一種米曲霉菌株ysy035和富硒米曲霉的分離篩選方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035和富硒米曲霉的分離篩選方法及其應(yīng)用，所述米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035于2016年5月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC NO.12378；通過對(duì)米曲霉菌株進(jìn)行分離、純化、初篩和復(fù)篩，獲得了富硒米曲霉；再對(duì)其進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，獲得了硒含量在8.0?11.0mg/g，有機(jī)硒含量在7.0?10.5mg/g的富硒產(chǎn)品。將本發(fā)明提供的富含有機(jī)硒的米曲霉替代普通米曲霉作為食品和保健品的添加劑，可進(jìn)行持續(xù)補(bǔ)硒，有效防治因缺硒引起的疾病。CGMCC No.1237820160511
【專利說明】
一種米曲霉菌株YSY035和富砸米曲霉的分禹篩選方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及食品添加劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種米曲霉菌株YSY035和富砸米曲霉的分離篩選方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]砸作為人和動(dòng)物必需的微量元素，具有多種生物學(xué)功能，如參與多種酶促反應(yīng)，促進(jìn)代謝過程中有毒過氧化物的分解，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抑制體內(nèi)有毒物質(zhì)的吸收，以及抗癌等作用。世界衛(wèi)生組織建議并建議人體每天補(bǔ)充200yg的砸，但是，中國(guó)普遍存在砸攝入不足及不均衡，缺砸的現(xiàn)象比較普遍，全國(guó)22個(gè)省市約2/3的地區(qū)缺砸。砸的缺乏可引起多種疾病，常見的有克山病，大骨節(jié)病及缺血性心臟病等等。由于天然食品中的砸含量一般都比較低，僅靠天然食品來補(bǔ)充砸不能滿足人體對(duì)砸的需求。
[0003]在自然界中砸以無(wú)機(jī)砸和有機(jī)砸兩種形式存在。無(wú)論是哪種形式的砸都可參與肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶的合成。兩種砸對(duì)砸缺乏而引起的種種疾病都有預(yù)防和治療作用。但是有機(jī)砸較無(wú)機(jī)砸毒性小。吸收率更高。
[0004]如今，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多種生產(chǎn)有機(jī)砸的方法。如動(dòng)物轉(zhuǎn)化法、植物轉(zhuǎn)化法以及微生物轉(zhuǎn)化法，其中利用微生物進(jìn)行砸的轉(zhuǎn)化可以不受季節(jié)、氣候的影響，且生產(chǎn)周期短，商業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)更為顯著。研究較多的富砸微生物主要有富砸酵母，但是，富砸酵母具有富砸效率低，投資額度大，生產(chǎn)成本較高等缺點(diǎn)，故很少能大規(guī)模生產(chǎn)。
[0005]米曲霉是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等。作為一種重要的工業(yè)真菌，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、生產(chǎn)曲酸、釀酒等發(fā)酵工業(yè)，并已被安全地應(yīng)用了 1000多年。并且已經(jīng)被證明了是一種優(yōu)秀的富砸載體，相較于其它富砸微生物的產(chǎn)率低及生產(chǎn)成本高等特點(diǎn)，米曲霉易于培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)基的要求低，富砸的效率高。CNl 632128A提供了一種米曲霉有機(jī)砸制備方法，但其富砸量較低，并且發(fā)酵方法介紹較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035和富砸米曲霉的分離篩選方法及其應(yīng)用。
[0007]為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0008]第一方面，本發(fā)明提供了一種米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏日期為2016年5月11日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.12378，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0009]米曲霉菌株(Aspergillusoryzae)YSY035，保藏編號(hào)為CGMCC N0.12378，其形態(tài)學(xué)特征為菌落初呈白色、黃色后呈黃褐色或綠褐色，背面無(wú)色。用顯微鏡觀察，菌絲發(fā)達(dá)，多分枝，有隔膜，菌絲頂端直接產(chǎn)生孢子梗，分生孢子串生。
