LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽及其用途，其中該抗原多肽的多肽活性片段為下列至少之一：1)SEQ ID NO:1所示序列：SGCARFNDAQSQPFT；2)SEQ ID NO:2所示序列：EPDVVRKDTHAHAWA；3)SEQ ID NO:3所示序列：HAHAWALRMSPDGNV；4)選自SEQ ID NO:1?3所示氨基酸序列的至少兩種的連接產(chǎn)物；5)1)?4)所述的多肽活性片段經(jīng)氨基酸殘基的修飾、取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。利用本發(fā)明的LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽，能夠有效地檢測(cè)樣品，例如結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品(例如血清樣品)中的LppZ抗體水平。
【專利說(shuō)明】
LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽及其用 途。更具體地，本發(fā)明涉及人血清抗體與LppZ蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽、 該抗原多肽在制備檢測(cè)血清中LppZ抗體水平的試劑盒中的用途、用于檢測(cè)樣品中LppZ抗體 水平的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病是全球三大傳染性疾病之一，世界衛(wèi)生組織(WT0)發(fā)布的流行病調(diào)查報(bào)告 顯示，我國(guó)結(jié)核病分支桿菌感染病理占全球總病例數(shù)的12%，僅次于印度，位居全球第二。 結(jié)核病的高發(fā)和流行嚴(yán)重影響了我國(guó)的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。目前臨床上使用的結(jié)核病診斷方 法主要以結(jié)核菌的檢出作為金標(biāo)準(zhǔn)，如痰涂片、痰集菌和痰培養(yǎng)的方法，其診斷方法耗時(shí) 長(zhǎng)，特異性或者敏感性低。
[0003] 基于血清免疫學(xué)的檢測(cè)方法是現(xiàn)階段結(jié)核病診斷的重要輔助手段之一，其中廣泛 使用的抗原特異性r 一干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRA)有商業(yè)試劑盒T-spot. TB和QFT-IT。
[0004] IGRA使用的抗原是結(jié)核分支桿菌RD(region of difference)區(qū)基因編碼的全蛋 白，生產(chǎn)成本高，價(jià)格昂貴，世界衛(wèi)生組織不推薦中低收入國(guó)家作為篩查檢測(cè)手段廣泛使 用。并且也有研究表明，在結(jié)核病高度流行的國(guó)家，IGRA的診斷受到環(huán)境因素干擾特異性降 低，假陽(yáng)性升高，不適用于我國(guó)國(guó)情，需要尋找更好的血清免疫學(xué)診斷標(biāo)志物。
[0005] 因而，目前的結(jié)核病血清免疫學(xué)診斷、檢測(cè)方面的研究仍有待加強(qiáng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0007] 結(jié)核分枝桿菌膜表面脂質(zhì)體蛋白LppZ能引起人體免疫反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)抗體，血清 抗LppZ多克隆抗體的表達(dá)水平能反映出個(gè)體的結(jié)核分枝桿菌感染狀態(tài)。目前利用ELISA等 免疫印跡雜交技術(shù)檢測(cè)血清抗LppZ抗體的方法均需要LppZ純蛋白作為識(shí)別抗原。LppZ屬于 糖蛋白，其序列上有多個(gè)糖基化位點(diǎn)，使得體外表達(dá)的LppZ蛋白穩(wěn)定性較差，且難以復(fù)性至 天然構(gòu)象，影響檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。此外，純化蛋白制備過(guò)程繁瑣，費(fèi)時(shí)耗力，成本較高。
[0008] 本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷至少之一，而提供一種有用的商業(yè)選擇。
[0009] 從而，本發(fā)明利用多肽微陣列的技術(shù)篩選獲得了 LppZ蛋白抗原識(shí)別高頻表位，并 提供了包含血清抗體識(shí)別LppZ蛋白的核心氨基酸序列和保護(hù)氨基酸序列并偶聯(lián)載體蛋白 如KLH等的LPPZ抗體識(shí)別的抗原多肽，基于結(jié)核病患者血清LppZ抗體表達(dá)水平較健康人顯 著升高，利用這些抗原多肽通過(guò)免疫印跡檢測(cè)手段可有效檢測(cè)待測(cè)者血清中的LppZ抗體水 平，進(jìn)而能夠用于結(jié)核病診斷。
[0010]為此，在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽。根據(jù)本 發(fā)明的實(shí)施例，其多肽活性片段為下列至少之一：
[0011] 1)SEQ ID N0:1 所示序列：SGCARFNDAQSQPFT;
[0012] 2)SEQ ID從)：2所示序列4?0"服01'撤撤歡；
[0013] 3)SEQ ID 從)：3所示序列：撤撤歡0?0306·;
[0014] 4)選自SEQ ID NO: 1-3所示氨基酸序列的至少兩種的連接產(chǎn)物；
[0015] 5)1)-4)所述的多肽活性片段經(jīng)氨基酸殘基的修飾、取代、缺失或添加而形成的氨 基酸衍生序列。
