黨參均一多糖cop-1及其制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種黨參均一多糖COP?1及其制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明從黨參中發(fā)現(xiàn)的一種新的中性均一多糖，經(jīng)丙烯酰胺葡聚糖凝膠（Sephacryl S?200HR）和葡聚糖凝膠（Sephadex G?25）純化得到該多糖，獲得途徑方便；其產(chǎn)品可以進(jìn)一步衍生化如硫酸化或硝酸化衍生，而且還具有增強(qiáng)免疫力的作用以及具有抗Ⅰ型單純皰疹病毒的作用，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值及保健功能。本方法簡(jiǎn)單、科學(xué)合理，只需要經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠柱就可以快速得到高純度的產(chǎn)品。
【專利說(shuō)明】
黨參均一多糖COP-1及其制備方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種藥學(xué)領(lǐng)域，尤其是一種黨參均一多糖cop-ι及其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]黨參(Tfec/ijr Coc/o/3〇Asis)為桔?？泣h參屬植物，干燥根入藥，可補(bǔ)中益氣，健脾益 肺，用于脾肺虛弱，氣短心悸，食少便溏，虛喘咳嗽，內(nèi)熱消咳，為傳統(tǒng)的補(bǔ)益藥。近年來(lái)的研 究報(bào)道，黨參有豐富的化學(xué)成分，主要是揮發(fā)油、生物堿、甙、多糖等。在過(guò)去幾年國(guó)內(nèi)外研 究了多糖的生物活性，明確多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)在理解結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)之間的關(guān)系發(fā)揮重要作 用。在黨參多糖抗單純皰疹病毒的研究中，我們發(fā)現(xiàn)了3k_10kDa分子量的硫酸化黨參多糖 有抗病毒作用。為了探索其抗病毒的活性機(jī)制，則需要更加明確分析黨參多糖的結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是:提供一種黨參均一多糖C0P-1及其制備方法及應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：黨參均一多糖⑶P-1，其特征在于:該多糖是分子量為2100 的β-D-果聚糖，以2-1連接的呋喃型果糖為主該多糖的還原端與α-D-Glc相連。
[0005] 黨參均一多糖C0P-1的制備方法，包括以下步驟： 1) 將干燥黨參塊根，剪切成lcm小節(jié)，用6-10重量倍、且質(zhì)量濃度為60-80%的乙醇回流 3次，乙醇液棄之，將藥渣用6-10重量倍的蒸餾水提2-3次，將水提液減壓濃縮至0.5-1.0g/ ml，加入質(zhì)量濃度為85-95 %乙醇至含醇量達(dá)80 %，靜置過(guò)夜，傾去上清液，沉淀重復(fù)醇沉1 次，冷凍干燥，得淡黃色黨參粗多糖粉末； 2) 將黨參粗多糖粉末完全溶解于蒸餾水中，在3000rpm條件下離心10min，收集上清液， 加入無(wú)水乙醇，使乙醇的體積濃度為30%，得到褐色溶液； 3) 將褐色溶液置于4°C條件下保存，直至出現(xiàn)白色沉淀； 4) 將獲得的白色沉淀進(jìn)行冷凍干燥，得白色粉末； 5) 將每0.5g白色粉末用10ml水溶解后過(guò)Sephacryl S-200 HR柱，以0.2M氯化鈉作為洗 脫液，流速為〇.5ml/min，取每管收集溶液以苯酚-硫酸法檢測(cè)，作洗脫曲線，再接著過(guò) Sephadex G-25柱，蒸餾水作為洗脫液，取每管收集液再作洗脫曲線，收集濃縮主峰溶液，冷 凍干燥，得到黨參均一多糖C0P-1。
[0006] 黨參均一多糖C0P-1在制備提高免疫能力藥物中的應(yīng)用。
[0007] 黨參均一多糖C0P-1在制備抗I型單純皰疹病毒藥物中的應(yīng)用。
[0008] 黨參多糖硫酸酯的制備方法，將黨參均一多糖C0P-1用氨基磺酸法對(duì)進(jìn)行硫酸化 修飾，修飾條件為黨參均一多糖C0P-1與氨基磺酸的摩爾質(zhì)量比為l :0.04g/m〇l，80°C，iS 時(shí)間 15-30 min。
[0009] 獲得取代度為0.24-0.45的黨參多糖硫酸酯。
