一種快速制備高純度葉綠素和葉綠素降解產(chǎn)物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速制備高純度葉綠素和葉綠素降解產(chǎn)物的方法。本發(fā)明首次采用溫州蜜柑果皮和甘薯葉片為原料來制備葉綠素及其衍生物，提供的方法不僅取材方便、快速、成本低，而且易操作，可以在三天內(nèi)完成全部8種產(chǎn)物的制備，所得產(chǎn)品純度可以達到90%?95%，成本遠遠低于同種進口標準品的價格。本方法可以高效快速制備實驗所需毫克級的葉綠素及其衍生物的標準對照品，適合在商業(yè)實驗室及企業(yè)推廣使用，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種快速制備高純度葉綠素和葉綠素降解產(chǎn)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于化學和酶學的交叉領(lǐng)域，具體涉及一種快速制備高純度葉綠素和葉綠 素降解產(chǎn)物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前實驗室分析葉綠素及其降解產(chǎn)物時，通常使用進口品牌的標準對照品作為參 照。這些標準對照品通常由制備型薄層色譜(TLC)和制備型HPLC提純自菠菜葉片和綠藻等 材料，純度常為90 %-98 %，通常純度越高，價格越貴。進口葉綠素標準品常存在供貨期長 (一周至一個月），價格昂貴（以進口品牌sigma的葉綠素 a為例，每毫克價格在6000-8000RMB)，分裝及運輸過程易見光降解，低溫保存造成運輸不便等問題。由于進口標準品購 買過程的上述不便，且分析樣品中葉綠素時標準品用量較大，實驗成本很高，因此實驗室亟 需一種葉綠素及其降解產(chǎn)物標準品的快速制備方法，然而，目前并無這方面的報道。本方法 不僅取材方便、快速、成本低，而且易操作，可以在三天內(nèi)完成全部實驗，所得產(chǎn)品純度可以 達到90%-95%，成本遠遠低于同種進口標準品的價格。本方法可以高效快速制備實驗所需 毫克級的葉綠素及其衍生物的標準對照品，適合在商業(yè)實驗室及企業(yè)推廣使用，具有廣泛 的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速制備高純度葉綠素和葉綠素降解產(chǎn)物的方法，該 方法可快速分離制備葉綠素 a和葉綠素 b及其降解產(chǎn)物，方法快速簡單、易操作、成本低。通 過該方法獲得的葉綠素及其降解產(chǎn)物純度達到90%_95%，可以作為標準品使用，或其他商 品化用途，為葉綠素相關(guān)的生理生化提供可靠的標準品做參照。
[0004] 為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0005] -種快速制備高純度葉綠素和葉綠素降解產(chǎn)物的方法，包括：
[0006] (1)材料準備:新鮮蔬菜葉片和新鮮柑橘果實洗凈晾干，將新鮮柑橘自果皮表層削 取的0.2~0.3mm厚度的表皮，作為新鮮柑橘果皮，備用；
[0007] 優(yōu)選的，蔬菜葉片為將市場上購買來的新鮮蔬菜(菠菜、甘薯葉等)摘選葉片，挑除 老葉和黃葉并去掉葉柄，洗凈后陰暗處晾干。新鮮柑橘，果皮帶綠，成熟度以色差指數(shù)(：1為_ 2.0~2.0，清水洗凈，瞭干；
[0008] (2)總?cè)~綠素的提取，以下步驟在避光條件下進行：
[0009] a.將（1)中洗凈晾干的蔬菜葉片稱取100g，用液氮冷凍，在研缽或樣品破碎儀中磨 成細粉；
[0010] b.將樣品粉末與提取液(N，N-二甲基甲酰胺，含0.1%碳酸鎂^八)按4:2!^的比 例混合。超聲清洗儀100 %功率（100W)，冰浴超聲20min~30min，期間上下混勻樣品數(shù)次。 4000g~5000g離心5min~lOmin，取上清。沉淀按上述樣品粉末與提取液的比例重新加入提 取液抽提。重復冰浴超聲、離心和取上清過程，直至殘渣無色，將收集的上清合并；