[0016] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的上述LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽，通過(guò)免疫印跡 檢測(cè)手段可有效檢測(cè)待測(cè)者血清中的LppZ抗體水平，進(jìn)而基于待測(cè)者血清LppZ抗體表達(dá)水 平是否較健康人顯著升高，能夠有效進(jìn)行結(jié)核病診斷，確定待測(cè)者是否為疑似結(jié)核病患者。 其中，結(jié)核病患者血清LppZ抗體表達(dá)水平較健康人顯著升高。并且，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例， 本發(fā)明的上述抗原多肽LppZ抗體識(shí)別特異性好，LppZ抗體水平檢測(cè)效率高，且制備簡(jiǎn)單，成 本低，易于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，利于大量推廣應(yīng)用。
[0017] 進(jìn)一步，基于利用上述LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)手段可有效 檢測(cè)待測(cè)者血清中的LppZ抗體水平，在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了前面所述的LppZ 抗體識(shí)別的抗原多肽在制備檢測(cè)血清中LppZ抗體水平的試劑盒中的用途。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒用于結(jié)核病診斷。其中，基于結(jié)核病患者血清LppZ 抗體表達(dá)水平較健康人顯著升高，能夠有效對(duì)待測(cè)者進(jìn)行結(jié)核病診斷。
[0019] 在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)樣品中LppZ抗體水平的試劑 盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包括:前面所述的LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽。根據(jù)本發(fā) 明的實(shí)施例，利用該試劑盒能夠有效檢測(cè)樣品中LppZ抗體水平，進(jìn)而基于結(jié)核病患者血清 LppZ抗體表達(dá)水平較健康人顯著升高，能夠有效對(duì)待測(cè)者進(jìn)行結(jié)核病診斷。
[0020] 具體地，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽以下列的至少一種 形式提供：
[0021] 1)96孔板，所述96孔板的孔中包被所述LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽；
[0022] 2)微球，所述微球偶聯(lián)所述LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽。
[0023]進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，該試劑盒進(jìn)一步包括：陽(yáng)性對(duì)照樣品，所述 陽(yáng)性對(duì)照樣品為抗LppZ蛋白的抗體。由此，利用該試劑盒進(jìn)行LppZ抗體水平檢測(cè)和結(jié)核病 診斷時(shí)，結(jié)果更加可靠。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括:標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為多例LppZ抗體表達(dá) 為陽(yáng)性的血清的等體積混合物。由此，利用該試劑盒進(jìn)行LppZ抗體水平檢測(cè)和結(jié)核病診斷 時(shí)結(jié)果更加真實(shí)可靠。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為所述多例LppZ抗體表達(dá)為陽(yáng)性的血 清的等體積混合物的梯度稀釋產(chǎn)物，所述梯度稀釋的比例從1:50起至1:2000止。由此，利用 該試劑盒進(jìn)行LppZ抗體水平檢測(cè)和結(jié)核病診斷時(shí)結(jié)果可靠度高。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽的濃度為lμg/ml。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品為血清。
[0028] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得 明顯和容易理解，其中：
[0030] 圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，多肽芯片1的顯影結(jié)果；
[0031] 圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，多肽芯片2的顯影結(jié)果；以及
[0032]圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，SEQ ID No: 1-3所示多肽獨(dú)立使用及聯(lián)合使用 時(shí)，對(duì)結(jié)核病患者血清和健康人群血清中的LppZ抗體水平的檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為 對(duì)本發(fā)明的限制。
[0034] LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽
