確診曼氏血吸蟲的患者血清，并評價(jià)市售試劑盒SEA-ELISA和陽 性抗原-ELISA法的敏感性。
[0129] 以往的大量研究表明，SEA-ELISA的敏感度在80-95%左右，本研究結(jié)論與此前研 究結(jié)論基本一致。陽性抗原-ELISA的敏感度與SEA-ELISA相比一致或更佳。此外，由于SEA 是混合抗原，難以做到精確的質(zhì)量控制，因此不同批次間往往會(huì)有一定的誤差，而陽性抗原 蛋白是重組抗原，可以做到精確的質(zhì)量控制，減少批次間的差異。
[0130] 實(shí)施例8抗原組合的特異性和敏感性
[0131] 收集曼氏血吸蟲患者血清和正常人血清，比較單一抗原和不同組合抗原的診斷的 特異性和敏感性。結(jié)果表明，抗原組合的特異性與單一抗原無差異，但敏感性優(yōu)于單一抗 原。
[0132] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種曼氏血吸蟲抗原組合，其特征在于，所述的抗原組合包括兩種或兩種以上來自 下組的抗原： (a) 如SEQ ID NO. : 1-17所示的多肽； (b) 將SEQ ID NO: 1-17氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基取代、缺失或添加而形 成的具有免疫原性的衍生多肽； (c) 與SEQ ID NO :1-17所示氨基酸序列的同源性彡90%的、具有免疫原性的多肽；或 (d) 具有免疫原性的多肽（a) -（c)的片段； 其中，所述抗原組合中的抗原針對的抗體不相同。2. -種分離的多核苷酸組合，其特征在于，所述的多核苷酸組合中的多核苷酸分別編 碼權(quán)利要求1所述抗原組合中的抗原。3. -種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求2所述的多核苷酸組合。4. 一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求3所述的 載體或染色體整合有權(quán)利要求2所述多核苷酸組合中的多核苷酸。5. -種制備曼氏血吸蟲抗原組合的方法，所述方法包括步驟： (a) 在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞； (b) 從培養(yǎng)物中分離出曼氏血吸蟲陽性蛋白抗原。6. 曼氏血吸蟲抗原或權(quán)利要求1所述抗原組合的用途，其特征在于，用于制備診斷 曼氏血吸蟲的試劑或試劑盒,其中，所述的曼氏血吸蟲抗原包括一種或多種選自SEQ ID NO. :1-17所述的多肽。7. -種檢測曼氏血吸蟲的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括：容器或載體；以及 位于所述容器內(nèi)或載體上的如權(quán)利要求1所述的抗原組合構(gòu)成的檢測試劑。8. -種抗原-抗體復(fù)合物，其特征在于，所述的復(fù)合物包括： ⑴一種或多種選自SEQ ID NO. : 1-17的多肽； (ii)與（ii)中的多肽特異性結(jié)合的抗體。9. 權(quán)利要求8所述抗原-抗體復(fù)合物的用途，其特征在于，所述復(fù)合物用于： (a) 制備檢測曼氏血吸蟲的試劑或試劑盒；和 (b) 用作檢測曼氏血吸蟲的陽性對照。10. -種診斷性或非診斷性檢測樣本中是否感染曼氏血吸蟲的方法，包括步驟： (1) 制備SEQ ID NO. :1-17中任一所示的曼氏血吸蟲抗原或其抗原組合； (2) 將步驟（1)得到的抗原或其抗原組合與待檢測的樣本接觸； (3) 檢測樣本中是否含有權(quán)利要求9所示的抗原-抗體復(fù)合物； 其中，若步驟（3)中的樣本出現(xiàn)所述的抗原-抗體復(fù)合物，則表明所述的樣本感染了曼 氏血吸蟲。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK105884878SQ201410199590
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年5月12日
【發(fā)明人】李明, 徐新東, 吳英松
【申請人】廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司