[0010] 為了進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)方案，發(fā)明人進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)： 一、黨參均一多糖C0P-1的獲取:按照上述方法提取獲得黨參均一多糖C0P-1。
[0011] 二、鑒定:對(duì)用本發(fā)明提取方法獲得的黨參多糖C0P-1采用高效液相法進(jìn)行純度和 分子量鑒定。
[0012] 色譜條件:Ultrahydrogel 250色譜柱，流動(dòng)相為0 · 2mo 1/1，流速0 · 6ml/min，柱溫 30°C，檢測(cè)器為RID(示差折光檢測(cè)器）。多糖用適量水溶解，進(jìn)樣10μ1，呈單一對(duì)稱峰，說(shuō)明 該組分為分子量均一的多糖。見(jiàn)圖2。
[0013] 取lmg分子量為11(、51(、121(、251(、501(0&的普魯蘭多糖分別溶于11111的水溶液中，色 譜條件同上，高效液相分析。記錄保留時(shí)間，以分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間為橫坐標(biāo)， 得標(biāo)準(zhǔn)曲線logM=2.544+0.6998X-0.0473X 2,（M為重均分子量，X為時(shí)間，min)見(jiàn)圖3,將C0P-1出峰時(shí)間代入曲線方程，得C0P-1的重均分子量為2100Da。
[0014] 對(duì)用本發(fā)明提取方法獲得的黨參多糖C0P-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定： C0P-1經(jīng)純度鑒別，證明已是單一組成，可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。
[0015] 標(biāo)準(zhǔn)單糖液相分離:取適量的四種單糖(木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖)溶解，微孔濾 膜過(guò)濾上高效分析。色譜條件:檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD);色譜柱為Xbridge BEH Amide(4.6 X 250mm);流動(dòng)相為A相：80%乙腈水溶液含0.2%三乙胺；B相：30%乙腈水溶液含 0 · 2%三乙胺;梯度洗脫:A相100%-40%-100%;時(shí)間：0-21 · 00-33 · OOmin;流速為lml/min，見(jiàn)圖 4〇
[0016] C0P-1經(jīng)三氟乙酸完全水解，樣品只含一種單糖，即果糖（見(jiàn)圖5XIR中937CHT1及 818 cnf1兩個(gè)果聚糖特有的吸收峰（見(jiàn)圖6)，也證明該多糖為一果聚糖。從13C匪R中103-104ppm異頭碳信號(hào)證明該多糖為β構(gòu)型，這種呋喃型的連接方式有 13C及1HNMR中得到進(jìn)一步 證實(shí)。
[0017] 上述分析證明：C0P_1為β-D-果聚糖，以2-1連接的呋喃型果糖為主，該多糖的還 原端可能與α-D-Glc相連。
[0018] 三、黨參均一多糖C0P-1對(duì)免疫功能的作用研究： 實(shí)驗(yàn)1 :C0P-1對(duì)免疫功能的作用研究 實(shí)驗(yàn)材料及儀器 動(dòng)物：昆明種小鼠，清潔級(jí)，體重20-22 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提 供。飼養(yǎng)環(huán)境安靜，室溫22-23%，光照/暗時(shí)間為12/12 h循環(huán)，各組實(shí)驗(yàn)小鼠自由進(jìn)食、飲 水。
[0019] 藥物:C0P-1陽(yáng)性藥物:環(huán)磷酰胺(粉針劑0.2g)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。
[0020] 實(shí)驗(yàn)儀器:CKX-41型倒置顯微鏡(奧林巴斯（日本)公司）。
[0021 ]各實(shí)驗(yàn)預(yù)設(shè)組給藥方案 選取48只健康雄性昆明種小鼠，分為3組，分別為空白組，模型組，C0P-1多糖組。給藥方 案如下:模型組:組小鼠采用腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)粉針劑100mg/kg的劑量，連續(xù)腹腔注 射3d誘導(dǎo)免疫抑制小鼠模型，其中空白組小鼠不注射CTX誘導(dǎo)?？瞻捉M:造模后，給予蒸餾水 灌胃，灌胃體積與其他組別體積相同；C0P-1劑量組：造模后，給予600mg/kg的黨參多糖灌 田 冃。