[0035]在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽。根據(jù)本發(fā)明 的實(shí)施例，其多肽活性片段為下列至少之一：
[0036] 1)SEQ ID No:l所示序列：SGCARFNDAQSQPFT;
[0037] 2)SEQ ID吣：2所示序列4?0"服01'撤撤歡；
[0038] 3)SEQ ID吣：3所示序列：撤撤歡0?0306·;
[0039] 4)選自SEQ ID No: 1-3所示氨基酸序列的至少兩種的連接產(chǎn)物，
[0040] 5)1)-4)所述的多肽活性片段經(jīng)氨基酸殘基的修飾、取代、缺失或添加而形成的氨 基酸衍生序列。
[0041] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的上述LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽，通過(guò)免疫印跡 檢測(cè)手段可有效檢測(cè)待測(cè)者血清中的LppZ抗體水平，進(jìn)而基于待測(cè)者血清LppZ抗體表達(dá)水 平是否較健康人顯著升高，能夠有效進(jìn)行結(jié)核病診斷，確定待測(cè)者是否為疑似結(jié)核病患者。 其中，結(jié)核病患者血清LppZ抗體表達(dá)水平較健康人顯著升高。并且，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例， 本發(fā)明的上述抗原多肽LppZ抗體識(shí)別特異性好，LppZ抗體水平檢測(cè)效率高，且制備簡(jiǎn)單，成 本低，易于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，利于大量推廣應(yīng)用。
[0042]需要說(shuō)明的是，上述多肽均來(lái)自于LppZ蛋白的全長(zhǎng)序列（例如來(lái)源于蛋白質(zhì)公共 資源數(shù)據(jù)庫(kù)uni-prot)所對(duì)應(yīng)的位置。另外，在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"多肽"是指至少兩個(gè)氨 基酸通過(guò)肽鍵連接而得到的寡聚物，其中，多肽中所包含的氨基酸殘基的數(shù)目并不受特別 限制。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，多肽可以含有15個(gè)氨基酸。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理 解的是，還可以對(duì)上述多肽進(jìn)行化學(xué)修飾，以便增加多肽的抗原性，有助于多肽包被到 ELISA板底。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用具有上述氨基酸序列的多肽，能夠有效地檢測(cè)樣品， 例如結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品（例如血清樣品）中的LPPZ抗體水平。發(fā)明人發(fā)現(xiàn) 從LppZ蛋白完整序列得到的上述多肽可以模擬LppZ的抗原表位，能夠與血液樣本中LPPZ抗 體特異性的反應(yīng)，因而，可以有效地用于檢測(cè)對(duì)象血液樣本中的LPPZ抗體水平，由此，可以 有效地用于篩查結(jié)核病疑似患者血清，為結(jié)核病的診斷提供了一個(gè)新的檢測(cè)手段。
[0043] 上述抗原多肽可通過(guò)化學(xué)合成得到，也可以通過(guò)基因工程技術(shù)得到，此技術(shù)為行 業(yè)內(nèi)所熟悉。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，可以有效地通過(guò)常規(guī)合成方法，合成上述多 肽，從而代替重組表達(dá)的生物合成方式。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以用上述多肽進(jìn)行檢測(cè)的樣品的類型并不受特別限制。 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選的樣品為來(lái)自結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣本。由此，可以 利用多肽檢測(cè)結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣本中的LPPZ抗體水平，由此可以確定患者 是否患有結(jié)核病，為結(jié)核病檢測(cè)提供輔助手段，或者提供結(jié)核病的早期篩查。另外，還可以 通過(guò)檢測(cè)對(duì)象血液中的LppZ抗體水平，而對(duì)患者進(jìn)行治療的療效評(píng)估監(jiān)測(cè)分析。
[0045]利用本發(fā)明的多肽檢測(cè)樣品中LppZ抗體水平的方法并不受特別限制，包括但不限 于ELISA、液相芯片、固相芯片及其它免疫雜交技術(shù)等。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以通過(guò)酶聯(lián) 免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法，借助本發(fā)明的多肽檢測(cè)樣品中的LppZ抗體水平。由此，可以進(jìn)一 步提高利用多肽檢測(cè)結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品中的LppZ抗體水平的效率。作為 示例，可以采用下列方法利用多肽檢測(cè)結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品中的LppZ抗體 水平：
