重組潤(rùn)滑素的制備
【專(zhuān)利摘要】公開(kāi)了類(lèi)人潤(rùn)滑素或PRG4糖蛋白的具有出色潤(rùn)滑性質(zhì)和新糖基化模式的新型重組同種型，以及使其能夠商業(yè)化生產(chǎn)的高水平制備方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】重組潤(rùn)滑素的制備
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年10月22日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?1/894,366的優(yōu)先權(quán)和 利益，其以整體援引加入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本文所公開(kāi)的發(fā)明涉及使用經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生產(chǎn)商業(yè)量的物質(zhì)組合物的方法，所述 物質(zhì)組合物包含重組類(lèi)人潤(rùn)滑素（lubricin)。更具體地，本發(fā)明涉及在商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)新形 式的潤(rùn)滑素，其具有優(yōu)越的潤(rùn)滑性質(zhì)并且其可以配制并用于預(yù)防性地或治療性地治療各種 疾病，例如從關(guān)節(jié)疼痛到干眼病。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 蛋白聚糖4 (PRG4)基因編碼高度糖基化的表面潤(rùn)滑蛋白叫做潤(rùn)滑素、巨核細(xì)胞刺 激因子(MSF)、或淺表層蛋白（SZP)。（參見(jiàn) Jay，Curr · Op in · Orthop · 15，355 (2004);美國(guó)專(zhuān)利 號(hào)6，743，774;美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，960，562)。潤(rùn)滑素是從PRG4基因 （SEQ ID NO: 2)表達(dá)的，全長(zhǎng)跨 12個(gè)外顯子，但是也有報(bào)道過(guò)多種天然發(fā)生的截短的版本。940個(gè)氨基酸的大的"類(lèi)粘液素" 中央結(jié)構(gòu)域（由外顯子6編碼)包含一些70+類(lèi)KEPAPTT序列并且是重度糖基化的。所述糖蛋 白包含2型核心糖基化殘基和多樣性的1型核心聚糖(0-連接i3(l-3)Gal-GalNAc寡糖），其中 至少后者已經(jīng)顯示出介導(dǎo)其主要的生理學(xué)功能，界面潤(rùn)滑（Jay等，Glycoconj J 18,807 (2001))41^4已被顯示出存在于軟骨、滑膜、腱、和半月板的表面，在淚液膜中以及在其它 的解剖部位。PRG4已被顯示出有助于對(duì)接的關(guān)節(jié)軟骨表面的界面潤(rùn)滑。PRG4已被顯示出不 僅僅作為單體存在還可作為二聚體和多聚體(1111111:;[1]161')(通過(guò)1'1-末端和0末端處保守的富 半月光氨酸結(jié)構(gòu)域的二硫鍵）（Schmidt等，Biochim Biophys Acta· 1790(5): 375-84(2009); Kooyman等，Paper No.255,56th Ann.Meet of 0rthop.Res.Soc.，2010)〇
[0006] 在滑膜關(guān)節(jié)的軟骨交界面，有至少兩種潤(rùn)滑的物理化學(xué)模式在起作用。這些被分 類(lèi)為"流體薄膜"和"界面(boundary)"。運(yùn)作的潤(rùn)滑模式取決于關(guān)節(jié)連接組織上的正向力和 切向力，取決于這些表面之間切向運(yùn)動(dòng)的相對(duì)速率，以及取決于載荷和運(yùn)動(dòng)隨著時(shí)間的變 化。摩擦系數(shù)μ(無(wú)量綱單位，相對(duì)運(yùn)動(dòng)中的兩個(gè)表面之間所測(cè)量的摩擦力與所應(yīng)用的正向 力的比率），提供了潤(rùn)滑的定量量度。
[0007] -種類(lèi)型的流體介導(dǎo)的潤(rùn)滑或者"流體薄膜"模式是流體靜力的。在載荷開(kāi)始時(shí)以 及通常延長(zhǎng)的時(shí)間段里，軟骨內(nèi)的組織液會(huì)變得增壓，由于此組織的雙相性（biphasic nature)，液體也可以通過(guò)滲流機(jī)制(weeping mechanism)而被擠壓至關(guān)節(jié)表面之間的微凸 體(asperities)。增壓的組織液和捕集的潤(rùn)滑劑池(包含透明質(zhì)酸）因而可以顯著有助于正 常載荷的承受(具有很少的對(duì)剪力的抵抗），促進(jìn)了很低的摩擦系數(shù)。另外，在載荷和/或運(yùn) 動(dòng)開(kāi)始時(shí)，可以發(fā)生擠壓膜、流體動(dòng)力和流體彈性動(dòng)力類(lèi)型的流體薄膜潤(rùn)滑，且有增壓、運(yùn) 動(dòng)、和變形作用來(lái)從相對(duì)運(yùn)動(dòng)中的兩個(gè)表面之間的缺口推動(dòng)各種潤(rùn)滑劑和/或推動(dòng)各種潤(rùn) 滑劑穿過(guò)相對(duì)運(yùn)動(dòng)中的兩個(gè)表面之間的缺口。
[0008] 在界面潤(rùn)滑(boundary lubrication)中，載荷得到了表面-與-表面的接觸的支 持，并且相關(guān)聯(lián)的摩擦性質(zhì)由潤(rùn)滑劑表面分子(也即潤(rùn)滑素種類(lèi))所確定。此模式很重要，因 為相對(duì)接的軟骨層通過(guò)互鎖、扁平微凸體而在總面積的+/-10%實(shí)現(xiàn)接觸，并且這很可能是 大部分的摩擦發(fā)生的地方。界面潤(rùn)滑本質(zhì)上減緩"粘滑（Stick-slip )"（Meyer等， Nanoscience:Friction and Rheology on the Nanometer Scale,fforld Scientific Publishing Co .Pte.Ltd，River Edge，N.J·，（2002)，pp. 373)，也即，承載重量的交界軟骨 表面彼此滑動(dòng)時(shí)同時(shí)發(fā)生的猝動(dòng)（jerking mot ion)，并因而表現(xiàn)為對(duì)穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)和起始運(yùn)動(dòng) 的降低的抵抗。軟骨表面典型的磨損模式表明，關(guān)節(jié)軟骨的界面潤(rùn)滑對(duì)于關(guān)節(jié)表面結(jié)構(gòu)的 保護(hù)和保持是關(guān)鍵的。例如，潤(rùn)滑素空白小鼠顯示出磨損但是新生小鼠（其不承載重量)卻 未顯不（Jay等，Arthritis and Rheumatism,56:3662-3669(2007)。
[0009] 隨著載荷時(shí)間的增加以及流體靜壓的消失，相對(duì)于增壓的流體，潤(rùn)滑劑涂敷的表 面承載越來(lái)越高的載荷，結(jié)果，μ越來(lái)越受到潤(rùn)滑的界面模式的支配。潤(rùn)滑的界面模式由穩(wěn) 定滑動(dòng)期間的摩擦系數(shù)所表示，其中影響流體薄膜形成的因素不變，如相對(duì)滑動(dòng)速度和軸 向載荷。對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨，已經(jīng)得到的結(jié)論是界面潤(rùn)滑必然會(huì)發(fā)生，但是要輔之以流體增壓和 其它機(jī)制。眨眼期間眼角膜和眼瞼交界面處的潤(rùn)滑機(jī)制并不涉及顯著的載荷，因而減輕了 有效潤(rùn)滑的物理化學(xué)要求，因此其很可能與軟骨潤(rùn)滑有很大不同。然而，據(jù)提議潤(rùn)滑的界面 模式可以在包含淚液膜時(shí)處于支配狀態(tài)，如在干眼病中。
[0010] 被認(rèn)為造成滑液出色潤(rùn)滑性質(zhì)的兩種機(jī)械成分是潤(rùn)滑素和透明質(zhì)酸(或者透明質(zhì) 酸鹽(酯)或"ΗΑ"，下文可互換使用）。潤(rùn)滑素已經(jīng)被顯示出在關(guān)節(jié)連接滑膜關(guān)節(jié)中作為界面 潤(rùn)滑劑以及用于保護(hù)軟骨的表面以防摩擦力、細(xì)胞粘連和蛋白沉積。例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6， 960，562和6，743，774公開(kāi)了包含基本純的PRG4同種型的潤(rùn)滑多肽，以及通過(guò)全身性或者直 接施用至組織而潤(rùn)滑滑膜關(guān)節(jié)或其它組織的方法。ΗΑ本身已經(jīng)被顯示出在界面模式潤(rùn)滑下 于軟骨-軟骨界面處相對(duì)于鹽水而言降低μ(3.3mg/ml的ΗΑ中0.12對(duì)比roS中~0.24)，而僅 有潤(rùn)滑素將μ降低至更低的水平，但是包含HA以及潤(rùn)滑素的滑液可以將僅有潤(rùn)滑素或者HA 與潤(rùn)滑素的合成混合物所不能實(shí)現(xiàn)的摩擦系數(shù)賦予給界面表面。尚未有潤(rùn)滑素與ΗΑ的合成 混合物能夠完全復(fù)制天然形式的滑液所賦予的低摩擦系數(shù)。來(lái)自各種來(lái)源的以及各種分子 量的ΗΑ已經(jīng)與以下混合進(jìn)行了測(cè)試:從滑膜細(xì)胞體外表達(dá)的潤(rùn)滑素，牛潤(rùn)滑素，從滑液提取 的并且在ΗΑ中"重構(gòu)的"潤(rùn)滑素，以及在早期嘗試用重組DNA技術(shù)制備時(shí)以毫克量表達(dá)的潤(rùn) 滑素。
[0011]此前在適于商業(yè)拓展的規(guī)模嘗試重組生產(chǎn)全長(zhǎng)潤(rùn)滑素還沒(méi)有取得成功。從CH0細(xì) 胞表達(dá)的人類(lèi)潤(rùn)滑素種類(lèi)很低的（每升個(gè)位或者十位數(shù)毫克)生產(chǎn)率被認(rèn)為過(guò)低而不能支 持商業(yè)產(chǎn)品。解決此問(wèn)題的一種方法是截短外顯子6中的重復(fù)數(shù)目，并由此降低糖基化側(cè)鏈 的質(zhì)量而又至少保留一些潤(rùn)滑能力（參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,642,236和7,893,029)。此方 法據(jù)報(bào)道會(huì)導(dǎo)致截短的構(gòu)建物每升300至400毫克的總生產(chǎn)力（純化前）。
[0012] 發(fā)明概述
[0013]現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)人類(lèi)PRG4基因可用于產(chǎn)生大的、商業(yè)量的新型的、高度糖基化的類(lèi)人 類(lèi)形式潤(rùn)滑素，下文簡(jiǎn)單稱(chēng)之為"潤(rùn)滑素"、多聚體潤(rùn)滑素、重組人潤(rùn)滑素、或rhPRG4。如本文 所公開(kāi)的，這是通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)的：將人類(lèi)PRG4基因（hPRG4)轉(zhuǎn)染至某些經(jīng)修飾的中國(guó)倉(cāng)鼠 卵巢(CH0)細(xì)胞中，所述細(xì)胞已被發(fā)現(xiàn)有能力大規(guī)模地將表達(dá)的蛋白翻譯后糖基化，并繼而 在商業(yè)規(guī)模體積的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞，例如，至少10升、更常見(jiàn)至少50升、優(yōu)選至少100 升或至少500升、以及最優(yōu)選1，000升或更多。