[0022]小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的計(jì)算 取血后的小鼠牽拉后脫頸椎處死，分別取小鼠臟器后，用生理鹽水沖洗臟器上血液，剔 除干凈膽囊、脂肪團(tuán)等，用濾紙吸干血跡后稱重，記錄小鼠體重、脾臟、胸腺，計(jì)算小鼠的臟 器指數(shù)： 胸腺指數(shù)=(胸腺重量/小鼠體重）X10 脾臟指數(shù)=(脾臟重量/小鼠體重）X10 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按完全隨機(jī)對(duì)照設(shè)計(jì)的要求收集整理，所有數(shù)據(jù)以龍± S表示，全部數(shù)據(jù) 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行ONE-WAY ANOVA處理，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett，T3法，以 P〈0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0023] 對(duì)取材后臟器整理，按照公式計(jì)算小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示 模型組小鼠的臟器指數(shù)明顯低于空白組小鼠（P<〇.01)，兩組黨參多糖組分中，C0P-1組的 的臟器指標(biāo)均明顯高于模型組(P<〇.01)，對(duì)比A、B兩組間的臟器指標(biāo)，數(shù)據(jù)分析顯示未見(jiàn) 明顯差異見(jiàn)圖7。具體數(shù)據(jù)指標(biāo)見(jiàn)表1數(shù)據(jù)表：
實(shí)驗(yàn)2 :小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn) 取小鼠股骨頭，剝離干凈后，用1640無(wú)血清培養(yǎng)基充分沖洗股骨頭中骨髓，收集含有小 鼠骨髓的懸液，l〇〇〇r/min離心，棄去上清液，用下層骨髓制作骨髓涂片。對(duì)涂片后的小鼠骨 髓涂片進(jìn)行Giemsa染色法染色。（Giemsa染液配制：取lg染料，加入20ml丙三醇溶液，在研缽 中充分研磨2h，研磨后加入50ml甲醇溶液后，靜置一周，過(guò)濾收集濾液為Giemsa原液。原液 按照1:50V/V加入pH=6.8的磷酸鹽緩沖液，得到Giemsa染色液)對(duì)染色后的骨髓涂片進(jìn)行鏡 下觀察，并對(duì)染色后的10000個(gè)骨髓嗜多染紅細(xì)胞中微核數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。
[0024] 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按完全隨機(jī)對(duì)照設(shè)計(jì)的要求收集整理，所有數(shù)據(jù)以卩±s表示，全部數(shù)據(jù)采用 SPSS17.0軟件進(jìn)行ONE-WAY AN0VA處理，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett，T3法，以K 0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0025] 對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞涂片固定后，滴加甲醇固定涂片。涂片采用Gimesa法染色后，顯微 鏡下進(jìn)行觀察，可以看到正常骨髓細(xì)胞與刺激后細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)明顯產(chǎn)生改變，具 體改變見(jiàn)圖8中細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
[0026] 對(duì)不同組的小鼠骨髓細(xì)胞涂片中，嗜多染紅細(xì)胞微核計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示， C0P-1多糖對(duì)小鼠骨髓抑制有影響。C0P-1組黨參多糖的抑制率較高(P<0.01)。具體數(shù)據(jù)見(jiàn) 表2:
環(huán)磷酰胺在肝臟中被細(xì)胞色素 P450氧化酶活化后，產(chǎn)生的磷酰胺氮芥后，在機(jī)體內(nèi)發(fā) 揮藥效。環(huán)磷酰胺對(duì)淋巴細(xì)胞具有明顯的抑制作用，因此被作為免疫抑制劑使用。其主要不 良作用為骨髓抑制，具有致癌、致畸變、致突變等作用。在實(shí)驗(yàn)室造模中，常采用環(huán)磷酰胺作 為工具藥建立免疫抑制動(dòng)物模型。本節(jié)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，正常昆明種小鼠采用腹腔注射環(huán)磷 酰胺造模后，小鼠體重及胸腺、脾臟指數(shù)與空白組小鼠相比，均明顯下降。胸腺與脾臟在體 內(nèi)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有著重要的影響，兩種器官相對(duì)重量的變化能夠作為評(píng)價(jià)機(jī)體免疫的指 標(biāo)。胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)在模型中顯著降低，表明免疫功能被抑制。
[0027]本發(fā)明從黨參中發(fā)現(xiàn)的一種新的中性均一多糖，經(jīng)丙烯酰胺葡聚糖凝膠 (Sephacryl S-200HR)和葡聚糖凝膠（Sephadex G-25)純化得到該多糖，獲得途徑方便;具 有增強(qiáng)免疫力的作用，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值及保健功能。本方法簡(jiǎn)單、科學(xué)合理，只需 要經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠柱就可以快速得到高純度的產(chǎn)品。
[0028]三、根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的黨參均一多糖C0P-1進(jìn)行的黨參均一多糖硫酸酯化的制備： 制備過(guò)程:黨參多糖與氨基磺酸的摩爾質(zhì)量比為1:0.04g/mo 1，50ml二甲亞砜作溶劑， 反應(yīng)時(shí)間15-30min.反應(yīng)結(jié)束加入5倍無(wú)水乙醇，靜置12h過(guò)夜，收集沉淀，3500Da透析袋透 析3d，濃縮凍干截留溶液。
[0029] 硫酸酯的鑒定方法:取lmg上述制備的硫酸酯溶于lml蒸餾水中滴加數(shù)滴lmol/1 BaCl2未出現(xiàn)沉淀，再取lmg硫酸酯加2mol/L的HCLlml，100 °C條件下水解5h，向水解液中加 入數(shù)滴lmol/1 BaCl2,出現(xiàn)白色渾濁，證明有多糖取代基有硫酸根。
[0030] 硫酸酯的紅外分析：圖譜中存在1245cm-1和600cm-1吸收，證明該多糖已經(jīng)發(fā)生了 酯化反應(yīng)，見(jiàn)圖9。
[0031] 取代度的測(cè)定:精密稱取于105°C干燥至恒重的Na2S〇4樣品1.31mg，用去離子水溶 解，定容至50ml，即得131ug/mlNa2S〇4標(biāo)準(zhǔn)液；用移液槍準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)Na2S〇4溶液0.08、 0.16、0.24、0.32、0.4ml，再用去離子水補(bǔ)足至0.4ml，各管中均加入8%三氯乙酸0.35ml和 0.5%氯化鋇一明膠溶液0.25ml，室溫下靜置15min后，在360nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)i，再以相同 體積的0.5%明膠溶液代替氯化鋇一明膠溶液依法操作，測(cè)吸光度A 2。0.4mL的H20為空白對(duì) 照，以硫酸基質(zhì)量為橫坐標(biāo)、(&一如)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.0035x+ 0 ·0325(r2=0 · 9959)(見(jiàn)圖10)。稱?、铅?1樣品1 · 86mg置安瓿瓶中，加入lml的2 mol/1鹽酸 充分溶解，封管，在l〇〇°C沸水浴中水解3h，取0.4ml樣品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定法操作，同法測(cè)得 Ai、A2，代入回歸方程，計(jì)算得⑶P-1硫酸基的質(zhì)量，計(jì)算取代度DS=1.62S/( 32 - 1.02S) X 100%，式中，S為樣品中硫酸基的質(zhì)量，根據(jù)方程計(jì)算得出DSscqp-fO.24。
[0032] 黨參多糖硫酸酯(SC0P-1)在抗I型單純皰疹病毒藥物中的應(yīng)用 在預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇SC0P-1為研究對(duì)象，以未進(jìn)行硫酸化修飾的COP-1作為對(duì) 照，首先測(cè)定了它們對(duì)非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)的安全濃度，然后用MTT法比較它們HSV-1感染細(xì)胞能力的影響。