[0046]首先，用ρΗ9·6的碳酸鹽緩沖液(NaC03 0.159g，NaHC03 0.293g，加水至 100ml，pH值 為9.6)稀釋多肽至以8/!111，以10(^1/孔的量加入到96孔酶標(biāo)板的孔中，封板膜密封后4°(：過(guò) 夜。
[0047] 接下來(lái)，棄去孔中的液體，0.1%TBS-T洗滌緩沖液(含0. l%TWeen-20的TBS-T溶液 配制為NaCl 8.7g，Tris 1.21g，加去離子水至 1000ml，pH 7.5,再加入Tween-20 lml)洗滌 酶標(biāo)板5次，每次3min。
[0048] 接著，向孔中添加含5%BSA和0.05%Tween-20的TBS-T封閉緩沖液（其配制方法 為：NaCl 0.87g，Tris 0.121g，加去離子水至 100ml，pH 7.5,再加入Tween-20 0.5ml， BSA5g)，每孔300μ1，封板膜密封后37°C孵育lh。
[0049] 接著，添加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品。用上述含5 % BSA和0.05 % Tween-20的TBS-T封閉緩 沖液稀釋待測(cè)血清，稀釋比例為1:100。梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品的血清，稀釋比例從1:50起至 1:2000止。完全棄去孔中液體，每孔加待測(cè)樣品的血清稀釋液100μ1，每例待測(cè)樣品的血清 樣本3個(gè)復(fù)孔，每板設(shè)立2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔，加入已知陽(yáng)性血清，且每板設(shè)立2個(gè)空白對(duì)照孔，加 入0.1 % TBS-T洗滌緩沖液。封板膜密封后37 °C孵育2h。棄去孔中液體，洗滌酶標(biāo)板5次，每次 3min〇
[0050] 接著，進(jìn)行第二抗體免疫反應(yīng)。利用上述含5%BSA和0.05%Tween-20的TBS-T封閉 緩沖液稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG，稀釋比例1:5000，每孔加10(^1，封板膜密 封后37 °C孵育lh。棄去孔中液體，洗滌酶標(biāo)板5次，每次3min。
[0051 ]接著，加底物顯色。按照常規(guī)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)(例如康為世紀(jì)TMB顯色試劑盒）， 加入顯色底物，每孔加入1〇〇μ1，室溫避光條件下顯色lOmin，每孔加入50μ1 2M H2SO4終止反 應(yīng)。
[0052]接著，酶標(biāo)儀492nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定光密度0D值。
[0053]最后，基于所得的光密度0D值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得對(duì)應(yīng)檢測(cè)樣品 的相對(duì)濃度，然后與預(yù)定參考值進(jìn)行比較，確定待測(cè)樣本是否來(lái)源于患有結(jié)核病患者。 [0054]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以利用確診癌癥患者和健康人(健康志愿者）的血液樣品 進(jìn)行平行試驗(yàn)所得到的數(shù)值作為預(yù)定的參考值。
[0055]設(shè)當(dāng)待測(cè)樣本中的LppZ抗體相對(duì)濃度高于X，則待測(cè)血清為疑似結(jié)核病患者血清。 X是發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)計(jì)算獲得，具體方法為檢測(cè)人群中結(jié)核患者和健康人血清抗體相對(duì)濃 度的受試者工作曲線(R0C曲線)最優(yōu)點(diǎn)下的相對(duì)濃度。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，采用82例結(jié)核患 者血清樣本和38例健康人血清樣本，計(jì)算得序列SEQ ID NO: 1所示抗原多肽的X值為6.86。 [0056] LPPZ抗體識(shí)別的抗原多肽的應(yīng)用
[0057]在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了前面所述的LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽在制備 檢測(cè)血清中LppZ抗體水平的試劑盒中的用途。
[0058]如前所述，采用制備的試劑盒，利用其包含的LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽，通過(guò)免疫 印跡檢測(cè)手段可有效檢測(cè)待測(cè)者血清中的LppZ抗體水平，進(jìn)而能夠有效進(jìn)行結(jié)核病診斷。 從而，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒用于結(jié)核病診斷。其中，基于結(jié)核病患者血清LppZ抗 體表達(dá)水平較健康人顯著升高，能夠有效對(duì)待測(cè)者進(jìn)行結(jié)核病診斷。
[0059]為此，在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)樣品中LppZ抗體水平的 試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包括:前面所述的LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽。根據(jù) 本發(fā)明的實(shí)施例，利用該試劑盒能夠有效檢測(cè)樣品中LppZ抗體水平，進(jìn)而基于結(jié)核病患者 血清LppZ抗體表達(dá)水平較健康人顯著升高，能夠有效對(duì)待測(cè)者進(jìn)行結(jié)核病診斷。