[0011] c.合并的上清分裝至250mL分液漏斗中，每個分液漏斗100mL，按1:1的體積比加入 正己烷混合，充分振蕩后靜置至完全分層。棄上層正己烷相(含類胡蘿卜素），下層放入新的 分液漏斗中，按上述上清與正己烷的體積比重新加入正己烷，繼續(xù)振蕩后靜置分層，棄上層 正己烷相，重復該步驟至上層無色，合并下層液；
[0012] d .下層液與正己烷按4 : 1的體積比混合，劇烈振蕩后-20 °C冰箱中放置2~3h。 4000g~5000g離心10min~15min，移除最上層白色乳油狀物及中間層正己燒相。按下層液 和正己燒1:1的體積比繼續(xù)加入正己燒，劇烈振蕩后4000g~5000g離心10min，移除上層，重 復該步驟至上層無色，移除上層保留下層液；
[0013] e .下層液與10 %氯化鈉水溶液按體積比1:5~6混合，振蕩lmin，4000g~5000g離 心5min，收集上清。剩余下層繼續(xù)與無水乙醚按10:1的體積比混合，振蕩lmin，靜置至分層， 收集上清，重復該步驟一遍，將收集的上清合并。加入等體積的1:1 (v/v)的正己燒:無水乙 醚溶液混合后，再加入5倍體積的10 %氯化鈉水溶液，振蕩lmin，靜置至分層，收集合并上層 液。合并的上層液加入等體積的正己烷，振蕩后加入無水硫酸鈉至無結(jié)塊。上清在避光條件 下30°C真空濃縮儀中干燥或者氮氣吹干，樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱中-80°C長期保存或 者-20°C短期保存，得葉綠素粗提干燥物；
[0014] (3)葉綠素 a和葉綠素 b(chlorophyll a和chlorophyll b)的分離:稱取步驟(2)中 所得總?cè)~綠素粗提干燥物l〇mg，用1:1 (v/v)的甲醇:丙酮溶解，配成終濃度2mg/mL，8000g~ 12000g離心10min~15min，上清經(jīng)0.22μηι微孔濾膜過濾后分裝至2mL上樣瓶中?？砂闯Ｒ?guī)方 式的液相色譜分離法進行葉綠素 a和葉綠素 b的分離。
[0015] 優(yōu)選的：實驗室常見的分析型、半制備型或者制備型的液相色譜儀(配備TOA(二極 管陣列檢測器)或紫外可見光檢測器)使用常用的C 18色譜柱，均可用于葉綠素 a和葉綠素 b的 分離。流動相A為甲醇，流動相B為甲醇:丙酮=1:1;用50 %流動相A+50 %流動相B等度洗脫， 分別收集chlorophyll a色譜峰和chlorophyll b色譜峰的餾分，避光條件下，30°C真空濃 縮儀中干燥或者常溫下氮氣吹干，樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱中_80°C長期保存或者-20 °C短期保存；
[0016] (4)脫鎂葉綠素 a和脫鎂葉綠素 b(pheophytin a和pheophytin b)的制備
[0017] (a)脫鎂葉綠素 a(pheophytin a)的制備:稱取2mg步驟(3)中分離干燥所得的葉綠 素 a，于10mL離心管中用4mL無水乙醚溶解配制成500yg/mL。逐滴滴入13%的鹽酸進行酸化， 每加一滴鹽酸充分振蕩，至溶液變成黑色后立即停止。離心管中加入4mL雙蒸水，振蕩10秒， 靜置分層后吸走下層水相。繼續(xù)加入4mL雙蒸水，振蕩靜置分層后吸走下層水相，重復該步 驟數(shù)次，用PH試紙測定下層水相的酸堿度在6.8-7.2時停止加入雙蒸水。4000g~5000g離心 lOmin，收集上清。避光條件下，30 °C真空濃縮儀中干燥或者常溫下氮氣吹干，樣品用錫箱紙 包裹避光，冰箱中-80°C長期保存或者-20°C短期保存；