[0014] 本發(fā)明的潤(rùn)滑素包含多分散的潤(rùn)滑素單體單元形成二聚體和多聚體以及任選存 在的游離單體。每個(gè)單元均被高度地且可變地糖基化，其中糖苷殘基側(cè)鏈貢獻(xiàn)了其分子量 的至少30%、常為35%或40%、以及可能高達(dá)45%或更高。
[0015] 在天然人類(lèi)潤(rùn)滑素中，糖基化由1型核心〇-連接GalNAc-Gal(N_乙酰半乳糖胺-半 乳糖)二糖(其至少60%在末端有唾液酸取代）、以及還有2型核心糖基化組成，所述2型核心 糖基化在1型核心之外涉及在各種同分異構(gòu)的構(gòu)型中的GlcNac(N-乙酰葡萄糖胺)單糖(參 見(jiàn)，例如Estrella等，Biochem J. ,429(2) :359-67(2010))〇
[0016] 本文中公開(kāi)的所產(chǎn)生的重組材料與天然形式的人類(lèi)潤(rùn)滑素相比富含1型核心聚 糖。其糖基化包含至少95%的1型核心側(cè)鏈，更可能是超過(guò)98%或99%。另外，所述側(cè)鏈常常 會(huì)被硫酸化至天然人類(lèi)潤(rùn)滑素中未曾見(jiàn)過(guò)的程度。這將本發(fā)明的rhPRG4與天然hPRG4區(qū)分 開(kāi)。該提高的硫酸化含量被認(rèn)為可以向粘液糖蛋白增加額外的負(fù)電荷，其可用于增強(qiáng)所述 粘液糖蛋白抵制附近生物分子并由此提高其潤(rùn)滑性的能力，并且使分子結(jié)構(gòu)緊繃，從分子 角度使其更剛硬，這可以有助于發(fā)揮起降低納米尺度和中尺度摩擦的能力。
[0017] 全長(zhǎng)（非截短的）潤(rùn)滑素單體序列（SEQ ID NO: 1)在核心蛋白中包含1404個(gè)氨基 酸，或者說(shuō)大約151kDa。人類(lèi)潤(rùn)滑素的信號(hào)序列是SEQ ID NO: 1的殘基1-24。因而，人類(lèi)潤(rùn)滑 素的成熟形式是SEQ ID NO: 1的殘基25-1404。如本文所公開(kāi)的產(chǎn)生的重組產(chǎn)物的徹底還原 會(huì)產(chǎn)生大約300kDa-460kDa表觀分子量的單體種類(lèi)，這是通過(guò)在許多分子量確定技術(shù)(包括 SDS三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽3-8%聚丙烯酰胺凝膠電泳）中與分子量標(biāo)準(zhǔn)比較而評(píng)估的。 使用質(zhì)譜技術(shù)分析糖基化以及組合了其它操作表明，糖基化的重組單體的真實(shí)分子量(而 不是從凝膠迀移率所推斷）很可能是在220-280kDa的范圍，且不太可能超過(guò)大約300kDa。在 潤(rùn)滑素單體的序列中可能存在的作為〇-連接糖基化位點(diǎn)的總共大約329個(gè)0-連接(其中284 個(gè)為蘇氨酸）中，有大量的可變和未知數(shù)量的被取代（100至150個(gè)，或許高達(dá)200或220)。在 總的糖基化中，大約有一般包含兩個(gè)糖單元（GalNAc-Gal)，以及一半包含三個(gè)糖單元 (GalNAc-Gal-唾液酸）。最豐富的形式是硫酸化的Gal-GalNac，次豐富的是唾液酸化的Gal-GalNac 〇
[0018] 所述潤(rùn)滑素表達(dá)產(chǎn)物能夠抵抗(但卻并不能免除）斷裂成單體或者二聚體的潤(rùn)滑 素種類(lèi)。徹底還原的結(jié)果表明單體單元之間和之內(nèi)包含二硫交聯(lián)。另外，用變性緩沖液處理 (沒(méi)有還原)可導(dǎo)致較低分子量的產(chǎn)物，表明了較高級(jí)別的四級(jí)結(jié)構(gòu)，其中通過(guò)疏水相互作 用、氫鍵、物理纏結(jié)和/或允許自我組裝的其它非共價(jià)連結(jié)而將鏈保持在一起。所述二聚體 和多聚體是多分散的（polydisperse)。其中的分子種類(lèi)通常具有大約450-600kDa的分子 量，以及多聚體種類(lèi)常常是2,000kDa或更多。通常，非還原的復(fù)合物的一些種類(lèi)在電泳實(shí)驗(yàn) 中基本上不進(jìn)入3-8%的SDS-PAGE凝膠。復(fù)合物更大的種類(lèi)被認(rèn)為是包含3至5個(gè)(或許可高 達(dá)20個(gè))單體單元。
[0019] 不受理論局限，認(rèn)為此類(lèi)較大的超分子成分是作為單體/二聚體濃度的函數(shù)而形 成的。目前，認(rèn)為單體/二聚體至少大約〇.5mg/ml的濃度對(duì)于較大復(fù)合物的自然形成是最佳 的。比這低很多的濃度(例如低于大約〇.lmg/ml)則包含單體和二聚體，而只有很少的量的 復(fù)合物；比這高很多的濃度則可形成肉眼可見(jiàn)的聚集物成為霧狀或絮狀溶液?？梢允褂帽?面活性劑或者賦形劑來(lái)在形成復(fù)合物時(shí)防止大聚集物(其總是與二聚體的種類(lèi)一起出現(xiàn)） 的形成，所述表面活性劑優(yōu)選一般認(rèn)為是安全的生理學(xué)適用的非離子表面活性劑，例如基 于聚氧乙烯的表面活性劑。
[0020]使用包含本發(fā)明潤(rùn)滑素的制劑進(jìn)行的測(cè)試顯示出，其在載荷下的潤(rùn)滑和組織保護(hù) 性質(zhì)可超過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)此前已知的重組潤(rùn)滑素。不受理論局限，本發(fā)明人推測(cè)，在未受潤(rùn)滑的 載荷下交界面組織運(yùn)動(dòng)時(shí)發(fā)生粘滑現(xiàn)象的時(shí)候，本發(fā)明潤(rùn)滑素的涂敷可以將切力從下面的 軟骨表面轉(zhuǎn)移至多分散的潤(rùn)滑素涂敷內(nèi)的層。也即，本發(fā)明人認(rèn)為，在載荷下和往復(fù)運(yùn)動(dòng) 時(shí)，下表面經(jīng)受較少的切力，保持其完整性，因?yàn)橥糠笾械臐?rùn)滑素分子彼此覆蓋，而在載荷 去除后很可能會(huì)重新排列（參見(jiàn)，例如Lee等，PNAS，110(7):E567-574(2013))。該作者表明 了，滑膜關(guān)節(jié)磨損并不與摩擦系數(shù)直接相關(guān)，但是更直接地與粘滑滑動(dòng)相關(guān)，并且滑膜關(guān)節(jié) 的不同分子成分協(xié)同作用來(lái)防止磨損。
[0021 ]在任何情況下，本發(fā)明的潤(rùn)滑素產(chǎn)物，在接受測(cè)試時(shí)，呈現(xiàn)出卓越的潤(rùn)滑性質(zhì)，導(dǎo) 致摩擦系數(shù)(靜態(tài)和動(dòng)態(tài)的)常常位于純化的天然牛潤(rùn)滑素的系數(shù)的150%、120%、110%之 內(nèi)或者基本上與之相等(通過(guò)本文公開(kāi)的軟骨對(duì)軟骨的潤(rùn)滑測(cè)試來(lái)測(cè)定）。在這些測(cè)試中， 本發(fā)明的類(lèi)人糖蛋白實(shí)現(xiàn)了靜態(tài)摩擦系數(shù)位于或低于0.5和低于0.2(取決于本文所公開(kāi)的 測(cè)試條件），以及動(dòng)態(tài)摩擦系數(shù)常常位于或低于大約〇. 1，二者都是通過(guò)在體外減壓軟骨對(duì) 軟骨的載荷而進(jìn)行測(cè)量(具有固定接觸面積）。當(dāng)與透明質(zhì)酸(HA)組合時(shí)，這些值提高至對(duì) 于靜態(tài)測(cè)量的低于大約0.3以及低于0.1(取決于保壓時(shí)間（dwell time))以及對(duì)于動(dòng)態(tài)測(cè) 量的低于0.1，很接近于滑液可接受的值。因而，此類(lèi)組合物可以顯著減少滑膜關(guān)節(jié)磨損。
[0022] 因此，本發(fā)明的一個(gè)方面包括用于潤(rùn)滑素的商業(yè)生產(chǎn)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述方法包括以下步驟：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CH0)細(xì)胞，所述中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CH0)細(xì)胞轉(zhuǎn)染有人類(lèi)PRG4基因，并且其在足以產(chǎn)生潤(rùn)滑素糖蛋白的時(shí)間里和條件下表達(dá) 所述人類(lèi)PRG4基因并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行翻譯后糖基化;和從所述培養(yǎng)基純化潤(rùn)滑素糖蛋白。 例如，在一些實(shí)施方案中，將所述潤(rùn)滑素糖蛋白與細(xì)胞外液中的宿主細(xì)胞蛋白和其它雜質(zhì) 分離，以至少部分地將其純化。所述重組蛋白僅需要從培養(yǎng)基中富集，而不是純化至均質(zhì) 性，以便純化用于本發(fā)明方法的目的。所述方法足以產(chǎn)生這樣的潤(rùn)滑素糖蛋白，其具有至少 30%重量的糖苷殘基在培養(yǎng)基中濃度為至少0.4g/L。
[0023] 在一些實(shí)施方案中，所述CH0細(xì)胞是包含編碼人類(lèi)PRG4基因的核酸的CH0-M細(xì)胞。 在其它實(shí)施方案中，所述CH0細(xì)胞轉(zhuǎn)染有第一載體以及轉(zhuǎn)染有第二載體，其中所述第一載體 包含編碼染色質(zhì)元件的核酸，而所述第二載體包含編碼人類(lèi)PRG4基因的核酸。所述染色質(zhì) 元件可以是邊界元件、基質(zhì)附著區(qū)、基因座控制區(qū)、或通用染色質(zhì)開(kāi)放元件（universal chromatin opening element)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述染色質(zhì)元件是基質(zhì)附著區(qū)。 [0024]在另外的實(shí)施方案中，所述CH0細(xì)胞轉(zhuǎn)染有第一載體以及轉(zhuǎn)染有第二載體，所述第 一載體包含編碼染色質(zhì)元件和編碼人類(lèi)PRG4基因的核酸，而所述第二載體包含編碼染色質(zhì) 元件和編碼人類(lèi)PRG4基因的核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一和第二載體中的染色質(zhì) 元件是基質(zhì)附著區(qū)。
[0025]在一些實(shí)施方案中，所述二聚體或多聚體潤(rùn)滑素糖蛋白重量的至少30%、至少 35%、至少40%、或至少45%是糖苷殘基的重量。在一些實(shí)施方案中，所述二聚體或多聚體 潤(rùn)滑素糖蛋白重量的超過(guò)30 %、超過(guò)35 %、超過(guò)40 %或、超過(guò)45 %是糖苷殘基的重量。所述 糖苷殘基可以與天然人類(lèi)潤(rùn)滑素的那些不同，因?yàn)橹亟M類(lèi)人潤(rùn)滑素的糖基化至少90%、至 少95%、或至少99%的重量為1型核心糖基化。另外，在一些實(shí)施方案中，與天然人類(lèi)潤(rùn)滑素 相比所述糖苷殘基富含硫酸化的單糖。
[0026]所述方法出乎意料地能夠產(chǎn)生具有商業(yè)效益的量的全長(zhǎng)潤(rùn)滑素糖蛋白。例如，可 以在足以產(chǎn)生這樣的潤(rùn)滑素糖蛋白的時(shí)間里和條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，所述潤(rùn)滑素糖蛋白在 培養(yǎng)基里的濃度為每升培養(yǎng)基至少約〇. 4克或0.5克重組潤(rùn)滑素、優(yōu)選每升培養(yǎng)基至少0.8 克、以及最優(yōu)選每升培養(yǎng)基至少1. 〇克的潤(rùn)滑素，例如，在至少約1 〇、50或100升的培養(yǎng)中。所 述方法經(jīng)優(yōu)化后可以在每升的培養(yǎng)基產(chǎn)生多達(dá)2.0、至少2.5、或至少3.0克的潤(rùn)滑素?；?優(yōu)化的純化方案的開(kāi)發(fā)，將可能會(huì)獲得每升至少約200毫克的純化重組潤(rùn)滑素、優(yōu)選至少 300mg/L、更優(yōu)選至少500mg/L、以及最優(yōu)選可以獲得更多。就