[0060] 具體地，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽以下列的至少一種 形式提供：
[0061] 1)96孔板，所述96孔板的孔中包被所述LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽；
[0062] 2)微球，所述微球偶聯(lián)所述LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽。
[0063]進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，該試劑盒進(jìn)一步包括：陽(yáng)性對(duì)照樣品，所述 陽(yáng)性對(duì)照樣品為抗LppZ蛋白的抗體(可以人工制備獲得）。由此，利用該試劑盒進(jìn)行LppZ抗 體水平檢測(cè)和結(jié)核病診斷時(shí)，結(jié)果更加可靠。
[0064]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括:標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為多例LppZ抗體表達(dá) 為陽(yáng)性的血清的等體積混合物。由此，利用該試劑盒進(jìn)行LppZ抗體水平檢測(cè)和結(jié)核病診斷 時(shí)結(jié)果更加真實(shí)可靠。其中，陽(yáng)性血清的例數(shù)也即血清的患者來(lái)源數(shù)并不受特別限制，所述 "多例"也可以為1例。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為10例LppZ抗體表達(dá)為陽(yáng) 性的血清等體積混合組成的血清池。
[0065]根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為所述多例LppZ抗體表達(dá)為陽(yáng)性的血 清的等體積混合物的梯度稀釋產(chǎn)物，所述梯度稀釋的比例從1:50起至1:2000止。其中，經(jīng)剃 度稀釋是為了方便后續(xù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此，利用該試劑盒進(jìn)行LppZ抗體水平檢測(cè)和結(jié)核 病診斷時(shí)結(jié)果可靠度高。
[0066]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽的濃度為lμg/ml。
[0067] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品為血清。
[0068] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，該試劑盒可以包括:96孔板，所述96孔板的孔中包被前 面所述的LPPZ抗體識(shí)別的抗原多肽。進(jìn)一步，該試劑盒可以進(jìn)一步包括：陽(yáng)性對(duì)照樣品，所 述陽(yáng)性對(duì)照樣品為抗LppZ蛋白的抗體，或者/額外地可以進(jìn)一步包括:標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述標(biāo)準(zhǔn) 樣品為L(zhǎng)ppZ抗體表達(dá)為陽(yáng)性的血清經(jīng)梯度稀釋后的組合。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所 述標(biāo)準(zhǔn)樣品為所述多例LppZ抗體表達(dá)為陽(yáng)性的血清的等體積混合物的梯度稀釋產(chǎn)物，所述 梯度稀釋的比例從1: 50起至1: 2000止。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述LppZ抗體識(shí)別的抗原多 肽的濃度為lμg/ml。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品為血清。
[0069] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品為來(lái)自結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品。由 此，可以利用多肽檢測(cè)結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品中的LppZ抗體水平，由此可以 確定患者是否患有結(jié)核病，為結(jié)核病檢測(cè)提供輔助手段，或者監(jiān)控結(jié)核病的進(jìn)展。另外，利 用該試劑盒還可以通過(guò)檢測(cè)對(duì)象血液中的LppZ抗體水平，而對(duì)患者對(duì)治療方法的反應(yīng)進(jìn)行 預(yù)后。