[0010]以上形態(tài)特征與《真菌鑒定手冊(cè)》中米曲霉的形態(tài)特征相符合；其分子生物學(xué)特征，以YSYO 35基因組為模板，PCR擴(kuò)增到18 S rDNA特異性片段，經(jīng)過測(cè)序，所得序列通過Blast與GeneBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比對(duì)，鑒定為米曲霉(Aspergi I Ius oryzae)。
[0011]米曲霉菌株(Aspergillusoryzae)YSY035，包含所述米曲霉菌株(AspergillusoryZae)YSY035和/或其代謝產(chǎn)物，并以其為活性成分的微生物制劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012]第二方面，本發(fā)明還提供了一種富砸米曲霉的分離篩選方法，包括如下步驟:
[0013](I)菌種分離；
[0014](2)菌種純化；
[0015](3)富砸米曲霉初篩:將得到的純種米曲霉點(diǎn)種于亞砸酸含量為0.1-0.5mg/mL的亞砸酸鈉抗性平板中觀察菌落生長(zhǎng)狀況，當(dāng)菌株變成紅色時(shí)，初篩得到具有富砸能力的米曲霉；
[0016](4)富砸米曲霉復(fù)篩:將初篩得到的米曲霉菌株接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)3-4d，然后測(cè)定該富砸米曲霉的砸含量，篩選得到有機(jī)砸含量在2.0-5.0mg/g的富砸米曲霉。
[0017]目前對(duì)于富砸米曲霉的篩選，通常是采用富砸酵母的間接分離方法，而本發(fā)明則是直接利用米曲霉菌株進(jìn)行富砸米曲霉的篩選，并篩選得到了有機(jī)砸含量在2.0-5.0mg/g的富砸米曲霉。
[0018]根據(jù)本發(fā)明，步驟(I)所述菌種分離是將收集到的樣品利用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋，再將其加入到馬丁氏培養(yǎng)基平板中進(jìn)行涂布。具體地，例如可將收集到的各種醬曲、酒曲樣品加入到無(wú)菌水中充分混勻、進(jìn)行梯度稀釋，然后吸取適量稀釋后的樣品加入到馬丁氏培養(yǎng)基平板中進(jìn)行涂布。
[0019]根據(jù)本發(fā)明，步驟(2)所述菌種純化是將步驟(I)分離的單菌落接種于馬丁氏培養(yǎng)基斜面中進(jìn)行劃線保存，25-28°C培養(yǎng)3-4d，直至得到純種絲狀真菌；在25-28°C培養(yǎng)3-4d后，可以向斜面中加入無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋、涂布，觀察菌落狀態(tài)是否為同種微生物，如果不純應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行純化直至得到純種絲狀真菌，即菌落形態(tài)完全一致。
[0020]根據(jù)本發(fā)明，步驟(I)和步驟(2)所述馬丁氏培養(yǎng)基的組成為:ΚΗ2Ρ04 lg,MgSO4.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉紅水溶液3.3mL，瓊脂15_20g，水100mL，pH值自然;臨用時(shí)每10mL培養(yǎng)基中加I %鏈霉素液0.3mL。
[0021]根據(jù)本發(fā)明，步驟(4)所述富砸米曲霉復(fù)篩中，馬鈴薯液體培養(yǎng)基的組成為:去皮土豆200g加500-1000mL水，加熱至沸騰，維持20-30min，4層紗布過濾，濾液補(bǔ)充水分到100mL，加入葡萄糖20g。
[0022]根據(jù)本發(fā)明，步驟(4)所述砸含量的測(cè)定采用分光光度計(jì)法進(jìn)行;所述分光光度計(jì)法是采用鄰苯二胺為顯色劑檢測(cè)樣品中的總砸含量和無(wú)機(jī)砸含量，通過差減法獲得有機(jī)砸含量;具體地，采用分光光度計(jì)法測(cè)砸，稱取0.1g樣品消解24h，調(diào)節(jié)pH至中性，利用鄰苯二胺的顯色檢測(cè)樣品中砸含量，測(cè)定總砸和無(wú)機(jī)砸，通過差減法獲得有機(jī)砸含量。
[0023 ]示例性地，本發(fā)明所述富砸米曲霉的分離篩選方法，可以包括如下步驟:
[0024](I)菌種分離:將收集到的各種醬曲和/或酒曲樣品加入到無(wú)菌水中充分混勻，進(jìn)行梯度稀釋，然后吸取稀釋樣品加入到馬丁氏培養(yǎng)基平板中進(jìn)行涂布；
[0025]所述馬丁氏培養(yǎng)基的組成為:ΚΗ2Ρ04 lg,MgSO4.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉紅水溶液3.3mL，瓊脂15_20g，水100mL，pH值自然；臨用時(shí)每10mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液0.3mL;