【申請(qǐng)人】所知，此前在任何類(lèi)粘 液素蛋白（或者大小上與潤(rùn)滑素相當(dāng)?shù)牡鞍祝┑闹亟M表達(dá)中都從未實(shí)現(xiàn)這些水平的生產(chǎn)力， 并且表達(dá)PRG4的嘗試也從未成功產(chǎn)生具有本文所述產(chǎn)品的性質(zhì)的材料。
[0027]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，單體潤(rùn)滑素種類(lèi)常常從培養(yǎng)基中與多聚體蛋白種類(lèi)混雜在 一起被共同純化出來(lái)。所述多聚體種類(lèi)富含二聚體潤(rùn)滑素種類(lèi)。例如，在一些實(shí)施方案中， 所述方法產(chǎn)生這樣的重組潤(rùn)滑素的混合物，其包括單體、二聚體、和多聚體潤(rùn)滑素種類(lèi)。在 一些實(shí)施方案中，所述潤(rùn)滑素糖蛋白包含至少5個(gè)經(jīng)二硫鍵或者經(jīng)非共價(jià)連結(jié)的個(gè)體糖基 化氨基酸鏈，并且具有至少1200kDa的分子量。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的糖蛋白，在使用下文所述方案進(jìn)行測(cè)試時(shí)，產(chǎn)生出接 近純化天然哺乳動(dòng)物潤(rùn)滑素所曾觀測(cè)到的最低值的摩擦系數(shù)。例如，在一些實(shí)施方案中，所 述重組潤(rùn)滑素糖蛋白是這樣的多聚體蛋白蛋白，其在軟骨對(duì)軟骨摩擦測(cè)試中測(cè)量的所產(chǎn)生 的靜態(tài)摩擦系數(shù)不超過(guò)純化的天然牛潤(rùn)滑素靜態(tài)摩擦系數(shù)的150%。在其它實(shí)施方案中，所 述重組潤(rùn)滑素糖蛋白是這樣的多聚體蛋白，其在軟骨對(duì)軟骨摩擦測(cè)試中測(cè)量的所產(chǎn)生的靜 態(tài)摩擦系數(shù)不超過(guò)純化的天然牛潤(rùn)滑素靜態(tài)摩擦系數(shù)的120%。在另外的實(shí)施方案中，所述 重組潤(rùn)滑素糖蛋白是這樣的多聚體蛋白，其在軟骨對(duì)軟骨摩擦測(cè)試中測(cè)量的所產(chǎn)生的靜態(tài) 摩擦系數(shù)不超過(guò)純化的天然牛潤(rùn)滑素靜態(tài)摩擦系數(shù)的110 %。
[0029]本發(fā)明的另一方面涉及在宿主細(xì)胞培養(yǎng)中從人類(lèi)PRG4基因表達(dá)的重組多聚體潤(rùn) 滑素糖蛋白的組合物。所述重組潤(rùn)滑素糖蛋白至少30%重量為糖苷殘基，并且在軟骨對(duì)軟 骨摩擦測(cè)試中測(cè)量的所產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)摩擦系數(shù)不超過(guò)純化的天然牛潤(rùn)滑素動(dòng)態(tài)摩擦系數(shù)的 150%〇
[0030] 在一些實(shí)施方案中，所述重組潤(rùn)滑素糖蛋白重量的至少35%、至少40%、或至少 45 %為糖苷殘基。
[0031] 在一些實(shí)施方案中，在軟骨對(duì)軟骨摩擦測(cè)試中，所述重組潤(rùn)滑素糖蛋白產(chǎn)生不超 過(guò)純化的天然牛潤(rùn)滑素的動(dòng)態(tài)摩擦系數(shù)的110 %或不超過(guò)其120 %的摩擦系數(shù)。
[0032] 在一些實(shí)施方案中，所述重組潤(rùn)滑素的糖苷殘基與天然人類(lèi)潤(rùn)滑素的糖苷殘基的 不同在于，所述重組潤(rùn)滑素的糖基化重量的至少90%、至少95%、或至少99%為1型核心糖 基化。另外，在一些實(shí)施方案中，與天然人類(lèi)潤(rùn)滑素相比所述重組潤(rùn)滑素的糖苷殘基富含硫 酸化的單糖。
[0033] 在一些實(shí)施方案中，所述重組潤(rùn)滑素是單體、二聚體和多聚體種類(lèi)的混合物。在一 些實(shí)施方案中，所述潤(rùn)滑素包括單體種類(lèi)。在一些實(shí)施方案中，所述潤(rùn)滑素包括二聚體的種 類(lèi)。在一些實(shí)施方案中，所述潤(rùn)滑素包括多聚體種類(lèi)。在一些實(shí)施方案中，所述潤(rùn)滑素是多 聚體單體種類(lèi)的混合物。
[0034] 在一些實(shí)施方案中，所述潤(rùn)滑素糖蛋白包含至少5個(gè)經(jīng)二硫鍵或者經(jīng)非共價(jià)連結(jié) 的個(gè)體糖基化氨基酸鏈，并且具有至少1200kDa的分子量。
[0035] 在一些實(shí)施方案中，重組潤(rùn)滑素糖蛋白的組合物還包含與所述潤(rùn)滑素糖蛋白混雜 的透明質(zhì)酸或其鹽。
[0036] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含溶液的組合物，所述溶液包含100克的人類(lèi)潤(rùn) 滑素，其中所述潤(rùn)滑素的糖基化至少99%的重量為1型核心糖基化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述潤(rùn)滑素是重組人類(lèi)潤(rùn)滑素。在另外的實(shí)施方案中，所述溶液中潤(rùn)滑素的濃度為至少〇.5g/ L。在另外的實(shí)施方案中，所述溶液是細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0037]本發(fā)明的組合物可用于制備藥物，所述藥物用于任何已知的或此后發(fā)現(xiàn)的PRG4糖 蛋白的醫(yī)療或其它用途，包括作為用于與身體接觸的各種設(shè)備的涂層(參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利 申請(qǐng)?zhí)?009/0068247和2011/0142908);用于通過(guò)滑膜關(guān)節(jié)潤(rùn)滑的增強(qiáng)而在人類(lèi)或動(dòng)物中 治療滑膜關(guān)節(jié)（美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?004/0229804)或者粘彈性物補(bǔ)充療法(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2008/0287369);用于局部應(yīng)用于組織表面，例如，在手術(shù)期間抑制粘連或纖維性結(jié)締組織 的隨后形成（美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?004/0229804);用于治療干眼?。绹?guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?011/ 0059902);用于治療口干癥(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?013/0039865);用于治療間質(zhì)性膀胱炎（美國(guó) 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?012/0321693);作為陰道潤(rùn)滑劑(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?012/0052077);用于隱形眼 鏡護(hù)理和儲(chǔ)存溶液(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?012/0321611)或者用于全身注射以便，例如抑制細(xì) 胞-細(xì)胞粘連或者在脈管內(nèi)的運(yùn)動(dòng)（參見(jiàn)，例如2013年11月26日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/ 908,959)〇 [0038] 附圖簡(jiǎn)述
[0039]圖1和2是用于開(kāi)發(fā)表達(dá)潤(rùn)滑素的CH0-M克隆（用于本發(fā)明的方法并編碼hPRG4全長(zhǎng) 序列）的載體的質(zhì)粒圖譜。
[0040] 圖3和4描繪了可用于評(píng)估本發(fā)明的重組人潤(rùn)滑素結(jié)構(gòu)的聚丙烯酰胺凝膠。
[0041] 圖5是一次潤(rùn)滑素生產(chǎn)過(guò)程的生產(chǎn)力的圖示，該生產(chǎn)過(guò)程測(cè)量每升轉(zhuǎn)染的CH0-M細(xì) 胞培養(yǎng)物隨時(shí)間所產(chǎn)生的潤(rùn)滑素毫克數(shù)。在每個(gè)收獲日期有三個(gè)柱狀圖。左側(cè)的柱狀圖為 "標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)24Jun 14"，中間的柱狀圖為"標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)24Jul 14"，而右側(cè)的柱狀圖為"標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 25Jul 14"。
[0042] 圖6是顯示本發(fā)明重組人潤(rùn)滑素的1型核心聚糖的示意圖。
[0043]圖7是色譜圖，其中峰被標(biāo)記，顯示出從本發(fā)明的重組人潤(rùn)滑素中的SER和THR殘基 上垂下的各種二糖和三糖的相對(duì)豐度。
[0044] 圖8是示意圖，其顯示了擴(kuò)展至從人類(lèi)滑液提取的天然潤(rùn)滑素上的2型核心結(jié)構(gòu)的 更大范圍的聚糖。
[0045] 圖9是色譜圖，其中峰被標(biāo)記，顯示出天然人類(lèi)潤(rùn)滑素中各種糖殘基的相對(duì)豐度。 [0046] 圖10A、10B、和10C是表面張力對(duì)比rhPRG4和/或聚氧乙烯表面活性劑濃度的制圖， 顯示出隨著rhPRG4濃度的升高表面張力的降低。
[0047]圖11A和11B示出數(shù)據(jù)，將rhPRG4溶液的靜態(tài)（圖11A)和動(dòng)態(tài)（圖11B)摩擦系數(shù)與純 化的天然牛PRG4、鹽水(PBS)、和?；罕容^，其中兩種PRG4制劑均為450yg/mL。標(biāo)注a、b、和 c表示結(jié)果中統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異(？〈〇.〇5)，11 = 7。在^1-?1?4(重組的）和1^1出4(天然的）的結(jié) 果中沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異，由圖11B中每個(gè)柱狀圖上存在的"b"所表明。
[0048] 圖12A-B示出數(shù)據(jù)，將HA加上rhPRG4溶液的靜態(tài)(FIG.12A)和動(dòng)態(tài)（圖12B)摩擦系 數(shù)與鹽水、僅有rhPRG4、和?；罕容^，其中rhPRG4為450yg/mL而HA (1.5MDa)為3.3 3mg/mL。 圖12B中每個(gè)柱狀圖上的標(biāo)注a、b、c、和d表示結(jié)果中統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異(p〈0.05)，n = 4。
[0049] 圖13示出數(shù)據(jù)，顯示在消化天然牛PRG4并應(yīng)用rhPRG4之后于交界面牛組織表面的 潤(rùn)滑性重建。