[0018] (b)脫鎂葉綠素 b(pheophytin b)的制備:稱取2mg步驟(3)中分離干燥所得的葉綠 素 b，于10mL離心管中用4mL無水乙醚溶解配制成500yg/mL。逐滴滴入30%的鹽酸進行酸化， 每加一滴鹽酸充分振蕩，至溶液變成黑色后立即停止。后續(xù)操作同（a)中所述步驟，樣品用 錫箱紙包裹避光，冰箱中_80°C長期保存或者-20°C短期保存；
[0019] (5)脫植基葉綠素 a和脫植基葉綠素 b(chlorophyllide a和chlorophyllide b)的 制備
[0020] (a)粗酶提取液的準備:稱取步驟（1)中的新鮮柑橘果皮100g，液氮冷凍后，在研缽 或樣品破碎儀中磨成細粉末。每g樣品粉末中加入lmL-20 °C預冷的丙酮，混勻后，超聲清洗 儀100%功率（100￥)，冰浴超聲10111；[11~15111；[11。400(^~500(^離心5111；[11~10111；[11，棄上清，沉 淀繼續(xù)加入100mL-20°C預冷的丙酮，重復上述冰浴超聲、離心、棄上清的過程2~3遍。棄上 清后，沉淀在牛皮紙上攤開，通風櫥中吹5min至干后倒入研缽，加入液氮，研磨成細粉。沉淀 繼續(xù)加入50mL-20°C預冷的丙酮，超聲清洗儀100%功率（100W)，冰浴超聲lOmin~15min， 4000g~5000g離心5min~lOmin，棄上清，重復上述冰浴超聲、離心和棄上清的過程3~4遍 至沉淀完全無色。每l00g新鮮柑橘果皮得到的無色沉淀加入50mL緩沖液(丙酮:0.211'1^8-HC1 (PH=8.0) = 1:1)，充分攪勻所得懸濁液即為1份粗酶提取液；
[0021] (b)脫植基葉綠素 a的制備:稱取5mg步驟(3)中分離干燥所得的葉綠素 a，無水乙醚 溶解配制成500yg/mL，加入1份粗酶提取液混合，用緩沖液補足至100mL。水浴鍋中42 °C反應(yīng) 2h，期間振蕩樣品數(shù)次或者磁力攪拌器上42°C恒溫攪拌反應(yīng)2h;4000g~5000g離心10min， 收集上清。避光條件下，30°C真空濃縮儀中干燥或者常溫下氮氣吹干，樣品用錫箱紙包裹避 光，冰箱中-80 °C長期保存或者-20 °C短期保存；
[0022] (c)脫植基葉綠素 b的制備:稱取5mg步驟(3)中分離干燥所得的葉綠素 b，后續(xù)操作 同(b)中所述步驟，樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱中-80°C長期保存或者-20°C短期保存； [0023] (6)脫儀葉綠酸甲酯a和脫儀葉綠酸甲酯b(pheophorbide a和pheophorbide b)的 制備
[0024] (a)脫鎂葉綠酸甲酯a的制備:稱取2mg步驟(5)中干燥所得脫植基葉綠素 a，10mL離 心管中無水乙醚溶解配制成500yg/mL。逐滴滴入13%的鹽酸進行酸化，每加一滴充分振蕩， 至溶液變成黑色后立即停止。離心管中加入4mL雙蒸水，振蕩10秒，靜置分層后吸走下層水 相。繼續(xù)加入4mL雙蒸水，振蕩靜置至分層后吸走下層水相，重復該步驟數(shù)次，用PH試紙測定 下層水相的pH在6.8-7.8時停止加入雙蒸水。4000g~5000g離心10min，收集上清，避光條件 下，30°C真空濃縮儀中干燥或者常溫下氮氣吹干，樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱中-80°C長 期保存或者_20°C短期保存；
[0025] (b)脫鎂葉綠酸甲酯b的制備:稱取2mg步驟(5)中干燥所得脫植基葉綠素 b，后續(xù)操 作同(a)中所述步驟，樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱中-80°C長期保存或者-20°C短期保存。