[0026](2)菌種純化:將馬丁氏培養(yǎng)基平板中長(zhǎng)出的單菌落接種于馬丁氏培養(yǎng)基斜面中進(jìn)行劃線保存，25°C培養(yǎng)3-4d，向斜面中加入無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋，涂布，觀察菌落狀態(tài)是否為同種微生物，如果不純繼續(xù)進(jìn)行純化直至得到純種絲狀真菌；
[0027]所述馬丁氏培養(yǎng)基的組成為:ΚΗ2Ρ04 lg,MgSO4.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉紅水溶液3.3mL，瓊脂15_20g，水100mL，pH值自然；臨用時(shí)每10mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液0.3mL;
[0028](3)富砸米曲霉初篩:將得到的純種米曲霉點(diǎn)種于亞砸酸含量為0.1-0.5mg/mL的亞砸酸鈉抗性平板中觀察菌落生長(zhǎng)狀況，當(dāng)菌株變成紅色時(shí)，初篩得到具有富砸能力的米曲霉；
[0029](4)富砸米曲霉復(fù)篩:采用搖瓶培養(yǎng)法，將初篩得到米曲霉菌株接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)3-4d進(jìn)行復(fù)篩，搖瓶中的馬鈴薯液體培養(yǎng)基為添加亞砸酸鈉的馬鈴薯液體培養(yǎng)基；
[0030]所述添加亞砸酸鈉的馬鈴薯液體培養(yǎng)基的組成為:去皮土豆200g加500-1000mL水，加熱至沸騰，維持20-30min，4層紗布過濾，濾液補(bǔ)充水分到100mL，加入葡萄糖20g，亞砸酸鈉的含量為0.5mg/mL;
[0031]采用分光光度計(jì)法測(cè)定該富砸米曲霉的砸含量，稱取0.1g樣品消解24h，調(diào)節(jié)pH至中性，利用鄰苯二胺的顯色檢測(cè)樣品中砸含量，測(cè)定總砸和無(wú)機(jī)砸，通過差減法獲得有機(jī)砸含量在2.0-5.0mg/g的富砸米曲霉。
[0032]第三方面，本發(fā)明還提供了采用如第二方面所述富砸米曲霉的分離篩選方法分離篩選得到的富砸米曲霉。
[0033]經(jīng)上述分離篩選方法得到的富砸米曲霉中富砸能力相對(duì)較強(qiáng)的菌株為第一方面所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035，將其培養(yǎng)后干燥制成粉末狀產(chǎn)品，其有機(jī)砸含量可達(dá)到4.7mg/g0
[0034]經(jīng)上述分離篩選方法得到的富砸米曲霉除了米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035以外，還可得到米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY033、米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY036和米曲霉菌株(AspergiIIus oryzae)YSY032，其有機(jī)砸含量均在2.0-5.0mg/g范圍內(nèi)。
[0035]第四方面，本發(fā)明還提供了一種提高米曲霉砸含量的方法，包括如下步驟:
[0036](I)將米曲霉菌株接種于察氏培養(yǎng)基，25_28°C培養(yǎng)4-7d，得到斜面孢子；
[0037](2)將斜面孢子接種于PDA培養(yǎng)基中，25_28°C培養(yǎng)4-7d，得到活化的孢子；
[0038](3)收集活化的孢子接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24_48h，然后以2_10%的接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48-72h;所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:淀粉10-20g/L，蛋白胨2_10g/L，磷酸二氫鉀l-2g/L，硫酸鎂0.5-lg/L，硫酸銨0.5-lg/L，亞砸酸鈉0.1-0.5g/L ；
[0039](4)收集菌體，清洗并干燥。
[0040]根據(jù)本發(fā)明，步驟(I)所述察氏培養(yǎng)基的組成為:硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂0.58，氯化鉀0.58，硫酸亞鐵0.018，蔗糖3(^，瓊脂158，水10001^，？!1值7.1-7.5。
[0041 ]根據(jù)本發(fā)明，步驟(2)所述TOA培養(yǎng)基的組成為:去皮土豆200g加500-1000mL水，加熱至沸騰，維持20-30min，4層紗布過濾，濾液補(bǔ)充水分到100mL，加入葡萄糖20g和瓊脂15-20go