[0050] 圖14A-D示出數(shù)據(jù)，顯示鹽水中300μg/ml的天然牛PRG4和rhPRG4、和僅有鹽水時(shí)， rhPRG4在人類(lèi)眼角膜-眼瞼交界面（圖14A-靜態(tài)，圖14B-動(dòng)態(tài))和人類(lèi)眼角膜-PDMS (圖14C-靜態(tài)，圖14D-動(dòng)態(tài))交界面處對(duì)界面潤(rùn)滑的作用。數(shù)值為均值±SEM(n = 6)，其中眼角膜-目艮 瞼(AB)和眼角膜-PDMS(O))交界面的平均正向應(yīng)力（normal stress)分別為14.1 ± 2.2和 16.9 ± 5.3 (均值土 SD)。這些數(shù)據(jù)表明了 rhPRG4與純化的天然PRG4在低載荷潤(rùn)滑任務(wù)中幾 乎相同的潤(rùn)滑性質(zhì)。
[0051] 圖15是全長(zhǎng)人類(lèi)潤(rùn)滑素的氨基酸序列，其長(zhǎng)度為1404個(gè)氨基酸。信號(hào)序列殘基（1-24)以粗體顯示。
[0052] 圖16是編碼全長(zhǎng)人類(lèi)潤(rùn)滑素的核酸序列。
[0053] 發(fā)明詳述
[0054]本發(fā)明人研究了使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)已知人類(lèi)潤(rùn)滑素糖蛋白的選擇，目標(biāo)在于 產(chǎn)生這樣的生產(chǎn)方法，其中涉及在無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基中運(yùn)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行的懸浮培 養(yǎng)。與
【申請(qǐng)人】熟知的使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生蛋白的之前的嘗試不同，挑戰(zhàn)在于產(chǎn)生商業(yè)量的 這樣的復(fù)雜的、大的生物聚合物，其價(jià)值在于其納米尺度的機(jī)械性質(zhì)，而不是其生化性質(zhì)， 并且這些物理性質(zhì)依賴(lài)于翻譯后糖基化以此前從未在改造的細(xì)胞中觀測(cè)到的尺度成功進(jìn) 行。
[0055]此前重組產(chǎn)生全長(zhǎng)潤(rùn)滑素的嘗試每升的量?jī)H僅曾產(chǎn)出低數(shù)量的毫克，而需要的是 每升產(chǎn)生至少約1-2克的方法。對(duì)文獻(xiàn)的綜述表明尚無(wú)成功在商業(yè)規(guī)模重組產(chǎn)生全長(zhǎng)的適 當(dāng)糖基化的潤(rùn)滑素的報(bào)道，也沒(méi)有商業(yè)規(guī)模表達(dá)任何粘液素或類(lèi)粘液素蛋白的報(bào)道。檢索 確實(shí)顯示有報(bào)道提出此類(lèi)高度糖基化的糖蛋白作為潤(rùn)滑素很難表達(dá)。參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利 號(hào)7，642，236，其中提到："為了優(yōu)化表達(dá)參數(shù)并研究所有大約76-78個(gè)類(lèi)似KEPAPTT的序列 的功能必要性，設(shè)計(jì)了潤(rùn)滑素表達(dá)構(gòu)建物，其使得能夠合成具有變化程度的〇-連接寡糖取 代的重組潤(rùn)滑素蛋白"。表達(dá)截短的潤(rùn)滑素構(gòu)建物的重組細(xì)胞系的生產(chǎn)力數(shù)據(jù)在該專(zhuān)利中 沒(méi)有公開(kāi)。
[0056] 本發(fā)明人尋找并最終獲得了瑞士日內(nèi)瓦的Selexis S.A.來(lái)產(chǎn)生表達(dá)潤(rùn)滑素的克 隆培養(yǎng)物，這部分地基于報(bào)道的Selexis技術(shù)的能力（涉及表觀遺傳調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，以增 強(qiáng)難以表達(dá)的蛋白的生產(chǎn)）（參見(jiàn)Selexis美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，129,062和8,252,917以及美國(guó)專(zhuān)利 申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2011/0061117、2012/0231449和2013/0143264,其公開(kāi)內(nèi)容援引加入本文； Girod等，Nat Methods 4(9) :747-53(2007) ;Harraghy等，Curr Gene Ther.8(5) :353-66 (2008))〇
[0057] Selexis技術(shù)的應(yīng)用導(dǎo)致了成功表達(dá)潤(rùn)滑素的克隆的開(kāi)發(fā)。分析之后，進(jìn)行規(guī)模擴(kuò) 大和純化，發(fā)現(xiàn)了新開(kāi)發(fā)的重組生產(chǎn)過(guò)程導(dǎo)致了此前從未有描述過(guò)的、多聚體的、高度和差 異糖基化的類(lèi)人潤(rùn)滑素形式，并且產(chǎn)量對(duì)于此類(lèi)高度糖基化的、高分子量的類(lèi)粘液素糖蛋 白而言也是出乎意料的水平。對(duì)于富含新的重組潤(rùn)滑素形式的制劑所進(jìn)行的測(cè)試證明了出 乎意料的性質(zhì)，并且使得可以產(chǎn)生具有改善的生理學(xué)適應(yīng)性的組織潤(rùn)滑組合物。
[0058] 重組人潤(rùn)滑素(rhlubricin)制備過(guò)程
[0059] 宿主細(xì)胞
[0060] 產(chǎn)生Selexis克隆的工作是使用其專(zhuān)有的CH0-M細(xì)胞系來(lái)完成的，該細(xì)胞系含有基 于DNA的元件控制染色質(zhì)的動(dòng)態(tài)組織，所謂的基質(zhì)附著區(qū)。所述CH0-M細(xì)胞系是中國(guó)倉(cāng)鼠卵 巢細(xì)胞系衍生自CH0-K1細(xì)胞(ATCC，Cat. #CCL-61，Lot. 4765275)，其適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)條件并 用于產(chǎn)生重組蛋白。參見(jiàn)Girod等，Nat Methods 4(9) :747-53(2007)和上文提到的Selexis 的美國(guó)專(zhuān)利和出版物，其涉及使用基質(zhì)附著區(qū)(MAR)的MAR方法用于開(kāi)發(fā)穩(wěn)定高表達(dá)的原核 細(xì)胞系如CH0、以及涉及經(jīng)轉(zhuǎn)染表達(dá)蛋白的細(xì)胞所述蛋白參與表達(dá)產(chǎn)物穿過(guò)ER膜的移位和/ 或穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜的分泌。CH0-M被用于產(chǎn)生治療性重組蛋白并且允許更高的和更穩(wěn)定的表 達(dá)。其使用使得可以分離出展現(xiàn)期望的、高水平表達(dá)(用于產(chǎn)生重組蛋白）的克隆。
[0061 ]基質(zhì)附著區(qū)（"MAR"）是以高親和力結(jié)合分離的核骨架或核基質(zhì)的DNA序列（Hart 等，Curr Opin Genet Dev,8(5):519-25(1998)。由此，它們可以定義獨(dú)立染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域的 邊界，從而只有所涵蓋的順式調(diào)控元件控制結(jié)構(gòu)域內(nèi)的基因的表達(dá)。已經(jīng)有顯示MAR序列與 增強(qiáng)子相互作用以提高局部的染色質(zhì)可接近性（Jenuwein等，Nature，385 : 269-272 (1997))，并且可以在細(xì)胞培養(yǎng)系里增強(qiáng)異源基因的表達(dá)。攜帶有雞溶菌酶5'MAR元件的質(zhì) 粒與一或多個(gè)表達(dá)載體的共轉(zhuǎn)染會(huì)導(dǎo)致提升的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因表達(dá)(顯示出產(chǎn)生與對(duì)照構(gòu)建物 相比提高20-倍的表達(dá)）。
[0062] MAR是本文引用的Selexis申請(qǐng)和出版物中公開(kāi)的一種類(lèi)型的"染色質(zhì)元件"（本文 中也稱(chēng)作Selexis遺傳元件或SGE)。染色質(zhì)元件或SGE用于防止圍繞著異源基因整合至宿主 染色體位點(diǎn)的染色質(zhì)影響所整合的基因的表達(dá)水平。染色質(zhì)元件包括邊界元件或者隔離元 件（BE)、基質(zhì)附著區(qū)（MAR)、基因座控制區(qū)（LCR)、以及通用或者遍在的染色質(zhì)開(kāi)放元件 (UC0E)。一旦表達(dá)載體整合至宿主細(xì)胞染色體中，則SGE使染色質(zhì)成型并因而使轉(zhuǎn)基因保持 在高度轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)。
[0063] 所述CH0-M宿主細(xì)胞在SFM4CH0培養(yǎng)基(HyClone)中培養(yǎng)，其中補(bǔ)加了 8mM的L-谷氨 酰胺、次黃嘌呤和胸苷（lx HT，Invitr〇gen)。細(xì)胞在潮濕的溫育器中于37°C和5%的C02下 保持?jǐn)噭?dòng)（120rpm，25mm滑動(dòng)（stroke))。
[0064] 載體構(gòu)建
[0065] 將編碼全長(zhǎng)1404AA人類(lèi)潤(rùn)滑素蛋白的PRG4基因（SEQIDN0:2)插入到了商業(yè)可購(gòu) 買(mǎi)的質(zhì)粒載體中（Selexis S.A.專(zhuān)有）（Geneva, Switzer land)以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中增 強(qiáng)的基因表達(dá)。編碼全長(zhǎng)人類(lèi)潤(rùn)滑素的另一個(gè)序列可以從GenBank登錄號(hào)NM_005807.3獲 得。
[0066]構(gòu)建了兩個(gè)表達(dá)載體。潤(rùn)滑素基因被克隆至攜帶有嘌呤霉素抗性的載體以及另一 個(gè)攜帶有潮霉素抗性的載體中。包括嘌呤霉素抗性的載體命名為pSVpuro_C+_EFlalpha (K0ZAK-ext9)EGFP_BGH pA>X_S29(2*HindIII，SalI填充）（Mw = 9861)。包括潮霉素抗性的 載體被命名為pSVhygro_C+_EFlalpha(K0ZAK-ext9)EGFP_BGH pA>X_29(2*HindIII，SalI填 充(Mw=10299)。所述表達(dá)載體含有來(lái)自轉(zhuǎn)座子Tn3(AmpR)的細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶基因（賦予了 氨節(jié)青霉素抗性），以及細(xì)菌ColEl復(fù)制原點(diǎn)。作為pGL3Control(Promega)的衍生物，表達(dá)載 體的終止子區(qū)域含有SV40增強(qiáng)子(位于多腺苷酸化信號(hào)的下游）。每個(gè)載體還在表達(dá)盒的下 游包括一個(gè)人類(lèi)X_29SGE以及在SV40啟動(dòng)子控制之下的整合的嘌呤霉素或潮霉素抗性基 因。X_29SGE是指Selexis遺傳元件（"SGE"），在此情形中是基質(zhì)附著區(qū)(MAR)，其在本文引用 的Selexis申請(qǐng)和出版物中公開(kāi)。兩種表達(dá)載體均編碼在hEF-1-alpha啟動(dòng)子結(jié)合CMV增強(qiáng) 子的控制下的感興趣的基因（PRG4)。質(zhì)粒通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。
[0067] 攜帶有嘌呤霉素抗性基因和攜帶有潮霉素抗性基因的載體的質(zhì)粒圖譜分別在圖1 和圖2中示出。
[0068] 11?