[0026] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和顯著的效果：
[0027]本發(fā)明提供的方法，不僅快速、低成本，而且簡單、易操作。本方法所用高效液相色 譜(HPLC)為實驗室較為常見的儀器，半制備及分析型HPLC均可滿足小量分離制備葉綠素 a 和葉綠素 b及其衍生物的需求。這是首次采用柑橘果皮和蔬菜葉片為原料來制備葉綠素及 其衍生物。本方法可以在三天內(nèi)單人次完成全部實驗，所得產(chǎn)品純度可以達到90 %-95 %， 成本遠遠低于同種進口標準品的價格?？梢愿咝Э焖僦苽鋵嶒炈韬量思壍娜~綠素及其衍 生物的標準對照品，適合在商業(yè)實驗室及企業(yè)推廣使用，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0028]本發(fā)明實施例中所述技術(shù)方案如未特別說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。
[0029] 實施例1:
[0030]葉綠素 a和葉綠素 b的提純制備
[0031] (1)材料準備:將市場上購買來的新鮮甘薯葉摘選葉片，挑除老葉和黃葉并去掉葉 柄，洗凈后陰暗處晾干備用。將市場上購買來的新鮮溫州蜜柑(色差指數(shù)CI為-2.0~0.0)清 水洗凈，晾干，備用；
[0032] (2)總?cè)~綠素的提?。ㄒ韵虏襟E在避光條件下進行）：
[0033] a.將（1)中洗凈晾干的甘薯葉片稱取100g，用液氮冷凍，在研缽或樣品破碎儀 (IKA，德國）中磨成細粉；
[0034] b.將樣品粉末倒入500mL離心瓶中（Beckman)，加入200mL提取液(N，N-二甲基甲酰 胺，含〇. 1 %碳酸鎂，w/ν)混勻。超聲清洗儀100%功率（100W)，冰浴超聲20min，期間上下混 勾樣品數(shù)次。5000g離心5min，取上清。沉淀重新加入200mL提取液抽提。重復冰浴超聲、離心 和取上清過程，直至殘渣無色，將收集的上清合并(約1 OOOmL);
[0035] c.合并的上清分裝至250mL分液漏斗中，每個分液漏斗100mL，按1:1的體積比加入 正己烷混合，充分振蕩后靜置lmin至完全分層。棄上層正己烷相(含類胡蘿卜素），下層放入 新的分液漏斗中，上清重新加入l〇〇mL正己烷，繼續(xù)振蕩后靜置分層，棄上層正己烷相，重復 該步驟至上層無色，合并下層液；
[0036] d.下層液與正己烷按4:1的體積比混合，劇烈振蕩后冰箱中_20°C放置2h。分裝至 50mL螺口離心管中，5000g離心10min，移除最上層白色乳油狀物及中間層正己燒相。按下層 液和正己烷1:1的體積比繼續(xù)加入正己烷，劇烈振蕩后5000g離心10min，移除上層，重復該 步驟至上層無色，移除上層保留下層液；
[0037] e.合并后分裝入500mL離心瓶中（Beckman)的下層液，與10%氯化鈉水溶液按體積 比1:5混合，振蕩lmin，5000g離心5min，收集上清。剩余下層繼續(xù)與無水乙醚按10:1的體積 比混合，振蕩lmin，靜置至分層，收集上清，重復該步驟一遍，將收集的上清合并。合并的上 清分裝入250mL分液漏斗中，加入等體積的1:1的正己烷:無水乙醚溶液，混合后，再加入5倍 體積的10%氯化鈉水溶液，振蕩lmin，靜置至分層，收集合并上層液。合并的上層液加入等 體積正己烷，振蕩后加入無水硫酸鈉至無結(jié)塊。上清在避光條件下30°C真空濃縮儀中干燥 或者氮氣吹干，獲得葉綠素粗提干燥物約120mg。樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱中-80°C長期 保存或者_20°C短期保存；