[0042]根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)所述種子培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖10_20g，酵母浸粉l_5g，蛋白胨2-5g，硫酸銨l-2g，磷酸二氫鉀l-2g，硫酸鎂0.5-lg和水1000mL。
[0043]根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:淀粉20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氫鉀I g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸銨0.5g/L和亞砸酸鈉0.2g/L。
[0044]本發(fā)明中通過對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源和碳源進(jìn)行優(yōu)化，以蛋白胨為主要氮源的培養(yǎng)基米曲霉富砸效果最好，酵母浸粉次之;采用上述組成的發(fā)酵培養(yǎng)基，能夠大大增加米曲霉的富砸效果，使其培養(yǎng)后干燥制成粉末狀產(chǎn)品，砸含量可達(dá)到8.0-11.0mg/g，有機(jī)砸含量為7.0-10.5mg/g，富砸米曲霉生物量的干重為20-25g/L。
[0045]示例性地，本發(fā)明所述提高米曲霉砸含量的方法，具體包括如下步驟:
[0046](I)從黃酒曲中篩選出一株具有富砸米曲霉菌株；
[0047](2)將該米曲霉菌株接種于察氏培養(yǎng)基中，25_28°C培養(yǎng)4-7d，得到斜面孢子，保藏于 4。。；
[0048]所述察氏培養(yǎng)基的組成為:硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀Ig，硫酸鎂0.5g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.0lg,蔗糖30g，瓊脂15g和水100mUpH值7.1-7.5;
[0049](3)將斜面孢子接種于PDA培養(yǎng)基中，25-28°C培養(yǎng)4-7d，得到活化的孢子；
[0050]所述PDA培養(yǎng)基的組成為:去皮土豆200g加500-1000mL水，加熱至沸騰，維持20-30min，4層紗布過濾，濾液補(bǔ)充水分到lOOOmL，加入葡萄糖20g和瓊脂15-20g;
[0051](4)收集活化的孢子并將其先后進(jìn)行一級(jí)液體種子培養(yǎng)和二級(jí)液體種子培養(yǎng)，培養(yǎng)24-48h，然后以2-10 %接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48-72h ；
[0052]其中，一級(jí)液體種子培養(yǎng)用到的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基;二級(jí)液體液體種子培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖10g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，硫酸銨2g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂0.5g和水lOOOmL；
[0053]發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:淀粉20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸銨0.5g/L和亞砸酸鈉0.5g/L；
[0054](5)采用離心或者過濾的方法收集菌體，離心轉(zhuǎn)速3000-6000rpm，過濾采用紗布、濾紙或抽濾的方法；
[0055](6)對(duì)菌體進(jìn)行清洗，以除去胞外附著的無(wú)機(jī)砸，采用的方法是使用緩沖溶液或者生理鹽水洗滌，也可采用無(wú)菌水洗滌；
[0056](7)采用自然風(fēng)干、烘干或真空冷凍進(jìn)行干燥；
[0057](8)將干燥后的菌體粉碎，過篩，采用紫外分光光度法測(cè)定其總砸及有機(jī)砸的含量。
[0058]第五方面，本發(fā)明還提供了一種富砸制劑，所述富砸制劑是由富砸米曲霉制得的，存在形式為干粉;所述富砸制劑中的有機(jī)砸含量為7.0-10.5mg/g。其中的富砸米曲霉優(yōu)選采用如第一方面所述的米曲霉菌株(AspergiIIus oryzae)YSY035，也可以采用如第二方面所述的篩選方法獲得的其它富砸米曲霉菌株。
[0059]第六方面，本發(fā)明還提供了如第五方面所述富砸制劑的制備方法，包括以下步驟:
[0060](I)將斜面保藏的富砸米曲霉孢子接種于PDA斜面中，25-28°C培養(yǎng)4-7d，進(jìn)行活化；
[0061 ] (2)將活化的孢子接種于裝有PDA的茄子瓶斜面中，25-28°C培養(yǎng)4-7d，進(jìn)行活化；
[0062](3)收集茄子瓶中的孢子先后進(jìn)行一級(jí)液體種子培養(yǎng)和二級(jí)液體種子培養(yǎng)；
[0063](4)將二級(jí)種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；