[0069] 使用定義為CH0-M細(xì)胞脈沖條件（ 1250V，20ms和3脈沖）的MicroPorator? (NanoEnTek Inc.，Korea)來(lái)通過(guò)微穿孔而轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。使用了并行的GFP表達(dá)載體來(lái)控 制轉(zhuǎn)染效率，并顯示出轉(zhuǎn)染效率在50-70%之間。首先用嘌呤霉素 PRG4表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所述 CH0-M細(xì)胞，并通過(guò)在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基上的培養(yǎng)來(lái)篩選經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。更具體而 言，將稀釋液分配至96-孔平板上，在接下來(lái)的一周通過(guò)向所有孔添加100yL的新鮮培養(yǎng)基 (SFM4CH0培養(yǎng)基，補(bǔ)加有8mM的L-谷氨酰胺、lx HT包括5yg/mL的嘌呤霉素)來(lái)進(jìn)行給料。通 過(guò)將完全的細(xì)胞懸液從相應(yīng)的96-孔轉(zhuǎn)移至24-孔平板(用相同培養(yǎng)基預(yù)處理）的一個(gè)孔，而 在鋪板后的15天將27個(gè)小匯集(mini匯集)重置于24-孔平板。在4天之內(nèi)分析了 24-孔的懸 液并且將14個(gè)小匯集轉(zhuǎn)移至6-孔平板（lmL細(xì)胞懸液+2mL新鮮培養(yǎng)基(包括篩選））。3天后通 過(guò)懸液以及在離心管(5mL工作容積）中收集而將8個(gè)表達(dá)最好的小匯集進(jìn)行了擴(kuò)展，并在3 天后在搖瓶(20mL工作容積）中進(jìn)行培養(yǎng)。在保存前進(jìn)行了隨后的一次傳代。
[0070] 在搖瓶中擴(kuò)展了抗性細(xì)胞的匯集，以產(chǎn)生初步研究所需的材料(總管l-2mg).通過(guò) 將細(xì)胞培養(yǎng)物在800g離心5min而獲得了無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基樣品。通過(guò)斑點(diǎn)印記分析而測(cè)定了重 組PRG4的表達(dá)。將10微升的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基(濃縮的樣品）應(yīng)用于PVDF膜(Millipore)上并使 樣品干燥成斑點(diǎn)。通過(guò)將PRG4從80μg/ml系列稀釋至2.5μg/ml而創(chuàng)建了 PRG4標(biāo)準(zhǔn)物。通過(guò)針 對(duì)PRG4的潤(rùn)滑素合成肽的單克隆抗體(Pierce)的措施來(lái)檢測(cè)重組PRG4。
[0071] 接下來(lái)用來(lái)自性能最佳的小匯集的細(xì)胞進(jìn)行了超轉(zhuǎn)染(對(duì)已經(jīng)過(guò)篩選的小匯集群 體進(jìn)行額外的轉(zhuǎn)染），其中施用第二種篩選標(biāo)記，所述潮霉素抗性盒。使用了上文所述的相 同轉(zhuǎn)染方案。在此第二次轉(zhuǎn)染后1天，在SFM4CH0培養(yǎng)基中開(kāi)始了篩選，也補(bǔ)加了 8mM的L-谷 氨酰胺和lx HT，但還包括lOOOyg/mL的潮霉素。在更換培養(yǎng)基后，4天內(nèi)將3個(gè)匯集轉(zhuǎn)移至6-孔平板；4天后將全部3個(gè)（3)匯集擴(kuò)展至離心管（5mL工作容積）并在三天內(nèi)擴(kuò)展至搖瓶 (20mL工作容積）。
[0072] 克隆生成
[0073]繼而在多個(gè)以及系列的實(shí)驗(yàn)中將超轉(zhuǎn)染的匯集進(jìn)行培養(yǎng)并分析生長(zhǎng)潛力，以嘗試 將細(xì)胞性質(zhì)最大化。
[0074]在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在100細(xì)胞/mL的濃度更換培養(yǎng)基之后，將三個(gè)超轉(zhuǎn)染的匯集(命 名為P01ST、P05ST、和P14ST)轉(zhuǎn)移至6-孔平板（每個(gè)匯集兩個(gè)平板），于半固態(tài)培養(yǎng)基（2x SFM4CH0培養(yǎng)基(HyClone)和CloneMatrix(Genetics)中，包括8mM的L-谷氨酰胺，lx HT和細(xì) 胞Boost 5TM(HyCl〇ne)，（無(wú)篩選）。16天之后對(duì)鋪板的細(xì)胞進(jìn)行了篩選，（ClonePix?系統(tǒng) (Molecular Devices))，且挑選了22個(gè)候選并轉(zhuǎn)移至96-孔平板(具有上文所述的生長(zhǎng)培養(yǎng) 基(但是無(wú)篩選））。6天后將全部18個(gè)生長(zhǎng)的候選重置至24-孔平板，其中是通過(guò)將完全的細(xì) 胞懸液從相應(yīng)的96-孔轉(zhuǎn)移至24-孔平板的一個(gè)孔(經(jīng)lmL的培養(yǎng)基預(yù)處理）。在3天內(nèi)分析了 24-孔上清，并將12個(gè)候選轉(zhuǎn)移至6-孔平板（lmL細(xì)胞懸液+2mL新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基（包括篩 選））。5天后將7個(gè)最佳表達(dá)的候選擴(kuò)展至離心管(5mL工作容積）內(nèi)培養(yǎng)基(無(wú)篩選）中的懸 液培養(yǎng)中，并在5天內(nèi)擴(kuò)展至搖瓶(20mL工作容積）中。
[0075]所有的細(xì)胞系都被保存起來(lái)。在搖瓶(接種3xl05細(xì)胞/mL，20mL培養(yǎng)容積）內(nèi)于分 批給料培養(yǎng)(給料策略-16%的原始體積的CB5溶液(HyClone)，52mg/mL，在第0、3、4、5、6、7 天給料）中比較了3個(gè)最佳候選的性能。在第8天，所述培養(yǎng)物含有4.22x 106至4.95x 106細(xì) 胞/mL以及94%至96%的活力。對(duì)這些匯集的細(xì)胞群體進(jìn)行了計(jì)數(shù)并稀釋用于單一細(xì)胞鋪 板(濃度1細(xì)胞/孔，2個(gè)平板）。在11天后通過(guò)向每孔添加 100μΙ的生長(zhǎng)培養(yǎng)基來(lái)對(duì)單一細(xì)胞 群(single colony)進(jìn)行給料(無(wú)篩選）。在17天后，將99個(gè)克隆重置于24-孔平板中，其中是 通過(guò)將完全的細(xì)胞懸液從相應(yīng)的96-孔轉(zhuǎn)移至24-孔平板的一個(gè)孔(經(jīng)lmL的培養(yǎng)基預(yù)處 理）。在4天內(nèi)，24個(gè)被轉(zhuǎn)移至6-孔平板(3mL的新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基包括篩選）。4天后8個(gè)克隆被 擴(kuò)展至離心管(5mL工作容積）中的懸液培養(yǎng)，并且在一次培養(yǎng)基更換(SFM4CH0培養(yǎng)基，補(bǔ)加 有8mM的L-谷氨酰胺和lx HT)之后所有8個(gè)克隆都被擴(kuò)展至搖瓶(20mL工作容積）。在保存所 有候選前進(jìn)行了隨后的一次傳代。
[0076]使用分批給料培養(yǎng)(給料策略16%的原始容量CB5溶液(HyCl〇ne)，52mg/mL，在第 0、3、4、5、6、7天給料），在搖瓶(接種3x 105細(xì)胞/mL，20mL培養(yǎng)容積）中對(duì)5個(gè)最佳候選的性 能進(jìn)行了比較。在第3天各個(gè)培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)目范圍在1.61x 106至3.46x 106細(xì)胞/mL，翻 倍時(shí)間范圍在19.8至30.7小時(shí)）。在第8天，細(xì)胞的濃度范圍在4.02x 106至9.48x 106細(xì)胞/ mL，其中細(xì)胞活力范圍是88.6%至97.7%。
[0077]在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將3個(gè)不同的超轉(zhuǎn)染的匯集（命名為P14STcp08、P05STll和 P14ST33)用上文所述的相同的程序處理。這導(dǎo)致了 4個(gè)克隆細(xì)胞系。再次，這些克隆的性能 在搖瓶中進(jìn)行了比較，導(dǎo)致在第8天細(xì)胞濃度的范圍是3.5x 106至9.48x 106細(xì)胞/mL并且活 力為 75.3%至 88.1%。
[0078] 來(lái)自上文所述的ClonePix?系統(tǒng)篩選的第一輪的克隆(P14ST15)(其在第8天展現(xiàn) 出6.03x 106細(xì)胞/mL以及95.5 %的活力）在搖瓶(20mL工作容積）中進(jìn)行了解凍。在一次隨 后的傳代之后，該候選被轉(zhuǎn)移至單一平板（以200細(xì)胞/mL的濃度（1個(gè)平板）），于上文所述的 半固態(tài)培養(yǎng)基外加 CloneMatrix中，包括8mM的L-谷氨酰胺，lx HT和細(xì)胞Boost 5?，無(wú)篩選。 12天后使用ClonePix?系統(tǒng)對(duì)鋪板的細(xì)胞進(jìn)行了篩選，挑選了 84個(gè)克隆并轉(zhuǎn)移至96-孔平板 (無(wú)篩選）。通過(guò)向每孔添加1〇〇μ1的生長(zhǎng)培養(yǎng)基來(lái)對(duì)單一細(xì)胞群進(jìn)行了給料。96-孔上清的 篩選在鋪板后18天進(jìn)行。最佳的24個(gè)生長(zhǎng)的克隆被重置于24-孔平板，其中是通過(guò)將完全的 細(xì)胞懸液從相應(yīng)的96-孔轉(zhuǎn)移至24-孔平板的一個(gè)孔(經(jīng)lmL的培養(yǎng)基預(yù)處理(無(wú)篩選）。在3 天內(nèi)，分析了 24-孔上清，并將12個(gè)克隆轉(zhuǎn)移至6-孔平板（lmL細(xì)胞懸液+2mL新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng) 基(包括篩選））。4天后將6個(gè)最佳表達(dá)的克隆擴(kuò)展至離心管(5mL工作容積）中的懸液培養(yǎng)， 以及在4天內(nèi)擴(kuò)展至搖瓶(20mL工作容積）。在保存前進(jìn)行了隨后的兩次傳代。保存了 6個(gè)克 隆細(xì)胞系。
[0079] 如上文在搖瓶中比較了6個(gè)最佳候選的性能。在第8天，細(xì)胞密度范圍在9.04x 106 至6 · 40x 106細(xì)胞/mL之間，并且活力在74 · 6%至93 · 1 %之間。
[0080] 冷凍保存和測(cè)試
[0081] 在所述克隆匯集的多次傳代后（從6至31)，以6xl06細(xì)胞/小管來(lái)將所述匯集冷凍 保存在小管中并儲(chǔ)存于液氮中。通過(guò)使用Veno^Gem支原體檢測(cè)試劑盒（ Minerva Biolabs)確認(rèn)了所有細(xì)胞系都沒(méi)有支原體。根據(jù)廠商方案接種并溫育無(wú)菌性測(cè)試(Heipha， Caso-Bouillon TSB)。確認(rèn)了所有小匯集和超轉(zhuǎn)染的小匯集的無(wú)菌性。
[0082] 放大培養(yǎng)
[0083] 選擇了命名為P05STll-cp05的細(xì)胞系用于放大。對(duì)于200升的運(yùn)行，使用了如下條 件和方案：
[0084]