[0033]病毒滴度的測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Vero細(xì)胞，按4.0X103個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)接種于96 孔培養(yǎng)板中，置37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，吸盡上清，加入不同稀釋度的病毒 液(用含2%胎牛血清的維持液將HSV-I病毒以10倍稀釋度稀釋成10-5、10-6、10-7、10-8、10-9)，每個(gè)稀釋度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)病毒陰性對(duì)照組，每孔100yL，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日檢查病 毒生長(zhǎng)情況，觀察特征性細(xì)胞病變的孔數(shù)，72h后按如下方法記錄結(jié)果：25%以下記"+"，26% ~50%記"++"，51%~75%記"+++"，76%~100%記"++++" ；按照Reed-Muench公式，計(jì)算病毒的 半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)。
[0034] 病毒感染滴度的測(cè)定結(jié)果：與正常Vero細(xì)胞相比，HSV-1感染的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞腫 脹、變圓、從瓶壁脫落等細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的典型現(xiàn)象(見(jiàn)圖11)。根據(jù)Reed-Muench公式計(jì) 算，HSV-1 的TCID50為 10-8/0 · lml。
[0035] 硫酸化黨參多糖的細(xì)胞毒性試驗(yàn)按照上述方法將Vero細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板 中，置37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，吸盡上清，用維持液將硫化黨參多糖分別稀 釋為0、10、20、50、100、20(^/1111等6個(gè)濃度，將各濃度藥物以每孔10(^1加入細(xì)胞中，每個(gè)濃 度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔;培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，每孔加入5mg/ml的MTT染液10μ1，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄上 層液體，加入DMS0 lOOyL/孔，振蕩10min，直至形成的甲瓚結(jié)晶全部溶解，在酶標(biāo)儀490nm處 測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算藥物的最大無(wú)毒濃度。
[0036] 黨參多糖(C0P-1)和硫酸化黨參多糖（SC0P-1)對(duì)細(xì)胞毒性的測(cè)定隨著C0P-1和 SC0P-1使用濃度的增加，活細(xì)胞數(shù)量相應(yīng)減少。當(dāng)濃度達(dá)到200μg/ml時(shí)，C0P-1組的細(xì)胞存 活率與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P〈 0.05)，而SC0P-1組的無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別>0.05)。因 此，C0P-1和SC0P-1對(duì)Vero細(xì)胞最大無(wú)毒濃度分別確定為100μg/ml和200μg/ml(表3)。
[0037] 硫酸化黨參多糖抗HSV-1買(mǎi)驗(yàn)將Vero細(xì)胞計(jì)數(shù)后接柙十96札培養(yǎng)板中，置37°C， 5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后分為以下幾組:細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組、陽(yáng)性 藥物對(duì)照組，不同濃度藥物組。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0038]藥物的預(yù)防作用將不同濃度的藥物加入單層細(xì)胞中，24h后棄上清，用100X TCID50的病毒液攻擊細(xì)胞lh，而后roS清洗以除去未結(jié)合的病毒，再加入不同濃度的藥物作 用72h，鏡下觀察細(xì)胞病變情況，并記錄。