[0038] (3)葉綠素 a和葉綠素 b(chlorophyll a和chlorophyll b)的分離:將步驟(2)中所 得總?cè)~綠素粗提干燥物稱重，用1:1(V:V)的甲醇:丙酮溶液溶解，濃度為2mg/mL，12000g超 速離心10min，上清經(jīng)0.22μπι濾膜過濾入上樣瓶中。用于分離葉綠素 a/b的儀器型號及色譜 條件如下：戴安Dionex Ultimate 3000半制備型高效液相色譜，配備Ultimate RS Variable Wavelength Detector檢測器；色譜柱：C0SM0SIL，5Ci8-MS-n，10mm id. X250mm; 流動相A為甲醇，流動相B為甲醇:丙酮=1:1;用50 %流動相A+50 %流動相B等度洗脫，3.0毫 升/min，B等度洗脫，檢測波長為654nm和665nm。葉綠素 a的出峰時間約為9.3min，葉綠素 b的 出峰時間約為7.7min，收集chlorophyll a的色譜峰和chlorophyll b的色譜峰的洗脫餾 分，上清在避光條件下30 °C真空濃縮儀中干燥或者氮氣吹干。樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱 中-80°C長期保存或者_20°C短期保存，分離得到的葉綠素 a和葉綠素 b的指標詳見表1。 [0039] 實施例2:
[0040]葉綠素 a和葉綠素 b的降解產(chǎn)物的制備
[0041 ] (1)脫鎂葉綠素 a和脫鎂葉綠素 b(pheophytin a和pheophytin b)的制備
[0042] (a)脫鎂葉綠素 a(pheophytin a)的制備:稱取2mg實施例1步驟(3)中分離干燥所 得的葉綠素 a，于1 OmL離心管中用4mL無水乙醚溶解配制成500yg/mL。逐滴滴入13 %的鹽酸 進行酸化，每加一滴鹽酸充分振蕩，至溶液變成黑色后立即停止。離心管中加入4mL雙蒸水， 振蕩10秒，靜置分層后吸走下層水相。繼續(xù)加入4mL雙蒸水，振蕩靜置分層后吸走下層水相， 重復該步驟數(shù)次，用PH試紙測定下層水相的酸堿度在6.8-7.2時停止加入雙蒸水。4000g~ 5000g離心10min，收集上清。避光條件下，30 °C真空濃縮儀中干燥或者常溫下氮氣吹干，2mg 的葉綠素 a獲得約1.8mg脫鎂葉綠素 a。樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱中-80°C長期保存或者-20°C短期保存；
[0043] (b)脫鎂葉綠素 b(pheophytin b)的制備:稱取2mg實施例1步驟(3)中分離干燥所 得的葉綠素 b，于1 OmL離心管中用4mL無水乙醚溶解配制成500yg/mL。逐滴滴入30 %的鹽酸 進行酸化，每加一滴鹽酸充分振蕩，至溶液變成黑色后立即停止。后續(xù)操作同（a)中所述步 驟，2mg的葉綠素 b獲得約1.8mg脫鎂葉綠素 b。樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱中-80°C長期保 存或者-20°C短期保存；
[0044] 以上分離得到的脫鎂葉綠素 a和脫鎂葉綠素 b的指標見表1。
[0045] (2)脫植基葉綠素 a和脫植基葉綠素 b(chlorophyllide a和chlorophyllide b)的 制備
[0046] (a)粗酶提取液的準備:將實施例1步驟（1)中準備的新鮮溫州蜜柑自果皮表層用 手術(shù)刀削取〇. 2~0.3mm厚度的表皮。稱取100g表皮，用液氮冷凍，放入研缽中繼續(xù)加入液氮 研磨成細粉末，裝入500mL離心瓶中（Beckman)中。加入100mL-20°C預冷的丙酮，混勾后，超 聲清洗儀100 %功率(100W)，冰浴超聲lOmin。40008離心5min，棄上清，沉淀繼續(xù)加入100mL-20°C預冷的丙酮，重復上述冰浴超聲、離心、棄上清的過程2遍。棄上清后，沉淀在牛皮紙上 攤開，通風櫥中吹5min至干后倒入研缽，加入液氮，研磨成細粉(越細越好）。沉淀繼續(xù)加入 50mL-20°C預冷的丙酮，超聲清洗儀100%功率（100W)，冰浴超聲10min，4000g離心5min，棄 上清，重復上述冰浴超聲、離心和棄上清的過程4遍至沉淀完全無色。每100g新鮮柑橘果皮 得到的無色沉淀加入50mL緩沖液(丙酮:0.2M Tirs-HCl (PH=8.0) = 1:1)，充分攪勻所得懸 濁液即為1份粗酶提取液；