[0085] 在200升的培養(yǎng)中從第1天至第8天，rhPRG4的表達(dá)與存活細(xì)胞密度(V⑶)一起提 高。VCD在第8天進(jìn)入平臺(tái)期，繼而開(kāi)始下降，這在一旦條件對(duì)于密集細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的代謝需 求不再是最佳時(shí)是通?？梢?jiàn)的。盡管如此，rhPRG4的表達(dá)依然不減退，并且其表達(dá)在VCDS 12-14x 106細(xì)胞/ml的培養(yǎng)系統(tǒng)中于培養(yǎng)的第13天達(dá)到了最大濃度。圖5顯示了重組潤(rùn)滑素 隨著時(shí)間的累積量，其是使用HPLC作圖的曲線(xiàn)下面積測(cè)量的，并通過(guò)與樣品系列稀釋的 HPLC純化(認(rèn)為至少99%的純潤(rùn)滑素)所制成的三個(gè)不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較而進(jìn)行解讀。如所 示，此過(guò)程估計(jì)重組潤(rùn)滑素的生產(chǎn)接近2.5g/ml。另外的生產(chǎn)運(yùn)行在由各種技術(shù)測(cè)量時(shí)其表 現(xiàn)產(chǎn)量有變化。由競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)量的一個(gè)運(yùn)行產(chǎn)生了 1.5g/升水平的潤(rùn)滑素。另一個(gè)產(chǎn)生 了 1.4g/升的讀數(shù)。
[0086] 重組PRG4的純化
[0087]開(kāi)發(fā)純化方案的目的是要在與雜質(zhì)分離時(shí)保留所表達(dá)的潤(rùn)滑素產(chǎn)物及其多聚體 復(fù)合物的潤(rùn)滑功能、避免聚積、以及保持高產(chǎn)量。這由于如下原因而成為挑戰(zhàn)：潤(rùn)滑素的重 度糖基化、其高分子量、其抗粘連和表面潤(rùn)滑性質(zhì)、以及其隨著純度提高而形成復(fù)合物和聚 集形成不可溶微粒的傾向。早前的實(shí)驗(yàn)表明，由于所收獲的培養(yǎng)基中潤(rùn)滑素滴度很高，因而 可能必需要流通模式的色譜來(lái)避免純化損失。開(kāi)發(fā)了一種策略，通過(guò)色譜吸附提取雜質(zhì)而 將潤(rùn)滑素產(chǎn)物保留在流通物中。在開(kāi)發(fā)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量對(duì)于所使用的非離子表面活性劑 成分很敏感，如例如，失水山梨醇月桂酸酯的聚氧乙烯衍生物。潤(rùn)滑素匯集中此種表面活性 劑的缺失導(dǎo)致在色譜分離步驟后的超濾/滲濾以及〇.2μπι過(guò)濾期間產(chǎn)物的顯著損失。只要使 用0.1%重量的表面活性劑即可大大提高產(chǎn)量。通過(guò)試錯(cuò)，發(fā)現(xiàn)較低濃度的表面活性劑成功 保留了功能并改善了產(chǎn)量。
[0088]在純化過(guò)程中所使用的非離子表面活性劑之外，生理學(xué)相容形式的賦形劑，如 [(3-膽酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)和/或賴(lài)氨酸，可以與本發(fā)明潤(rùn)滑素的溶 液混合并且可以對(duì)穩(wěn)定溶液有益處，例如，避免或者減少含有超過(guò)〇. 4或0.6mg/ml濃度的溶 液中潤(rùn)滑素的聚積。
[0089] 迭代測(cè)試導(dǎo)致了下文所示的純化過(guò)程的開(kāi)發(fā)。
[0090] 通過(guò)沉降所澄清的培養(yǎng)基（10〇11^)用511^的20〇111]\11^8、4〇111]\11%(：124!18.2來(lái)稀 釋?zhuān)⑴c400單位的1^112〇仙86(2501111；^8/^1，1'1〇￥38611)混合來(lái)去除可溶的多核苷酸。該溶液 在室溫混合4小時(shí)，繼而與37.8g的尿素混合以將尿素的濃度調(diào)節(jié)至6M，并導(dǎo)致120mL的溶 液。為此加入了 1N的NaOH以將pH調(diào)節(jié)至11以及0.01 %的Tween 20(失水山梨醇月桂酸酯， Sigma)〇
[0091] 經(jīng)Benzonase處理后的材料接著用GE Q Big Beads?的陰離子交換樹(shù)脂(pH 11)處 理，其中存在6M的Urea和0.01 %的Tween 20并且以流通(FT)模式運(yùn)行，其中雜質(zhì)結(jié)合至樹(shù) 脂而產(chǎn)物卻不結(jié)合。該柱首先用0.1N的NaOH來(lái)清潔;接著充入100mM的NaP〇4、1.5M的NaCl、 pH 7.2;并用200mM的Tris-Borate、6M的尿素 、pH 10再平衡。30ml容積的（XK 26x 6cm)柱接 著裝載120ml溶液（4ml/ml樹(shù)脂20ml/min的流速（240cm/hr)，隨后用平衡緩沖液-100mM Tris-Borate、100mM NaCl、6M尿素、0.01%Tween 20、pH 11 來(lái)洗滌。裝載之后一會(huì)兒，通過(guò) 洗滌收集產(chǎn)物（290mL總體積)直至加入脫離溶液(strip solution)0.1N Na0H+lM NaCl〇
[0092] 用1M的檸檬酸將此種部分純化的流通物潤(rùn)滑素匯集進(jìn)行pH調(diào)節(jié)至pH = 7.5,并穿 過(guò)輕磷灰石柱(BioRad CHT)，柱體積-14ml(XK 16x 7cm)，柱載荷-21ml裝載/ml樹(shù)脂，流速 = 10ml/min(300cm/hr)。該柱首先用0.1N NaOH的 1M NaCl清潔，充入500mM NaP〇4，pH 6.5; 用500mM NaP(k/6M尿素 ，pH 7.4再平衡；并載入來(lái)自上述步驟的29〇11^流通物。這之后是用 平衡緩沖液洗滌（15禮似?04,61尿素，0.01%了￥661120，？!17.4)，以產(chǎn)生3051111的含有產(chǎn)物 的流通物(f 1 〇w-through)。
[0093] 用1M的檸檬酸將來(lái)自羥磷灰石柱的流通物調(diào)節(jié)至pH 4.8并用水稀釋?zhuān)^而穿過(guò)GE SP Big Bead樹(shù)脂，柱容積-6ml(XK 1·6χ 3cm)，柱載荷-58ml載荷/ml樹(shù)脂，流速= 6.7ml/ min(200cm/hr)。該柱首先用0.5N NaOH清潔，充入lOOmM NaP〇4，1.5M NaCl，pH 7.4;用50mM 檸檬酸鈉/6M尿素，0.01%TWeen 20，pH 4.8;并載入來(lái)自上述步驟的35〇11^的流通物。隨后 是用平衡緩沖液、501^檸檬酸鈉/61尿素、0.01%1^?^1120、？!14.8洗滌，以產(chǎn)生3781111的含 有產(chǎn)物的流通物。繼而用10N Na0H(pH 7.2)將所述流通物中和。
[0094] 為了濃縮以及更換緩沖液，使用50kDa分子量截?cái)嘀档腡angenX 0.01m2平片膜 (TangenX技術(shù)Corporation)、LP篩選通道來(lái)過(guò)濾陽(yáng)離子交換后的流通產(chǎn)物匯集。滲濾緩沖 液為 10mM NaP〇4、150mM NaCl、pH 7.2(PBS)和0.1%Tween 20。在用0.1N NaOH清潔后；用 MilliQ水清洗;并用 10mM NaP〇4、150mM NaCl、pH 7.2平衡，該膜以15,00〇1111/1112進(jìn)行載荷;穿 流(Cross-flow)70ml/min;跨膜壓= 6_7psi ;滲透流= 5_6ml/min以將溶液濃縮至50ml。
[0095] 最后，經(jīng)耶0?后的產(chǎn)物匯集通過(guò)3&1'1:〇1'；[118 3&1'1：(^0代2、150-0.0151112的膜而經(jīng) 受0.2μπι的過(guò)濾，其中膜載荷為~17,000ml/m 2,以及流速為45-50ml/min。所述膜首先用 1011^的似?04、15011^的似(：1、？!17.4來(lái)準(zhǔn)備好，繼而對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行過(guò)濾，隨后是用~401111的緩 沖液的追蹤過(guò)濾器(chase fi 1 ter)并且最后該過(guò)濾器被排干。
[0096]目前正在檢驗(yàn)另外的賦形劑，以改進(jìn)從UFDF和0.2um的過(guò)濾處回收最終純化的產(chǎn) 物。此過(guò)程可以從每升收獲的培養(yǎng)基產(chǎn)生大量的產(chǎn)物(至少96%的純度）。另外的純化策略 是本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的。
[0097]潤(rùn)滑素產(chǎn)物的表征
[0098] 電泳
[0099] 全長(zhǎng)潤(rùn)滑素氨基酸骨架的分子量為150,918道爾頓。分子和分子間的糖基化程度 和類(lèi)型不同。本文中作為二聚體的種類(lèi)制備的重組PRG4被認(rèn)為是具有超過(guò)大約450kDa的平 均分子量。單體應(yīng)具有220-280kDa的分子量，且不超過(guò)大約300kDa。
[0100] 圖3示出了rhPRG4的考馬斯亮藍(lán)染色凝膠(Tris-Ac 3-8%NuPAGE:l< SDS-PAGE聚 丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)，Invitrogen)，非還原的（作為純化的）和還原的和烷基化的。所有 編號(hào)的條帶都通過(guò)MS/MS確認(rèn)為潤(rùn)滑素，具有匹配人類(lèi)PRG4的氨基酸序列（UniProt登錄號(hào) Q92954:SEQ ID N0:1)。如所示，如上文所述產(chǎn)生的重組潤(rùn)滑素(NR)含有具有~460kDa的大 約分子量(通過(guò)與分子量標(biāo)準(zhǔn)比較而估計(jì)）的主要條帶，一個(gè)條帶稍稍在之上，以及一個(gè)條 帶在凝膠的頂端未能迀移進(jìn)入該凝膠。
[0101] 翻譯后加工成分的鑒別是用神經(jīng)氨酸苷酶(NaNase 1)和0-糖苷酶DS同時(shí)消化 rhPRG4來(lái)完成的，其暴露出rhPRG4的氨基酸核心的分子量(如圖4中標(biāo)記為L(zhǎng)-N0的泳道內(nèi)所 示）。該核心的預(yù)測(cè)分子量為151kDa，其通過(guò)此4-12%的SDS-PAGE而實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。僅用神經(jīng)氨 酸苷酶消化對(duì)分子量有降低作用，說(shuō)明糖基化對(duì)神經(jīng)氨酸是不完全覆蓋。用〇-糖苷酶DS(其 去除0-連接f3(l-3)GalNAc-Gal殘基)和神經(jīng)氨酸苷酶消化表明該批蛋白大致上30%的重量 被糖基化。僅用〇-糖苷酶消化可能僅在去除一些未覆蓋的GalNAC-Gal殘基時(shí)有作用。
[0102] 糖基化分析
[0103]為了進(jìn)一步表征此蛋白，對(duì)來(lái)自重組潤(rùn)滑素和正?；?rùn)滑素的0-聚糖進(jìn)行了質(zhì) 譜分析和比較。簡(jiǎn)言之，使用DEAE色譜從滑液分離了滑膜潤(rùn)滑素。在轉(zhuǎn)移至PVDF膜之前，使 用3-8%三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽凝膠通過(guò)SDS-PAGE來(lái)分離重組和滑膜潤(rùn)滑素。繼而通過(guò) 還原性β-消除隨后清除而從所述潤(rùn)滑素斑點(diǎn)釋放0-聚糖用于LC-MS/MS分析。在MS/MS分析 前0-聚糖通過(guò)多孔石墨化碳色譜來(lái)分離，其中是在線(xiàn)性捕獲質(zhì)譜上以負(fù)離子模式使用依賴(lài) 于數(shù)據(jù)的方法(LTQ(Thermo Scientific)) 〇
[0104]重組潤(rùn)滑素樣品的分析僅鑒別出1型核心0-聚糖結(jié)構(gòu)（圖6)。展示所鑒別的聚糖的 提取的離子色譜在圖7中示出。唾液酸化的結(jié)構(gòu)，[M-H]_675,顯示為兩個(gè)主要的峰。它們是 相同的異構(gòu)體，滯留時(shí)間21.4min的第二個(gè)峰是β-消除過(guò)程中創(chuàng)建的化學(xué)衍生物。鑒別出了 3個(gè)硫酸化結(jié)構(gòu)（[M-H]-464)的異構(gòu)體。還鑒別出了單硫酸化單唾液酸化結(jié)構(gòu)的幾個(gè)異構(gòu) 體。二唾液酸化的結(jié)構(gòu)的豐度很低且不能在色譜中觀察到。對(duì)所鑒別的每種聚糖的比例的 估計(jì)在表1中示出(對(duì)于糖結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，參見(jiàn)圖6)。此分析組合了表1中每種結(jié)構(gòu)的所有的異 構(gòu)體、衍生物和加合物。