[0064](5)收集菌體，清洗并干燥。
[0065]根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)中用到的一級(jí)液體種子培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基;二級(jí)液體種子培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖10g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，硫酸銨2g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂0.5g和水 lOOOmL。
[0066]優(yōu)選地，步驟(4)所述發(fā)酵培養(yǎng)用到的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:淀粉20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸銨0.5g/L和亞砸酸鈉0.5g/L。
[0067]示例性地，所述富砸制劑的制備方法，具體包括以下步驟:
[0068](I)將斜面保藏的富砸米曲霉孢子接種于PDA斜面中28°C培養(yǎng)4d，進(jìn)行活化；
[0069](2)將活化的孢子接種于裝有60mL PDA的茄子瓶斜面中，28°C培養(yǎng)4_7d，進(jìn)行活化；
[0070](3)收集茄子瓶中孢子進(jìn)行一級(jí)液體種子培養(yǎng)；
[0071 ]所述一級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:去皮土豆200g加適量水，加熱至沸騰，維持20-30min，4層紗布過濾，濾液補(bǔ)充水分到lOOOmL，加入葡萄糖20g和瓊脂15-20g;
[0072](4)將一級(jí)液體種子培養(yǎng)液接種于二級(jí)種子罐中進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)；
[0073]所述二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖10g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，硫酸銨2g，磷酸二氫鉀Ig，硫酸鎂0.5g和水100mL;
[0074](5)將二級(jí)種子培養(yǎng)液接種到體積為500-1000L的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，裝液量為50?80% (體積)；發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:淀粉20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸銨0.5g/L和亞砸酸鈉0.5g/L ；
[0075](6)采用疊片式分離機(jī)或者板框過濾對(duì)菌體進(jìn)行收集，洗滌除去胞外砸；
[0076](7)采用烘箱或者冷凍干燥的方法對(duì)菌體進(jìn)行干燥，制成粉末狀產(chǎn)品，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行砸含量的測(cè)定。
[0077]根據(jù)本發(fā)明，所述富砸制劑的制備方法中用到的富砸米曲霉優(yōu)選采用如第一方面所述的米曲霉菌株(AspergiIIus oryzae)YSY035，也可以采用如第二方面所述的篩選方法獲得的其它富砸米曲霉菌株。
[0078]第七方面，本發(fā)明還提供了如第一方面所述的米曲霉菌株YSY035或第三方面所述的富砸米曲霉或如第五方面所述的富砸制劑在食品或保健品中的應(yīng)用。
[0079]其中，可以將所述米曲霉菌株或富砸制劑用于果蔬、飲料或保健品中，作為食品和保健品的添加劑，可進(jìn)行持續(xù)補(bǔ)砸，有效防治因缺砸引起的疾病。
[0080]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果:
[0081 ]本發(fā)明提供的米曲霉菌株YSY035菌株以及由本發(fā)明提供的富砸米曲霉分離篩選方法中獲得的其它富砸米曲霉，其均具有富砸效率高、易于培養(yǎng)和對(duì)培養(yǎng)基要求低的特點(diǎn)，在對(duì)其培養(yǎng)后干燥制成粉末狀產(chǎn)品，砸含量可達(dá)到8.0-11.0mg/g，有機(jī)砸含量為7.0-10.5mg/g，富砸米曲霉生物量的干重可達(dá)到20-25g/L。
【附圖說明】
[0082]圖1示出了實(shí)施例1中不同米曲霉菌株的有機(jī)砸含量；
[0083]圖2示出了碳源對(duì)米曲霉富砸含量的影響；
[0084]圖3示出了氮源對(duì)米曲霉富砸含量的影響。
[0085]下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。但下述的實(shí)例僅僅是本發(fā)明的簡(jiǎn)易例子，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