[0047] (b)脫植基葉綠素 a的制備:稱取5mg實施1例步驟(3)中分離干燥所得的葉綠素 a， 無水乙醚溶解配制成500yg/mL，加入1份粗酶提取液混合，用緩沖液補足至100mL。水浴鍋中 42°C反應(yīng)2h，期間振蕩樣品數(shù)次或者磁力攪拌器上42°C恒溫攪拌反應(yīng)2h;4000g離心10min， 收集上清。避光條件下，30°C真空濃縮儀中干燥或者常溫下氮氣吹干，5mg的葉綠素 a獲得約 3.4mg脫植基葉綠素 a。樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱中-80°C長期保存或者-20°C短期保存； [0048] (c)脫植基葉綠素 b的制備:稱取5mg實施1例步驟(3)中分離干燥所得的葉綠素 b， 后續(xù)操作同（b)中所述步驟，5mg的葉綠素 b獲得約3.2mg脫植基葉綠素 b。樣品用錫箱紙包裹 避光，冰箱中_80°C長期保存或者_20°C短期保存；
[0049]以上分離得到的脫植基葉綠素 a和脫植基葉綠素 b的指標見表1。
[0050] (3)脫儀葉綠酸甲酯a和脫儀葉綠酸甲酯b(pheophorbide a和pheophorbide b)的 制備
[0051] (a)脫鎂葉綠酸甲酯a的制備:稱取2mg步驟(2)中干燥所得脫植基葉綠素 a，10mL離 心管中無水乙醚溶解配制成500yg/mL。逐滴滴入13%的鹽酸進行酸化，每加一滴充分振蕩， 至溶液變成黑色后立即停止。離心管中加入4mL雙蒸水，振蕩10秒，靜置分層lmin后吸走下 層水相。繼續(xù)加入4mL雙蒸水，振蕩靜置至分層后吸走下層水相，重復該步驟數(shù)次，用PH試紙 測定下層水相的酸堿度在6.8-7.2時停止加入雙蒸水。4000g離心10min，收集上清，避光條 件下，30°C真空濃縮儀中干燥或者常溫下氮氣吹干，2mg的葉綠素 a獲得約1.7mg脫鎂葉綠酸 甲酯a。樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱中-80°C長期保存或者-20°C短期保存；
[0052] (b)脫鎂葉綠酸甲酯b的制備:稱取2mg步驟(2)中干燥所得脫植基葉綠素 b，后續(xù)操 作同（a)中所述步驟，2mg的葉綠素 b獲得獲得約1.7mg脫鎂葉綠酸甲酯b。樣品用錫箱紙包裹 避光，冰箱中_80°C長期保存或者_20°C短期保存。
[0053]以上分離得到的脫鎂葉綠酸甲酯a和脫鎂葉綠酸甲酯b的指標見表1。
[0054]表1各種制備物純度檢測結(jié)果如下：
[0055]
【主權(quán)項】
1. 一種快速制備高純度葉綠素和葉綠素降解產(chǎn)物的方法，包括： (1) 材料準備:新鮮蔬菜葉片和新鮮柑橘果實洗凈晾干，將新鮮柑橘自果皮表層削取 的0.2~0.3 mm厚度的表皮，作為新鮮柑橘果皮，備用； (2) 總?cè)~綠素的提取，以下步驟在避光條件下進行： a. 將（1)中洗凈晾干的蔬菜葉片稱取100g，用液氮冷凍，在研缽或樣品破碎儀中磨成 細粉； b. 將樣品粉末與提取液按Ig: 2mL的比例混合;超聲清洗儀100%功率，冰浴超聲20min ~30min，期間上下混勾樣品數(shù)次;4000g~5000g離心5min~lOmin，取上清;沉淀按上述樣品粉 末與提取液的比例重新加入提取液抽提;重復冰浴超聲、離心和取上清過程，直至殘渣無 色，將收集的上清合并； 所述的提取液為:N，N-二甲基甲酰胺溶液，含0.1%碳酸鎂，w/v; c. 