[0105]表1.在重組潤(rùn)滑素上所鑒別的每種聚糖的百分比。該數(shù)據(jù)包括表中所列的每種結(jié) 構(gòu)的所有異構(gòu)體、衍生物和加合物。
[0107]正常人類(lèi)滑膜潤(rùn)滑素具有較大范圍的聚糖延伸至2型核心結(jié)構(gòu)中（圖8)。這些結(jié)構(gòu) 中最富集的在圖9中示出（提取離子色譜上）。
[0108] 重組人潤(rùn)滑素的糖基化模式與天然人類(lèi)糖蛋白有很大差異，這可以容易理解，例 如，從圖7與圖9的比較。在天然滑膜潤(rùn)滑素上，唾液酸化的1型核心結(jié)構(gòu)是最富集的聚糖，但 是存在各種類(lèi)型的顯著量的2型核心糖基化，以及僅僅少量的硫酸化的多糖。在重組糖蛋白 上，唾液酸化的和未修飾的1型核心構(gòu)成了聚糖的超過(guò)半數(shù)，而硫酸化的1型核心結(jié)構(gòu)構(gòu)成 所鑒別的〇-聚糖的大約三分之一，其中鑒別出了所有三種可能的異構(gòu)體。
[0109] 重組人潤(rùn)滑素的物理化學(xué)性質(zhì) [0110] 類(lèi)表面活性劑(兩親性)性質(zhì)
[0111] rhPRG4的一種重要貢獻(xiàn)是其通過(guò)物理化學(xué)吸附而涂敷生物和非生物表面的能力。 天然PRG4是表面活性的，并且摻入了由大的類(lèi)粘液素結(jié)構(gòu)域分隔的末端球狀結(jié)構(gòu)域。這些 可以在其結(jié)構(gòu)中分為極性和非極性結(jié)構(gòu)域。中心粘液素結(jié)構(gòu)域(如人類(lèi)滑液潤(rùn)滑素的表面 力儀器研究所顯示的），可以折疊回其自身，表明在實(shí)現(xiàn)了此種取向時(shí)糖基化是朝外的。整 體而言，粘液素結(jié)構(gòu)域變得比其N(xiāo)或C末端都更加親水。其重要性通過(guò)了解糖基化的消化回 去除潤(rùn)滑能力而得以確認(rèn)(Jay等，J Glycobiol 2001)。此種兩性分子特性也存在于rhPRG4 中。這可以通過(guò)對(duì)脂和水交界面之間界面張力降低的評(píng)估來(lái)進(jìn)行測(cè)量。
[0112] 在使用本發(fā)明的方法而設(shè)計(jì)用于測(cè)試重組人潤(rùn)滑素的表面活性劑性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中， 在PBS溶液中存在濃度增加的rhPRG4(其由未稀釋的、疏水的環(huán)己烷所覆蓋）。將置于含有 rhPRG4的水亞相的Du NoUy環(huán)向上拉，并記錄了該環(huán)突破交界面的臨界張力(fi)。在 Attension Sigma 702ET張力計(jì)中對(duì)每個(gè)濃度收集5次測(cè)量。針對(duì)fi將rhPRG4濃度的劑量反 應(yīng)曲線(xiàn)作圖，參見(jiàn)圖10A。如所示，隨著含PBS的水亞相中rhPRG4濃度的提高，界面張力降低。 [0113]因?yàn)橹亟M人潤(rùn)滑素溶液含有殘留的非離子表面活性劑(Tween 20)，重復(fù)了該實(shí)驗(yàn) 以研究這是否是造成添加重組產(chǎn)物后所誘導(dǎo)的表面張力大幅下降的原因，首先僅使用各種 濃度的表面活性劑，繼而使用很低濃度的本發(fā)明的rhPRG4。將微升量的表面活性劑和PRG4 添加至15mL的水亞相。結(jié)果顯示于圖10B和圖10C中。如所示，僅用PRG4(圖10C)降低表面張 力比僅用商業(yè)表面活性劑要好〇 . 1 % (圖10B)。因而，含有0.1 % Tween和不含有Tween的 rhPRG4降低的PBS和環(huán)己烷的界面張力比僅用0.1 %的Tween更多（所有的都具有相同量的 添加的感興趣溶液）。
[0114] 這些數(shù)據(jù)顯示，即便是在很低的濃度，rhPRG4優(yōu)先位于水脂交界面，降低界面張 力。此現(xiàn)象概括了在減少摩擦以及模擬天然潤(rùn)滑素行為時(shí)所需的表面結(jié)合相互作用。另外， 減少界面張力的活性可以用作rhPRG4生產(chǎn)的質(zhì)量控制程序。
[0115] 潤(rùn)滑性質(zhì)
[0116] 軟骨潤(rùn)滑
[0117] 從骨骼成熟的牛后膝滑膜關(guān)節(jié)的髕股溝，準(zhǔn)備了新鮮的軟骨樣品（n=16)用于摩 擦測(cè)試（如此前所述的）。簡(jiǎn)言之，從軟骨區(qū)塊收獲了內(nèi)核（半徑= 6mm)和外環(huán)（外半徑= 3.2mm以及內(nèi)半徑=1.5mm)，二者均具有中央孔(半徑=0.5mm)使得流體可以泄壓。在PBS中 于4°C將樣品嚴(yán)格清洗過(guò)夜以去除關(guān)節(jié)表面的殘余滑液，并通過(guò)測(cè)試潤(rùn)滑的存在而對(duì)其進(jìn) 行了確認(rèn)。繼而將樣品在具有蛋白酶抑制劑的中于-80 °C冷凍，解凍，再在roS中搖動(dòng)過(guò) 夜以進(jìn)一步清除表面處的任何殘余PRG4。繼而在第二天的測(cè)試前，將樣品于4°C完全浸入大 約0.3ml的各個(gè)測(cè)試潤(rùn)滑劑(下文所述)過(guò)夜，并在下次測(cè)試潤(rùn)滑劑中溫育前，于每次測(cè)試后 再用PBS清洗。
[0118] 使用了BoseElectroforce'、的測(cè)試儀器（ELF 3200，Eden Prairie,Minnesota)來(lái) 分析每種PRG4形式以及對(duì)照的界面潤(rùn)滑能力，其中使用已經(jīng)確立的軟骨-對(duì)-軟骨摩擦測(cè) 試。簡(jiǎn)言之，將所有樣品以0.002mm/s的恒定速率壓至18 %的總軟骨厚度，并允許其應(yīng)力松 弛40分鐘以使組織液泄壓。繼而將樣品以已知的有效速度旋轉(zhuǎn)以在泄壓的軟骨-軟骨交界 面保持界面模式潤(rùn)滑(〇.3mm/s)( ±2運(yùn)轉(zhuǎn)(revolutions))。在留在預(yù)滑動(dòng)的1200、120、12和 1.2秒的靜止期之后，在每個(gè)隨后的靜止期之后旋轉(zhuǎn)樣品，+/-2運(yùn)轉(zhuǎn)。以相反的旋轉(zhuǎn)方向重 復(fù)測(cè)試順序，_/+2運(yùn)轉(zhuǎn)。
[0119] 兩個(gè)測(cè)試順序評(píng)估了 rhPRG4的軟骨界面潤(rùn)滑能力（單獨(dú)以及與HA組合）。在兩個(gè)測(cè) 試順序中，PBS都用作陰性對(duì)照潤(rùn)滑劑而牛滑液用作陽(yáng)性對(duì)照潤(rùn)滑劑。rhPRG4和純化的天然 牛PRG4都在PBS中以450yg/mL的濃度制備，而HA( 1 · 5MDA Lif ecore Biomedical，Chaska， 麗)也在1?S中以3 · 3 3mg/mL的生理濃度制備。潤(rùn)滑劑以推測(cè)的潤(rùn)滑能力次序（摩擦系數(shù)降 序）來(lái)進(jìn)行了測(cè)試。在測(cè)試順序1中，rhPRG4vs. nbPRG4，順序?yàn)镻BS、rhPRG4、nbPRG4、滑液(η =7);在順序2 中，rhPRG4vs · rhPRG4+HA，順序?yàn)镻BS、rhPRG4、rhPRG4+HA、滑液(η = 4)。
[0120] 對(duì)于此前所描述的每個(gè)潤(rùn)滑劑，計(jì)算了兩個(gè)摩擦系數(shù);靜態(tài)的(μ觀?,ΝμΚ從靜止?fàn)?起始運(yùn)動(dòng)的阻力)和動(dòng)態(tài)的施，Neq>)(穩(wěn)定滑動(dòng)的阻力）。結(jié)果在圖11和12中示出。數(shù)據(jù)以 均值土 SEM給出。使用了 AN0VA來(lái)評(píng)估潤(rùn)滑劑的作用以及預(yù)滑動(dòng)靜止期作為μ縮、Neq和<μ5施， Neq>的重復(fù)因素，其中在1.2s的預(yù)滑動(dòng)靜止期對(duì)<μ5施，Neq>進(jìn)行Tukey事后測(cè)試。用Systatl2 (Systat Software, Inc.，Richmond，CA)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0121] 如圖11中所示，所測(cè)量的重組PRG4的潤(rùn)滑性質(zhì)、動(dòng)態(tài)摩擦系數(shù)，與天然牛PRG4稍低 的值之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。如圖12中所示，與僅有rhPRG4相比，rhPRG4與HA組合改善了靜 態(tài)（圖12A)和動(dòng)態(tài)（圖12B)潤(rùn)滑性。所有的測(cè)定都在PBS中最高而在?；褐凶畹停襯h-PRG4與rhPRG4+HA為中等。rhPRG4+HA的混合溶液趨向于比僅有rhPRG4顯著更低的摩擦系數(shù) (p = 0.075)并且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與牛滑液類(lèi)似(0.021 ±0.001，p = 0.20)。
[0122] 也嘗試了使用2小時(shí)的透明質(zhì)酸酶消化來(lái)確保從要用作軸承(bearings)的牛軟骨 去除天然潤(rùn)滑素。透明質(zhì)酸酶消化是要用于從軟骨外植體的淺表層去除天然PRG4(P〈 0.050)。此種處理去除了表面PRG4而未顯著影響關(guān)節(jié)軟骨的機(jī)械特征。將rhPRG4應(yīng)用于這 些表面并比較對(duì)BSF和PBS對(duì)照的摩擦反應(yīng)，這顯示出使用本發(fā)明的rhPRG4可以重建低COF。 圖13顯示經(jīng)透明質(zhì)酸酶處理的牛內(nèi)髁軟骨外植體(具有rhPRG4)的COF值，BSF和PBS作為居 間潤(rùn)滑劑。根據(jù)上文所述的方案依照前述潤(rùn)滑劑測(cè)試了軟骨外植體。如所示，重組類(lèi)人PRG4 重建了低C0F(rhPRG4N = 18 ;BSF N=6 ;PBS(N=8)。
[0123] 眼睛表面潤(rùn)滑
[0124] 具有3mm的鞏膜的正常人類(lèi)眼角膜得自Southern Alberta Lions Eye Bank。人類(lèi) 眼瞼從來(lái)自卡爾加里大學(xué)的遺體捐贈(zèng)項(xiàng)目的新鮮尸體獲得。這些組織的使用許可以及批準(zhǔn) 從Health Research Ethics Board獲得。將眼角膜(n = 6)儲(chǔ)存在4°C的基于硫酸軟骨素的 眼角膜儲(chǔ)存介質(zhì)(Optisol-GS)中并在兩周內(nèi)使用。眼瞼(n = 6)被冷凍并在使用時(shí)解凍。
[0125] 通過(guò)3-8%的三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽NUPAGE十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電 泳評(píng)估所述rhPRG4種類(lèi)的純度為50%。對(duì)富集的rhPRG4制品的濃度進(jìn)行了測(cè)定并調(diào)整為將 純度水平納入考量。
[0126] 將組織樣品裝載于具有軸向和旋轉(zhuǎn)執(zhí)行器、以及軸向載荷和扭矩傳感器的Bose ELF3200上。通過(guò)向鞏膜應(yīng)用腈基丙烯酸酯粘合劑(強(qiáng)力膠），而將切片的眼角膜固定在半球 形硅橡膠塞(半徑= 6mm)的末端。在眼角膜-塞裝置周?chē)仓霉柘鹉z管套，其用于保持住潤(rùn) 滑劑流體。繼而將此裝置附著至所述Bose ELF3200的旋轉(zhuǎn)執(zhí)行器，由此形成底部關(guān)節(jié)連接 表面。從模型]^MS材料（~0.4mm厚的UntrSylgard 184，Dow Corning,)或者人眼瞼組織鉆 出了外環(huán)(外半徑=3.2_，內(nèi)半徑=1.5mm)，并粘合至外環(huán)支持物。繼而將此外環(huán)支持物附 著至線(xiàn)性執(zhí)行器，由此形成上部關(guān)節(jié)連接表面。