[0039] 藥物的治療作用用100XTCID50的病毒液攻擊已長(zhǎng)成單層的細(xì)胞lh，而后roS清 洗，再加入不同濃度的藥物作用72h，鏡下觀察細(xì)胞病變情況，并記錄。
[0040]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法采用SPSS14.0軟件，對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行單因素方差分析，兩組間比 較采用t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(翏土 s)表示，P〈0.05為有顯著性差異。
[0041 ] COP-1和SCOP-1在預(yù)防及治療給藥時(shí)的抗HSV-1作用從圖12中可以看出，未經(jīng)硫酸 化修飾的SC0P-1-預(yù)防及治療給藥組的細(xì)胞存活率均高于病毒對(duì)照組，但僅預(yù)防組的有統(tǒng) 計(jì)學(xué)差異，與陽(yáng)性藥物阿昔洛韋（ACV)相比，預(yù)防組和治療組的細(xì)胞存活率都較低，說(shuō)明 C0P-1只有一定的預(yù)防HSV-1感染的效果，且該作用弱于ACV;而經(jīng)過(guò)硫酸化修飾后的SC0P-1 呈現(xiàn)出明顯的預(yù)防及治療效果(與病毒對(duì)照組相比，代0.01)，其預(yù)防作用與ACV相當(dāng)（與ACV 預(yù)防組相比，A0.05)，治療效果優(yōu)于ACV(與ACV治療組相比，K0.05)。
[0042]本發(fā)明采用氨基磺酸法對(duì)黨參多糖進(jìn)行硫酸酯化修飾，優(yōu)化了修飾方法，并發(fā)現(xiàn) 黨參多糖硫酸酯對(duì)單純皰疹病毒I型具有較強(qiáng)的預(yù)防及治療效果。同時(shí)還篩選出活性最好 的黨參多糖硫酸酯（取代度為0.24)，無(wú)論是預(yù)防給藥還是治療給藥，細(xì)胞存活率均高于病 毒對(duì)照組(K0.01)，且其預(yù)防作用與阿昔洛韋相當(dāng)（D0.05)，治療效果優(yōu)于阿昔洛韋（K 0.05)。表明其抗病毒活性最強(qiáng)，可以作為研制新型抗HSV-1病毒藥物的材料，為研制新型抗 HSV-1病毒藥物提供了材料和理論依據(jù)。本發(fā)明從黨參中發(fā)現(xiàn)的一種新的中性均一多糖，經(jīng) 丙稀酰胺葡聚糖凝膠(Sephacryl S-200HR)和葡聚糖凝膠(Sephadex G-25)純化得到該多 糖，獲得途徑方便;其產(chǎn)品可以進(jìn)一步衍生化如硫酸化或硝酸化衍生，而且還具有增強(qiáng)免疫 力的作用以及具有抗I型單純皰疹病毒的作用，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值及保健功能。本方 法簡(jiǎn)單、科學(xué)合理，只需要經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠柱就可以快速得到高純度的產(chǎn)品。
【附圖說(shuō)明】
[0043]圖1為黨參粗多糖組分(C0P-1)的洗脫曲線； 圖1-A、1-B為黨參粗多糖組分(C0P-1)過(guò)Sephacryl S-200HR柱及Sephadex G-25的洗 脫曲線； 圖2為C0P-1凝膠色譜； 圖3為dextran系列多糖的分子量曲線； 圖4四種單糖高效色譜圖； 圖5為分子量為2.1 X 103Da(C0P-l)多糖水解高效圖； 圖6為黨參均一多糖C0P-1紅外譜圖； 圖7為環(huán)磷酰胺處理后給與不同分子量多糖各實(shí)驗(yàn)組小鼠臟器指數(shù)（土 s，n=12); 圖8為不同分子量多糖對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核的影響(g±s，n=12); 圖9為硫酸化均一多糖與未硫酸化對(duì)比的紅外分析譜圖為黨參均一多糖 圖10為氯化鋇一明膠比濁法標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖11為HSV-I感染前后的Vero細(xì)胞； 圖12為COP-1和SC0P-1在預(yù)防及治療給藥時(shí)的抗HSV-1作用(MTT法）； 圖13多糖C0P-1核磁C譜圖(D20做溶劑）； 