[0070] 在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種用于檢測(cè)樣品中LPPZ抗體水平的試劑 盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包括:前面所述的LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽。由此，利用 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以有效地借助根據(jù)本發(fā)明的LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽對(duì)樣品中的 LppZ抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒可以進(jìn)一步包括:適于進(jìn)行ELISA 檢測(cè)的試劑。由此，可以通過(guò)ELISA檢測(cè)方法，利用根據(jù)本發(fā)明的多肽對(duì)樣品中的LppZ抗體 進(jìn)行檢測(cè)，從而可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測(cè)結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品中的 LppZ抗體水平的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述多肽設(shè)置于96孔板中，例如可以包被96孔 板的孔，例如可以通過(guò)常規(guī)處理如借助包被液和阻滯液進(jìn)行。由此，可以方便地高通量地進(jìn) 行檢測(cè)?？梢赃M(jìn)一步提高利用多肽檢測(cè)結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品中的LppZ抗體 水平的效率。試劑盒中還可以包含其他試劑，例如洗滌緩沖液，樣品稀釋緩沖液，TMB底物溶 液，反應(yīng)終止液，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，陽(yáng)性對(duì)照樣品，標(biāo)準(zhǔn)樣品。其中，陽(yáng)性對(duì)照樣 品為抗LppZ蛋白的抗體，標(biāo)準(zhǔn)樣品為L(zhǎng)ppZ抗體表達(dá)為陽(yáng)性的血清經(jīng)梯度稀釋后的組合。或 者，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為所述多例LppZ抗體表達(dá)為陽(yáng)性的血清的等體積混合物的梯度稀釋產(chǎn) 物。
[0071] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品為來(lái)自結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者以及健康志愿者 的血液樣品。
[0072]另外，利用該試劑盒還可以通過(guò)檢測(cè)對(duì)象血液中的LppZ抗體水平，而對(duì)患者對(duì)治 療方法的反應(yīng)進(jìn)行預(yù)后。
[0073]下面通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋。需要說(shuō)明的是，下列實(shí)施例僅僅是說(shuō)明 性的，并不以任何方式限制本發(fā)明。另外，下列實(shí)施例中所采用的所有儀器、材料等均為市 售可得的，如在下列實(shí)施例中沒(méi)有明確指出的操作，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的操作 方法進(jìn)行。
[0074]實(shí)施例1多肽的制備 [0075] 1.肽庫(kù)的制備
[0076] LppZ(Rv3006)的氨基酸序列從蛋白質(zhì)公共資源數(shù)據(jù)庫(kù)uni-prot獲得，其序列從N 端到C端如下：
[0078] LppZ蛋白全長(zhǎng)序列拆分成一組15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽，相鄰多肽之間順序重疊 12 個(gè)氨基酸殘基，組成LppZ肽庫(kù)，共計(jì)121條。
[0079] 2.原位合成LppZ蛋白肽庫(kù)制備多肽芯片(peptide array)
[0080]根據(jù)蛋白及多肽氨基酸殘基長(zhǎng)度、重疊序列長(zhǎng)度進(jìn)行多肽合成儀ASP SL(德國(guó)， intavis公司)MutilPep合成控制程序設(shè)定，依據(jù)程序控制在每個(gè)合成周期添加一種特定氨 基酸到活化的硝酸纖維素膜表面合成位點(diǎn)，并催化氨基酸之間肽鍵形成。合成肽鏈長(zhǎng)度為 15個(gè)氨基酸殘基，需進(jìn)行15個(gè)周期的反應(yīng)，按照ASP SL多肽合成儀的操作流程，將20種 FM0C-基團(tuán)保護(hù)的天然氨基酸溶液放到機(jī)器上對(duì)應(yīng)的位置。每個(gè)周期之間氨基酸要經(jīng)過(guò)帽 化，F(xiàn)M0C-基團(tuán)脫保護(hù)等一系列的過(guò)程才能與下一個(gè)氨基酸結(jié)合，最后一個(gè)周期結(jié)束時(shí)，要 將氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)脫掉。多肽芯片合成后于一 20°C密封保存?zhèn)溆谩?br>[0081 ]實(shí)施例2篩選與結(jié)核病相關(guān)的多肽(抗原表位的篩選）
[0082] 1.多肽芯片的水化和免疫印跡
[0083]將實(shí)施例1制備的多肽芯片(這里稱為"多肽芯片Γ)浸入40ml 100%乙醇中，搖床 上搖5分鐘。然后，將該多肽芯片浸入40ml 75%乙醇中，搖床上搖5分鐘。接下來(lái)，將多肽芯 片浸入40ml 50%乙醇中，搖床上搖5分鐘。接著，加入150ml PBS浸泡30分鐘。最后，將將多 肽芯片浸入40ml 5%脫脂奶粉/PBS-T溶液中，室溫下孵育3小時(shí)進(jìn)行封閉。
[0084] 將下述初篩和鑒定實(shí)驗(yàn)中涉及的血清樣本用5%脫脂奶粉/PBS-T溶液1:1000稀釋 制備成免疫反應(yīng)液，將多肽芯片放入雜交袋內(nèi)，按〇. Iml/cm2加反應(yīng)液，去除袋內(nèi)所有氣泡， 封膜機(jī)封口，4°C輕輕振蕩過(guò)夜。