合并的上清分裝至250 mL分液漏斗中，每個分液漏斗100mL，按I: 1的體積比加入 正己烷混合，充分振蕩后靜置至完全分層；棄上層正己烷相，下層放入新的分液漏斗中，按 上述上清與正己烷的體積比重新加入正己烷，繼續(xù)振蕩后靜置分層，棄上層正己烷相，重復 該步驟至上層無色，合并下層液； d. 下層液與正己烷按4: 1的體積比混合，劇烈振蕩后-20°C冰箱中放置2~3h;4000g~ 5000g離心10min~15min，移除最上層白色乳油狀物及中間層正己燒相； 按下層液和正己烷I: 1的體積比繼續(xù)加入正己烷，劇烈振蕩后4000g~5000g離心 IOmin，移除上層，重復該步驟至上層無色，移除上層保留下層液； e. 下層液與10%氯化鈉水溶液按體積比1: 5~6混合，振蕩lmin，4000g~5000g離心 5min，收集上清;剩余下層繼續(xù)與無水乙醚按10: 1的體積比混合，振蕩I min，靜置至分層， 收集上清，重復該步驟一遍，將收集的上清合并;加入等體積的I: l(v/V)的正己烷：無水 乙醚溶液混合后，再加入5倍體積的10%氯化鈉水溶液，振蕩I min，靜置至分層，合并收集的 上清;加入與上清等體積的正己烷，振蕩后加入無水硫酸鈉至無結(jié)塊;上清在避光條件下30 °C真空濃縮儀中干燥或者氮氣吹干，樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱中-80°C長期保存或者-20°C短期保存，得葉綠素粗提干燥物； (3) 葉綠素3和葉綠素6的分離:稱取步驟(2)中所得總?cè)~綠素粗提干燥物10mg，用I: 1 (v/v)的甲醇：丙酮溶解，配成終濃度2 mg/mL，8000g~12000g離心10min~15min，上清經(jīng)0·22 Mi微孔濾膜過濾后分裝至2mL上樣瓶中； 可按常規(guī)方式的液相色譜分離法進行葉綠素 a和葉綠素△的分離； (4) 脫鎂葉綠素 a和脫鎂葉綠素的制備 (a) 脫鎂葉綠素 a的制備:稱取2mg步驟(3)中分離干燥所得的葉綠素 a，于IOmL離心管中 用4mL無水乙醚溶解配制成500yg/mL;逐滴滴入13%的鹽酸進行酸化，每加一滴鹽酸充分振 蕩，至溶液變成黑色后立即停止;離心管中加入4mL雙蒸水，振蕩10秒，靜置分層后吸走下層 水相;繼續(xù)加入4mL雙蒸水，振蕩靜置分層后吸走下層水相，重復該步驟數(shù)次，用PH試紙測定 下層水相的酸堿度在6.8-7.2停止加入雙蒸水;4000g~5000g離心10min，收集上清;避光條 件下，30°C真空濃縮儀中干燥或者常溫下氮氣吹干，樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱中-80°C 長期保存或者_20°C短期保存； (b) 脫鎂葉綠素6的制備:稱取2mg步驟(3)中分離干燥所得的葉綠素 h于IOmL離心管中 用4mL無水乙醚溶解配制成500yg/mL;逐滴滴入30%的鹽酸進行酸化，每加一滴鹽酸充分振 蕩，至溶液變成黑色后立即停止;后續(xù)操作同（a)中所述步驟，樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱 中-80 °C長期保存或者-20 °C短期保存； (5 )脫植基葉綠素 a和脫植基葉綠素的制備 (a) 粗酶提取液的準備:稱取步驟（1)中的新鮮柑橘果皮100g，液氮冷凍后，在研缽或樣 品破碎儀中磨成細粉末； 每g樣品粉末中加入ImL -20 °C預冷的丙酮，混勻后，超聲清洗儀100%功率，冰浴超聲 10111；[11~15111；[11;400(^~500(^離心5111；[11~10111；[11，棄上清，沉淀繼續(xù)加入1001111^-20°(^預冷的丙 酮，重復上述冰浴超聲、離心、棄上清的過程2~3遍;棄上清后，沉淀在牛皮紙上攤開，通風櫥 