圖14為C0P-1核磁Η譜圖(D20做溶劑）； 圖15為C0P-1核磁Η譜圖(DMSO做溶劑）； 圖16為黨參均一多糖C0P-1核磁HSQC二維譜圖(DMSO做溶劑）； 圖17為黨參均一多糖C0P-1核磁HMBC二維譜圖(DMSO做溶劑）； 圖18為黨參均一多糖C0P-1核磁1H-1HC0SY二維譜圖（DMSO做溶劑）； 圖19為糖單元C與Η相關(guān)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 本發(fā)明的實(shí)施例1:黨參均一多糖C0P-1的制備方法，包括如下步驟： 1) 將干燥黨參塊根，剪切成lcm小節(jié)，用8重量倍、且質(zhì)量濃度為70%的乙醇回流3次，乙 醇液棄之，將藥渣用8重量倍蒸餾水提3次，將水提液減壓濃縮至0.8g/ml，加入質(zhì)量濃度為 90 %乙醇至含醇量達(dá)80 %，靜置過(guò)夜，傾去上清液，沉淀重復(fù)醇沉1次，冷凍干燥，得淡黃色 黨參粗多糖粉末，得率28 % ; 2) 將黨參粗多糖粉末完全溶解于蒸餾水中，在3000rpm條件下離心10min，收集上清液， 加入無(wú)水乙醇，使乙醇的體積濃度為30%，得到褐色溶液； 3) 將褐色溶液置于4°C條件下保存，直至出現(xiàn)白色沉淀； 4) 將獲得的白色沉淀進(jìn)行冷凍干燥，得白色粉末； 5) 將0.5g白色粉末用10ml水溶解后過(guò)Sephacryl S-200 HR柱，以0.2M氯化鈉作為洗脫 液，流速為〇.5ml/min，取每管收集溶液以苯酚-硫酸法檢測(cè)，作洗脫曲線，再接著過(guò) Sephadex G-25柱，蒸餾水作為洗脫液，取每管收集液再作洗脫曲線，收集濃縮主峰溶液，冷 凍干燥，得到黨參均一多糖C0P-1。
[0045] 本發(fā)明的實(shí)施例2:純化多糖的純度鑒定采用高效液相法： 色譜條件:U1 trahydrogel 250色譜柱，流動(dòng)相為水，流速0.6ml/min，柱溫30°C，檢測(cè)器 為RID(示差折光檢測(cè)器）。多糖用適量水溶解，進(jìn)樣：10μ1，呈單一對(duì)稱峰。
[0046] 本發(fā)明的實(shí)施例3:黨參多糖C0P-1結(jié)構(gòu)測(cè)定 (1)糖組分分解(全水解） 樣品C0P-1經(jīng)2mol/l三氟乙酸100 °C封管水解5h，水解液減壓濃縮至干，然后再反復(fù)加 甲醇二次，再蒸干。溶于少量水，高效分析，與標(biāo)準(zhǔn)單糖出峰時(shí)間對(duì)照表明：C0P-1主要是由 果糖聚合物。當(dāng)然其最終結(jié)果還要經(jīng)NMR證實(shí)。
[0047] 紅外吸收光譜 樣品采用KBr壓片法測(cè)定，從IR圖中C0P-1呈現(xiàn)典型的多糖的吸收特征，在波數(shù)937cm 4、872 cnf1和818CHT1的吸收峰為果聚糖特有的吸收信號(hào)，由此可見(jiàn)該多糖為一果聚糖。 [0048]核磁共振光譜 咕及 13CNMR譜的分析 樣品溶于D20中，常溫下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖13、14。從13C匪R譜可見(jiàn)（圖13)異頭碳信號(hào)在 103-104ppm，說(shuō)明異頭碳均呈β構(gòu)型，參照文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)各信號(hào)歸屬如下： LINKAGES C-l C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 Fruf(2- -1) 60.7 103.7 76.8 74.1 80.9 61.9 4譜（圖14)中在異頭氫區(qū)無(wú)強(qiáng)信號(hào)，這再次說(shuō)明該多糖為果聚糖，因?yàn)楣鞘峭牵?2位異頭碳上沒(méi)有質(zhì)子，氫譜中有一個(gè)較弱的異頭信號(hào)，可能來(lái)源于果聚糖中常見(jiàn)的還原末 端連接的a-D-GlcXOP-l顯示有7個(gè)低場(chǎng)質(zhì)子信號(hào)：δΗ 4.09 (d，J = 8.4 Hz, 1H)，3.94 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 3.76(d, J = 10.0 Hz, 1H), 3.69(m, 2H), 3.60(m, 2H); 樣品溶于DMSO中，常溫下測(cè)定，結(jié)果（見(jiàn)圖15)。從13_MR譜可見(jiàn)三個(gè)羥基的信號(hào)：δΗ 5.18 (d，J = 4.4 Hz, 1Η)，4.75 (d，J = 5.6 Ηζ，1Η)，4.62 (s，1Η)說(shuō)明有三個(gè)游 離的羥基未參與成鍵。