【具體實(shí)施方式】
[0086]下面結(jié)合附圖并通過【具體實(shí)施方式】來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0087]為更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制性的實(shí)施例如下:
[0088]實(shí)施例1
[0089]米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035菌種的分離篩選方法與鑒定:
[0090](I)菌株分離:取Ig從食品廠收集到的黃酒曲，放入1mL無(wú)菌水中，充分振蕩混勻，制備成10—1樣品稀釋液;然后采用梯度稀釋的方法連續(xù)稀釋，分別制備成10—2、10—3、10—4、10一5和10—6不同濃度的孢子懸液，吸取0.2mL不同濃度孢子懸液均勻涂布于馬丁氏培養(yǎng)基平板上，于25 °C培養(yǎng)4d，觀察并記錄菌落生長(zhǎng)狀況；
[0091]其中，馬丁氏培養(yǎng)基的組成為:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉紅水溶液3.3mL，瓊脂15_20g，水100mL，pH值自然；臨用時(shí)每10mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液0.3mL;
[0092](2)菌株純化:將馬丁氏培養(yǎng)基平板中長(zhǎng)出的單菌落接種于馬丁氏培養(yǎng)基斜面中進(jìn)行劃線保存，置于25°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4d，待菌苔長(zhǎng)出后，檢查其特征是否一致，同時(shí)制成臨時(shí)玻片，用顯微鏡檢查其是否為單一的微生物；
[0093]將斜面培養(yǎng)的菌種依次制備成10—2、10—3、10—4、10—5和10—6不同濃度孢子懸浮液，均勻涂布在馬丁氏培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，并觀察是否為同種微生物，是否為單一微生物，若不純，則重復(fù)分離和純化全過程，直至獲得純培養(yǎng)的絲狀真菌菌株。將純化后的絲狀真菌保存于察氏培養(yǎng)基斜面中，經(jīng)過形態(tài)學(xué)及分子學(xué)鑒定為米曲霉；
[0094]其中，馬丁氏培養(yǎng)基的組成為:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉紅水溶液3.3mL，瓊脂15_20g，水100mL，pH值自然；臨用時(shí)每10mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液0.3mL;
[0095](3)菌株篩選:純化后得至IjS株米曲霉，將此8株米曲霉分別點(diǎn)種于亞砸酸鈉抗性平板中觀察菌落生長(zhǎng)狀況，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得知，有富砸能力的米曲霉富砸后菌株會(huì)變成紅色，從而篩選得到具有初步富砸能力的米曲霉，結(jié)果顯示此8株米曲霉均有一定富砸能力，為了進(jìn)一步驗(yàn)證初篩結(jié)果且得到效果最好的富砸米曲霉，本實(shí)驗(yàn)采用搖瓶培養(yǎng)法，將初篩得到米曲霉菌株分別接種到搖瓶中進(jìn)行復(fù)篩，搖瓶中的培養(yǎng)基為添加有亞砸酸鈉的馬鈴薯液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組成為:去皮土豆200g加500-1000mL水，加熱至沸騰，維持20_30min，4層紗布過濾，濾液補(bǔ)充水分到100mL，加入葡萄糖20g，亞砸酸鈉的含量為0.5mg/mL ；
[0096](4)砸含量測(cè)定:采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)砸法，稱取0.1g樣品消解24h，調(diào)節(jié)pH至中性，利用鄰苯二胺的顯色檢測(cè)樣品中總砸含量及有機(jī)砸含量。選取其中富砸能力最強(qiáng)的菌株，標(biāo)記為YSY035 (如圖1所示)，其有機(jī)砸含量為4.7mg/g。
[0097]該米曲霉(Aspergillus oryzae)YSY035已于2016年5月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.12378，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0098]實(shí)施例2
[0099]米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY033的分離篩選方法:
[0100](I)菌株分離:取Ig從食品廠收集到的醬曲，放入1mL無(wú)菌水中，充分振蕩混勻，制備成10—1樣品稀釋液;然后采用梯度稀釋的方法連續(xù)稀釋，分別制備成10Λ10—3、10—4、10—5和10—6不同濃度的孢子懸液，吸取0.2mL不同濃度孢子懸液均勻涂布于馬丁氏培養(yǎng)基平板上，于25 °C培養(yǎng)6d，觀察并記錄菌落生長(zhǎng)狀況；
[0101]其中，馬丁氏培養(yǎng)基的組成為:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉紅水溶液3.3mL，瓊脂15_20g，水100mL，pH值自然；臨用時(shí)每10mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液0.3mL;
[0102](2)菌株純化:將馬丁氏培養(yǎng)基平板中長(zhǎng)出的單菌落接種于馬丁氏培養(yǎng)基斜面中進(jìn)行劃線保存，置于25°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，待菌苔長(zhǎng)出后，檢查其特征是否一致，同時(shí)制成臨時(shí)玻片，用顯微鏡檢查其是否為單一的微生物；
[0103]將斜面培養(yǎng)的菌種依次制備成10—2、10—3、10—4、10—5和10—6不同濃度孢子懸浮液，均勻涂布在馬丁氏培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，并觀察是否為同種微生物，是否為單一微生物，若不純，則重復(fù)分離和純化全過程，直至獲得純培養(yǎng)的絲狀真菌菌株。將純化后的絲狀真菌保存于察氏培養(yǎng)基斜面中，經(jīng)過形態(tài)學(xué)及分子學(xué)鑒定為米曲霉；
[0104]其中，馬丁氏培養(yǎng)基的組成為:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉紅水溶液3.3mL，瓊脂15_20g，水100mL，pH值自然；臨用時(shí)每10mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液0.3mL;
[0105](3)菌株篩選:將純化后得到的米曲霉菌株點(diǎn)種于亞砸酸鈉抗性平板中觀察菌落生長(zhǎng)狀況，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得知，有富砸能力的米曲霉富砸后菌株會(huì)變成紅色，從而篩選得到具有初步富砸能力的米曲霉，結(jié)果顯示純化后得到的米曲霉均有一定富砸能力，然后采用搖瓶培養(yǎng)法，將初篩得到米曲霉菌株接種到搖瓶中進(jìn)行復(fù)篩，搖瓶中的培養(yǎng)基為添加有亞砸酸鈉的馬鈴薯液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組成為:去皮土豆200g加500-1000mL水，加熱至沸騰，維持20min，4層紗布過濾，濾液補(bǔ)充水分到lOOOmL，加入葡萄糖20g，亞砸酸鈉的含量為
0.5mg/mL；
[0106](4)砸含量測(cè)定:采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)砸法，稱取0.1g樣品消解24h，調(diào)節(jié)pH至中性，利用鄰苯二胺的顯色檢測(cè)樣品中總砸含量及有機(jī)砸含量，得到一株富砸米曲霉菌株，標(biāo)記為YSY033，其有機(jī)砸含量為3.0mg/g。
[0107]實(shí)施例3
[0108]米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY036的分離篩選方法:
[0109](I)菌株分離:取Ig從食品廠收集到的醬曲和醬油曲，放入1mL無(wú)菌水中，充分振蕩混勻，制備成10—1樣品稀釋液;然后采用梯度稀釋的方法連續(xù)稀釋，分別制備成10—2、10一3、10—4、10—5和10—6不同濃度的孢子懸液，吸取0.2mL不同濃度孢子懸液均勻涂布于馬丁氏培養(yǎng)基平板上，于26 °C培養(yǎng)4d，觀察并記錄菌落生長(zhǎng)狀況；
[0110]其中，馬丁氏培養(yǎng)基的組成為:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉紅水溶液3.3mL，瓊脂15_20g，水100mL，pH值自然；臨用時(shí)每10mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液0.3mL;
[0111](2)菌株純化:將馬丁氏培養(yǎng)基平板中長(zhǎng)出的單菌落接種于馬丁氏培養(yǎng)基斜面中進(jìn)行劃線保存，置于25°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d，待菌苔長(zhǎng)出后，檢查其特征是否一致，同時(shí)制成臨時(shí)玻片，用顯微鏡檢查其是否為單一的微生物；
[0112]將斜面培養(yǎng)的菌種依次制備成10—2、10—3、10—4、10—5和10—6不同濃度孢子懸浮液，均勻涂布在馬丁氏培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，并觀察是否為同種微生物，是否為單一微生物，若不純，則重復(fù)分離和純化全過程，直至獲得純培養(yǎng)的絲狀真菌菌株。將純化后的絲狀真菌保存于察氏培養(yǎng)基斜面中，經(jīng)過形態(tài)學(xué)及分子學(xué)鑒定為米曲霉；