中吹5min至干后倒入研缽，加入液氮，研磨成細粉;沉淀繼續(xù)加入50mL -20°C預冷的丙酮， 超聲清洗儀100%功率，冰浴超聲IOmin~15min，4000g~5000g離心5min~IOmin，棄上清，重復 上述冰浴超聲、離心和棄上清的過程3~4遍至沉淀完全無色;每100g新鮮柑橘果皮得到的無 色沉淀加入50mL緩沖液，充分攪勻所得懸濁液即為1份粗酶提取液； 所述的緩沖液為:丙酮:0.2 M Tris-HCl=I: l，v/v，其中0.2 M Tris-HCl 的PH為8.0; (b) 脫植基葉綠素 a的制備:稱取5mg步驟(3)中分離干燥所得的葉綠素 a，無水乙醚溶解 配制成500yg/mL，加入1份粗酶提取液混合，用緩沖液補足至IOOmL;水浴鍋中42 °C反應(yīng)2h， 期間振蕩樣品數(shù)次或者磁力攪拌器上42°C恒溫攪拌反應(yīng)2h;4000g~5000g離心10min，收集 上清;避光條件下，30°C真空濃縮儀中干燥或者常溫下氮氣吹干，樣品用錫箱紙包裹避光， 冰箱中-80 °C長期保存或者-20 °C短期保存； (c) 脫植基葉綠素祕勺制備：稱取5mg步驟(3)中分離干燥所得的葉綠素 h后續(xù)操作同 (b)中所述步驟，樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱中-80°C長期保存或者-20°C短期保存； (6)脫鎂葉綠酸甲酯a和脫鎂葉綠酸甲酯Kpheophorbide a和pheophorbide /?)的制備 (a) 脫鎂葉綠酸甲酯a的制備:稱取2mg步驟(5)中干燥所得脫植基葉綠素 a，IOmL離心 管中無水乙醚溶解配制成500yg/mL;逐滴滴入13%的鹽酸進行酸化，每加一滴充分振蕩，至 溶液變成黑色后立即停止； 離心管中加入4mL雙蒸水，振蕩10秒，靜置分層后吸走下層水相；繼續(xù)加入4mL雙蒸水， 振蕩靜置至分層后吸走下層水相，重復該步驟數(shù)次，用PH試紙測定下層水相的pH在6.8-7.8 時停止加入雙蒸水； 4000g~5000g離心10min，收集上清，避光條件下，30°C真空濃縮儀中干燥或者常溫下 氮氣吹干，樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱中_8〇°C長期保存或者-20°C短期保存； (b) 脫鎂葉綠酸甲酯6的制備:稱取2mg步驟(5)中干燥所得脫植基葉綠素^后續(xù)操作 同(a)中所述步驟，樣品用錫箱紙包裹避光，冰箱中-80°C長期保存或者-20°C短期保存。2. 權(quán)利要求1所述的一種快速制備高純度葉綠素和葉綠素降解產(chǎn)物的方法，其特征在 于:步驟(1)中所述的蔬菜葉片為將市場上購買來的新鮮蔬菜摘選葉片，挑除老葉和黃葉并 去掉葉柄，洗凈后陰暗處晾干;所述的新鮮柑橘果皮為將市場上購買來的新鮮柑橘清水洗 凈，晾干，削取表皮。3. 權(quán)利要求1所述的一種快速制備高純度葉綠素和葉綠素降解產(chǎn)物的方法，其特征在 于:步驟(3)中進行葉綠素3和葉綠素/7的分離時，實驗室常見的分析型、半制備型或者制備 型的液相色譜儀使用常用的C 18色譜柱，均可用于葉綠素3和葉綠素6的分離;流動相A為甲 醇，流動相B為甲醇：丙酮= 1:1;用50%流動相A + 50%流動相B等度洗脫，分別收集 chlorophyll a色譜峰和chlorophyll 色譜峰的飽分，避光條件下，30°C真空濃縮儀中干 燥或者常溫下氮氣吹干，樣品用錫箔紙包裹避光，冰箱中-80 °C長期保存或者_20°C短期保 存。
【文檔編號】C12P17/18GK105906638SQ201610333292
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】程運江, 羅燾, 瞿韻, 李卓然, 劉歡
【申請人】華中農(nóng)業(yè)大學