[0049] 結(jié)合13CNMR譜與二維HSQC譜(見(jiàn)圖16)，得出結(jié)論:一個(gè)δ(： 103.1屬于季碳信號(hào)，三 個(gè)SC 80.9，76.8，74.1是叔碳信號(hào)，兩個(gè)SC 62.0，60.7是仲碳信號(hào)。
[0050] 在HMBC譜(見(jiàn)圖17 )和1H-hCOSY譜(見(jiàn)圖18 )中體現(xiàn)了 -0Η和-C的相關(guān)性:0Η-3和0 2、C-3、C-4有相關(guān);0H-4和C-3、C-4、C-5有相關(guān);0H-6 和C-5、C-6有相關(guān)（見(jiàn)圖 19)，表明 0H-1 和0H-2的羥基參與糖苷鍵的形成。最終我們確定多糖C0P-1的結(jié)構(gòu)如下：[ - 1)- β-D-fru-(2^1) -]n 本發(fā)明的實(shí)施例4:取黨參多糖硫酸酯(SCOP-1)3g、藥用淀粉75 g、微晶纖維素20 g，將 藥用淀粉先干燥，過(guò)120目篩，再與黨參多糖硫酸酯、微晶纖維素混合，過(guò)兩次120目篩，填入 硬膠囊中，制成1 〇〇〇粒本發(fā)明膠囊。每粒硬膠囊含主藥成分〇. 3 mg。
[0051] 本發(fā)明的實(shí)施例5:取黨參多糖(SC0P-l)3g、羥丙甲纖維素6g、羧甲淀粉鈉10g，微 晶纖維素8g，乳糖115g、淀粉50g，硬脂酸鎂lg;將主藥與輔料充分混勻后投入高速攪拌機(jī) 中，噴霧加水適量，整粒，水分控制在3~4%，然后壓片，制成1000片，包薄膜衣。每粒含主藥成 分0.3 mg〇
[0052] 本發(fā)明的實(shí)施例6:取黨參多糖硫酸酯（SC0P-l)3g，加入400 ml聚乙二醇200溶解， 再加入適量蒸餾水進(jìn)行稀釋，然后再加入適量蔗糖并調(diào)整體積至1000 ml，攪勻，過(guò)濾，灌 裝成10 ml或20 ml每只，滅菌包裝。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種黨參均一多糖COP-1，其特征在于:該多糖是分子量為2100的β-D-果聚糖，以2- 1連接的呋喃型果糖為主該多糖的還原端與α-D-Glc相連。2. -種如權(quán)利要求1所述的黨參均一多糖COP-I的制備方法，其特征在于:包括以下步 驟： 1) 將干燥黨參塊根，剪切成Icm小節(jié)，用6-10重量倍、且質(zhì)量濃度為60-80%的乙醇回流 3次，乙醇液棄之，將藥渣用6-10重量倍的蒸餾水提2-3次，將水提液減壓濃縮至0.5-1. Og/ ml，加入質(zhì)量濃度為85-95 %乙醇至含醇量達(dá)80 %，靜置過(guò)夜，傾去上清液，沉淀重復(fù)醇沉1 次，冷凍干燥，得淡黃色黨參粗多糖粉末； 2) 將黨參粗多糖粉末完全溶解于蒸餾水中，在3000rpm條件下離心10min，收集上清液， 加入無(wú)水乙醇，使乙醇的體積濃度為30%，得到褐色溶液； 3) 將褐色溶液置于4°C條件下保存，直至出現(xiàn)白色沉淀； 4) 將獲得的白色沉淀進(jìn)行冷凍干燥，得白色粉末； 5) 將每0.5g白色粉末用IOml水溶解后過(guò)Sephacryl S-200 HR柱，以0.2M氯化鈉作為洗 脫液，流速為〇.5ml/min，取每管收集溶液以苯酚-硫酸法檢測(cè)，作洗脫曲線，再接著過(guò) Sephadex G-25柱，蒸餾水作為洗脫液，取每管收集液再作洗脫曲線，收集濃縮主峰溶液，冷 凍干燥，得到黨參均一多糖COP-I。3. -種如權(quán)利要求1所述的黨參均一多糖COP-I在制備提高免疫能力藥物中的應(yīng)用。4. 一種如權(quán)利要求1所述的黨參均一多糖COP-I在制備抗I型單純皰疹病毒藥物中的應(yīng) 用。5. -種基于如權(quán)利要求1所述的黨參均一多糖COP-I的黨參多糖硫酸酯的制備方法，其 特征在于:將黨參均一多糖C0P-1用氨基磺酸法對(duì)進(jìn)行硫酸化修飾，修飾條件為黨參均一多 糖(1^-1與氨基磺酸的摩爾質(zhì)量比為1 :0.048/111〇1，80°(：，反應(yīng)時(shí)間15-30 1^11。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的黨參多糖硫酸酯的制備方法，其特征在于獲得取代度為0.24- 0.45的黨參多糖硫酸酯。
【文檔編號(hào)】A61P37/04GK105906735SQ201610300038
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年5月9日
【發(fā)明人】余蘭, 劉章泉
【申請(qǐng)人】遵義醫(yī)學(xué)院