[0085]血清免疫反應(yīng)結(jié)束后，剪開(kāi)雜交袋，棄去反應(yīng)液，PBS-T 40ml洗多肽芯片3次，每次 15分鐘，將多肽芯片放入雜交袋內(nèi)，加1:2000稀釋的山羊抗人IgG溶液，按0.1ml/cm2加二抗 反應(yīng)液，封好雜交袋，室溫下輕輕振蕩2小時(shí)，40ml PBS-T洗膜3次，每次15分鐘。
[0086] 接下來(lái)，進(jìn)行ECL顯影，曝光，曝光結(jié)果用AlphaView軟件系統(tǒng)分析圖像。
[0087] 2.抗原表位的初篩
[0088] 將10例結(jié)核病患者外周血血清等量混合制備成結(jié)核混合血清池，10例PPD檢測(cè)陰 性志愿者外周血血清等量混合制備成健康混合血清池。上述血清池與多肽芯片按照上述方 法進(jìn)行免疫雜交，根據(jù)免疫反應(yīng)結(jié)果，挑選與結(jié)核病患者血清反映陽(yáng)性且健康志愿者血清 反映陰性的差異多肽位點(diǎn)，共計(jì)16個(gè)，即為L(zhǎng)ppZ蛋白在結(jié)核血清中的抗原識(shí)別表位。多肽芯 片顯影結(jié)果如圖1所示。
[0089]圖1顯示了多肽芯片1的顯影結(jié)果，其中黑色方框所示為L(zhǎng)ppZ蛋白肽庫(kù)所在區(qū)域。
[0090] 3.具有結(jié)核病診斷價(jià)值的抗原多肽篩選
[0091] 按照實(shí)施例1所述的制備方法，制備包含上述16條差異多肽及對(duì)照在內(nèi)的多肽芯 片（這里稱為"多肽芯片2"），通過(guò)與100例結(jié)核病患者血清和90例健康人血清進(jìn)行免疫反 應(yīng)，篩選出LppZ抗原表位高頻位點(diǎn)3個(gè)，它們具有區(qū)分結(jié)核病患者和健康人的價(jià)值，其序列 和在結(jié)核血清中的陽(yáng)性率如表1所示，多肽芯片2顯影結(jié)果如圖2所示：
[0092] 表 1
[0094]圖2顯示了多肽芯片2的顯影結(jié)果，其中黑色方框內(nèi)所示為L(zhǎng)ppZ多肽所在區(qū)域。
[0095] 實(shí)施例3 ELISA檢驗(yàn)
[0096] 以實(shí)施例2中篩選獲得的三種多肽(表1所示)為抗原分別包被96孔板，運(yùn)用ELISA 方法對(duì)下列樣本進(jìn)行LppZ抗體的檢測(cè):82例結(jié)核患者血清和38例健康對(duì)照血清。
[0097]具體檢測(cè)方法如下：
[0098]首先，用多肽合成儀MultiPep RS按照序列表中氨基酸殘基順序合成所述抗原多 肽。
[0099]接著，用ρΗ9·6的碳酸鹽緩沖液(NaC03 0.159g，NaHC03 0.293g，加水至 100ml，pH值 為9.6)稀釋多肽至以8/!111，以10(^1/孔的量加入到96孔酶標(biāo)板的孔中，封板膜密封后4°(：過(guò) 夜。
[0100] 接下來(lái)，棄去孔中的液體，〇. 1%TBS-T洗滌緩沖液(含0. l%Tween-20的TBS-T溶液 配制為NaCl 8.7g，Tris 1.21g，加去離子水至 1000ml，pH 7.5,再加入Tween-20 lml)洗滌 酶標(biāo)板5次，每次3min。
[0101] 接著，向孔中添加含5%BSA和0.05%Tween-20的TBS-T封閉緩沖液（其配制方法 為：NaCl 0.87g，Tris 0.121g，加去離子水至 100ml，pH 7.5,再加入Tween-20 0.5ml， BSA5g)，每孔300μ1，封板膜密封后37°C孵育lh。
[0102] 接著，添加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品。所述標(biāo)準(zhǔn)品為隨機(jī)選取的其中10例結(jié)核病患者的 外周血血清的等體積混合物。用上述含5%BSA和0.05%Tween-20的TBS-T封閉緩沖液稀釋 待測(cè)血清，稀釋比例為1:100。梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品的血清混合物，稀釋比例從1:50起至1: 2000止。完全棄去孔中液體，每孔加待測(cè)樣品的血清稀釋液100μΙ，每例待測(cè)樣品的血清樣 本3個(gè)復(fù)孔，每板設(shè)立2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔，加入已知陽(yáng)性血清，且每板設(shè)立2個(gè)空白對(duì)照孔，加入 0.1 % TBS-T洗滌緩沖液。封板膜密封后37 °C孵育2h。棄去孔中液體，洗滌酶標(biāo)板5次，每次 3min〇
[0103] 接著，進(jìn)行第二抗體免疫反應(yīng)。利用上述含5%BSA和0.05%Tween-20的TBS-T封閉 緩沖液稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG，稀釋比例1:5000，每孔加10(^1，封板膜密 封后37 °C孵育lh。棄去孔中液體，洗滌酶標(biāo)板5次，每次3min。
[0104] 接著，加底物顯色。按照常規(guī)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)(康為世紀(jì)TMB顯色試劑盒），加入 顯色底物，每孔加入1〇〇μ1，室溫避光條件下顯色lOmin，每孔加入50μ1 2M H2SO4終止反應(yīng)。 [0105]接著，酶標(biāo)儀492nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定光密度0D值。