[0127] 在裝載完樣品之后，將0.3ml的測(cè)試潤(rùn)滑劑置于眼角膜上以形成潤(rùn)滑劑浴，并且用 測(cè)試潤(rùn)滑劑將關(guān)節(jié)連接表面平衡至少5分鐘。將所述組織樣品于三個(gè)人工確定的軸向位置 與相應(yīng)的0.3±0.02、0.5±0.03、和0.7±0.03_勺軸向載荷接觸，導(dǎo)致軸向壓力范圍在12.2 至28.5kPa(基于24.6mm 2的接觸面積。一旦在給定軸向位置接觸，所述樣品在兩個(gè)方向都以 4個(gè)不同的有效速度(veff = 30、10、l .0、0.3mm/s)進(jìn)行4次運(yùn)轉(zhuǎn)，其中veff= ω · reff以及reff = 2/3[0-03-η3)/0-02-η2)]。在旋轉(zhuǎn)期間于20Hz收集了軸向載荷以及力矩。每次運(yùn)轉(zhuǎn)之間 有12秒的保壓時(shí)間。每個(gè)測(cè)試順序(下文所述)包括了預(yù)處理步驟，其中所述組織在鹽水浴 中進(jìn)行所述的測(cè)試方案。
[0128] 為了確定rhPRG4制品在人類(lèi)眼角膜-眼瞼（測(cè)試1)和在人類(lèi)眼角膜-聚二甲硅氧烷 (PDMS，測(cè)試2)的交界面處的界面潤(rùn)滑能力，使用了如下測(cè)試順序:鹽水中300yg/mL的PRG4， 鹽水中300yg/mL的rhPRG4,接著鹽水（Sensitive Eyes Saline Plus,Bausch&Lomb)〇
[0129] 為了評(píng)估測(cè)試潤(rùn)滑劑在該兩個(gè)交界面處的效力，計(jì)算了靜態(tài)和動(dòng)態(tài)的摩擦系數(shù)。 如圖14中所示，PRG4和PRG4,二者都顯著地且類(lèi)似地，在人類(lèi)眼角膜-PDMS交界面處(參見(jiàn)圖 14C和14D)和在眼角膜眼瞼交界面處（圖14A和14B)降低了摩擦。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 制備重組潤(rùn)滑素糖蛋白的方法，包括以下步驟： 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，所述中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞轉(zhuǎn)染有人類(lèi) PRG4基因，并且其在足以產(chǎn)生潤(rùn)滑素糖蛋白的時(shí)間里和培養(yǎng)條件下表達(dá)所述人類(lèi)PRG4基因 并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行翻譯后糖基化，其中所產(chǎn)生的潤(rùn)滑素糖蛋白包含至少30%重量的糖苷殘 基，在培養(yǎng)基中濃度為至少〇. 4g/升，和 從所述培養(yǎng)基純化潤(rùn)滑素糖蛋白。2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述CHO細(xì)胞是包含編碼人類(lèi)PRG4基因的核酸的CHO-M細(xì)胞。3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染有第一載體和第二載體，其中所述第一 載體包含編碼染色質(zhì)元件的核酸，而所述第二載體包含編碼人類(lèi)PRG4基因的核酸。4. 權(quán)利要求3的方法，其中所述染色質(zhì)元件是邊界元件、基質(zhì)附著區(qū)、基因座控制區(qū)或 通用染色質(zhì)開(kāi)放元件。5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述染色質(zhì)元件是基質(zhì)附著區(qū)。6. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中在足以產(chǎn)生這樣的潤(rùn)滑素糖蛋白的時(shí)間里和培養(yǎng) 條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，所述潤(rùn)滑素糖蛋白在培養(yǎng)基中濃度為至少〇. 5g/升。7. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中在足以產(chǎn)生這樣的潤(rùn)滑素糖蛋白的時(shí)間里和培養(yǎng) 條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，所述潤(rùn)滑素糖蛋白在培養(yǎng)基中濃度為至少〇. Sg/升。8. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中在足以產(chǎn)生這樣的潤(rùn)滑素糖蛋白的時(shí)間里和培養(yǎng) 條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，所述潤(rùn)滑素糖蛋白在培養(yǎng)基中濃度為至少1.0 g/升。9. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中在足以產(chǎn)生這樣的潤(rùn)滑素糖蛋白的時(shí)間里和培養(yǎng) 條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，所述潤(rùn)滑素糖蛋白在培養(yǎng)基中濃度為至少2. Og/升。10. 權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中至少95%重量的所述潤(rùn)滑素糖蛋白的糖基化是1 型核心糖基化。11. 權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中至少99%重量的所述潤(rùn)滑素糖蛋白的糖基化是1 型核心糖基化。12. 權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中與天然人類(lèi)潤(rùn)滑素相比，所述糖苷殘基富含硫酸 化的糖側(cè)鏈。13. 權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中所述潤(rùn)滑素糖蛋白包含這樣的多聚體蛋白，其所 產(chǎn)生的在軟骨對(duì)軟骨摩擦測(cè)試中測(cè)量的靜態(tài)摩擦系數(shù)不超過(guò)純化的天然牛潤(rùn)滑素靜態(tài)摩 擦系數(shù)的150 %。14. 權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中所述潤(rùn)滑素糖蛋白包含這樣的多聚體蛋白，其所 產(chǎn)生的在軟骨對(duì)軟骨摩擦測(cè)試中測(cè)量的靜態(tài)摩擦系數(shù)不超過(guò)純化的天然牛潤(rùn)滑素靜態(tài)摩 擦系數(shù)的120 %。15. 權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中所述潤(rùn)滑素糖蛋白包含這樣的多聚體蛋白，其所 產(chǎn)生的在軟骨對(duì)軟骨摩擦測(cè)試中測(cè)量的靜態(tài)摩擦系數(shù)不超過(guò)純化的天然牛潤(rùn)滑素靜態(tài)摩 擦系數(shù)的110 %。16. 權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法，其中所述潤(rùn)滑素糖蛋白包含從所述培養(yǎng)基中共純化 的并且混雜有多聚體潤(rùn)滑素種類(lèi)的單體潤(rùn)滑素種類(lèi)。17. 權(quán)利要求13-15任一項(xiàng)的方法，其中所述潤(rùn)滑素糖蛋白包含二聚體潤(rùn)滑素種類(lèi)。18. 權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的方法，其中所述潤(rùn)滑素糖蛋白包含至少5個(gè)經(jīng)二硫鍵或者經(jīng) 非共價(jià)連結(jié)的個(gè)體糖基化氨基酸鏈，并且具有至少1200kDa的分子量。19. 權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞在至少10、50、或100升的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)。20. 權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的方法，其中所述潤(rùn)滑素糖蛋白包含至少35 %重量的糖苷殘 基。21. 由權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的方法所生產(chǎn)的潤(rùn)滑素糖蛋白。22. 物質(zhì)的組合物，其包含： 在宿主細(xì)胞培養(yǎng)中從人類(lèi)PRG4基因表達(dá)的重組多聚體潤(rùn)滑素糖蛋白，其包含至少30% 重量的糖苷殘基，并且其所產(chǎn)生的在軟骨對(duì)軟骨摩擦測(cè)試中測(cè)量的動(dòng)態(tài)摩擦系數(shù)不超過(guò)純 化的天然牛潤(rùn)滑素的動(dòng)態(tài)摩擦系數(shù)的150%。23. 權(quán)利要求22的組合物，其中所述潤(rùn)滑素糖蛋白特征在于，其所產(chǎn)生的在軟骨對(duì)軟骨 摩擦測(cè)試中測(cè)量的動(dòng)態(tài)摩擦系數(shù)不超過(guò)純化的天然牛潤(rùn)滑素的動(dòng)態(tài)摩擦系數(shù)的120%。24. 權(quán)利要求22的組合物，其中所述潤(rùn)滑素糖蛋白特征在于，其所產(chǎn)生的在軟骨對(duì)軟骨 摩擦測(cè)試中測(cè)量的動(dòng)態(tài)摩擦系數(shù)不超過(guò)純化的天然牛潤(rùn)滑素的動(dòng)態(tài)摩擦系數(shù)的110%。25. 權(quán)利要求22-24任一項(xiàng)的組合物，其中所述潤(rùn)滑素糖蛋白包含至少35%重量的糖苷 殘基。26. 權(quán)利要求22-24任一項(xiàng)的組合物，其中所述潤(rùn)滑素糖蛋白包含至少40 %重量的糖苷 殘基。27. 權(quán)利要求22-26任一項(xiàng)的組合物，其中所述潤(rùn)滑素糖蛋白的至少99%重量的糖基化 為1型核心糖基化。28. 權(quán)利要求22-27任一項(xiàng)的組合物，其中與天然人類(lèi)潤(rùn)滑素相比，所述糖苷殘基富含 硫酸化的糖側(cè)鏈。29. 權(quán)利要求22-28任一項(xiàng)的組合物，還包含混雜有多聚體潤(rùn)滑素種類(lèi)的單體潤(rùn)滑素種 類(lèi)。30. 權(quán)利要求22-29任一項(xiàng)的組合物，包含二聚體潤(rùn)滑素種類(lèi)。31. 權(quán)利要求22-30任一項(xiàng)的組合物，其包含這樣的潤(rùn)滑素種類(lèi)，所述潤(rùn)滑素種類(lèi)包含 至少5個(gè)經(jīng)二硫鍵或者經(jīng)非共價(jià)連結(jié)的個(gè)體糖基化氨基酸鏈，具有至少1200kDa的分子量。32. 權(quán)利要求22-31任一項(xiàng)的組合物，還包含與所述潤(rùn)滑素糖蛋白混雜的透明質(zhì)酸或其 鹽。33. 權(quán)利要求22-32任一項(xiàng)的組合物，用于制備藥物，所述藥物用于通過(guò)粘彈性物補(bǔ)充 療法治療滑膜關(guān)節(jié)。34. 權(quán)利要求22-32任一項(xiàng)的組合物，用于制備局部應(yīng)用于組織表面的藥物。35. 權(quán)利要求22-32任一項(xiàng)的組合物，用于制備治療干眼病的藥物。36. 權(quán)利要求22-32任一項(xiàng)的組合物，用于制備藥物，所述藥物用于在手術(shù)期間應(yīng)用于 體表以抑制隨后形成粘連或纖維性結(jié)締組織。37. 權(quán)利要求22-32任一項(xiàng)的組合物，用于制備藥物，所述藥物用于全身性注射以抑制 細(xì)胞-細(xì)胞粘連或者在脈管內(nèi)的運(yùn)動(dòng)。38. 包含溶液的組合物，所述溶液包含100g的人類(lèi)潤(rùn)滑素，其中所述潤(rùn)滑素包含糖基 化，所述糖基化的至少99 %重量為1型核心糖基化。39. 權(quán)利要求38的組合物，其中所述人類(lèi)潤(rùn)滑素是重組人類(lèi)潤(rùn)滑素。40. 權(quán)利要求38或39的組合物，其中所述溶液中潤(rùn)滑素的濃度為至少0.5g/L。
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK105899527SQ201480065482
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年10月22日
【發(fā)明人】T·施密特, G·D·杰伊
【申請(qǐng)人】盧布里斯有限責(zé)任公司