[0106] 最后，基于所得的光密度0D值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得對(duì)應(yīng)檢測(cè)樣品 的相對(duì)濃度，然后與預(yù)定參考值進(jìn)行比較，確定待測(cè)樣本是否來(lái)源于患有結(jié)核病患者。
[0107] 設(shè)當(dāng)待測(cè)樣本中的LppZ抗體相對(duì)濃度高于X，則待測(cè)血清為疑似結(jié)核病患者血清。 X為檢測(cè)人群中結(jié)核患者和健康人血清抗體相對(duì)濃度的受試者工作曲線(R0C曲線）最優(yōu)點(diǎn) 下的相對(duì)濃度?；诓捎?2例結(jié)核患者血清樣本和38例健康人血清樣本，計(jì)算得到各抗原 多肽對(duì)應(yīng)的X值，其中序列SEQ ID NO: 1所示抗原多肽的X值為6.86。
[0108] 檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，SEQ ID N0:l-3所示的多肽無(wú)論獨(dú)立使用或者聯(lián)合使用，均 檢測(cè)到結(jié)核病患者血清中LppZ抗體水平均顯著高于健康人群血清。
[0109] 綜上所述，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病患者的LppZ抗體水平均顯著高于健康人群血清。由 此，證明了本發(fā)明的LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽，可有效用于結(jié)核病的輔助診斷。
[0110] 在本說(shuō)明書(shū)的描述中，參考術(shù)語(yǔ)"一個(gè)實(shí)施例"、"一些實(shí)施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特 點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書(shū)中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不 一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何 的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。 Com]盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不 脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本 發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽，其特征在于，其多肽活性片段為下列至少之一： 1. SEQ ID N0:1 所示序列：SGCARFNDAQSQPFT; 2. SEQ ID勵(lì):2所示序列4?0"服01'撤撤歡； 3. SEQ ID 勵(lì):3所示序列：擬擬141^1?〇306·; 4) 選自SEQ ID N0:l-3所示氨基酸序列的至少兩種的連接產(chǎn)物， 5) 1) _4)所述的多肽活性片段經(jīng)氨基酸殘基的修飾、取代、缺失或添加而形成的氨基酸 衍生序列。2. 權(quán)利要求1所述的LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽在制備檢測(cè)血清中LppZ抗體水平的試劑 盒中的用途。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述試劑盒用于結(jié)核病診斷。4. 一種用于檢測(cè)樣品中LppZ抗體水平的試劑盒，其特征在于，包括： 權(quán)利要求1所述的LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽以下列的 至少一種形式提供： 1) 96孔板，所述96孔板的孔中包被所述LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽； 2) 微球，所述微球偶聯(lián)所述LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括：陽(yáng)性對(duì)照樣品，所述陽(yáng)性對(duì) 照樣品為抗LppZ蛋白的抗體。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括:標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為 多例LppZ抗體表達(dá)為陽(yáng)性的血清的等體積混合物。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為所述多例LppZ抗體表達(dá) 為陽(yáng)性的血清的等體積混合物的梯度稀釋產(chǎn)物，所述梯度稀釋的比例從1: 50起至1: 2000 止。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述LppZ抗體識(shí)別的抗原多肽的濃度為 lμg/ml〇10. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述樣品為血清。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK105884872SQ201610330711
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年5月18日
【發(fā)明人】岳文濤, 譚金晶, 顧勐, 張麗娜
【申請(qǐng)人】首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院, 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所