[0113]其中，馬丁氏培養(yǎng)基的組成為:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉紅水溶液3.3mL，瓊脂15_20g，水100mL，pH值自然；臨用時(shí)每10mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液0.3mL;
[0114](3)菌株篩選:將純化后得到的米曲霉菌株點(diǎn)種于亞砸酸鈉抗性平板中觀察菌落生長(zhǎng)狀況，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得知，有富砸能力的米曲霉富砸后菌株會(huì)變成紅色，從而篩選得到具有初步富砸能力的米曲霉，結(jié)果顯示純化后得到的米曲霉均有一定富砸能力，然后采用搖瓶培養(yǎng)法，將初篩得到米曲霉菌株接種到搖瓶中進(jìn)行復(fù)篩，搖瓶中的培養(yǎng)基為添加有亞砸酸鈉的馬鈴薯液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組成為:去皮土豆200g加500-1000mL水，加熱至沸騰，維持28min，4層紗布過濾，濾液補(bǔ)充水分到lOOOmL，加入葡萄糖20g，亞砸酸鈉的含量為
0.5mg/mL；
[0115](4)砸含量測(cè)定:采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)砸法，稱取0.1g樣品消解24h，調(diào)節(jié)pH至中性，利用鄰苯二胺的顯色檢測(cè)樣品中總砸含量及有機(jī)砸含量，得到一株富砸米曲霉菌株，標(biāo)記為YSY036，其有機(jī)砸含量為2.9mg/g。
[0116]實(shí)施例4
[0117]米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY032的分離篩選方法:
[0118](I)菌株分離:取Ig從食品廠收集到的醬油曲，放入1mL無(wú)菌水中，充分振蕩混勻，制備成10—1樣品稀釋液;然后采用梯度稀釋的方法連續(xù)稀釋，分別制備成10—2、10—3、10—4、10一5和10—6不同濃度的孢子懸液，吸取0.2mL不同濃度孢子懸液均勻涂布于馬丁氏培養(yǎng)基平板上，于26 0C培養(yǎng)4d，觀察并記錄菌落生長(zhǎng)狀況；
[0119]其中，馬丁氏培養(yǎng)基的組成為:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉紅水溶液3.3mL，瓊脂15_20g，水100mL，pH值自然；臨用時(shí)每10mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液0.3mL;
[0120](2)菌株純化:將馬丁氏培養(yǎng)基平板中長(zhǎng)出的單菌落接種于馬丁氏培養(yǎng)基斜面中進(jìn)行劃線保存，置于25°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d，待菌苔長(zhǎng)出后，檢查其特征是否一致，同時(shí)制成臨時(shí)玻片，用顯微鏡檢查其是否為單一的微生物；
[0121]將斜面培養(yǎng)的菌種依次制備成10—2、10—3、10—4、10—5和10—6不同濃度孢子懸浮液，均勻涂布在馬丁氏培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，并觀察是否為同種微生物，是否為單一微生物，若不純，則重復(fù)分離和純化全過程，直至獲得純培養(yǎng)的絲狀真菌菌株。將純化后的絲狀真菌保存于察氏培養(yǎng)基斜面中，經(jīng)過形態(tài)學(xué)及分子學(xué)鑒定為米曲霉；
[0122]其中，馬丁氏培養(yǎng)基的組成為:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉紅水溶液3.3mL，瓊脂15_20g，水100mL，pH值自然；臨用時(shí)每10mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液0.3mL;
[0123](3)菌株篩選:將純化后得到的米曲霉菌株點(diǎn)種于亞砸酸鈉抗性平板中觀察菌落生長(zhǎng)狀況，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得知，有富砸能力的米曲霉富砸后菌株會(huì)變成紅色，從而篩選得到具有初步富砸能力的米曲霉，結(jié)果顯示純化后得到的米曲霉均有一定富砸能力，然后采用搖瓶培養(yǎng)法，將初篩得到米曲霉菌株接種到搖瓶中進(jìn)行復(fù)篩，搖瓶中的培養(yǎng)基為添加有亞砸酸鈉的馬鈴薯液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組成為:去皮土豆200g加100mL水，加熱至沸騰，維持25min，4層紗布過濾，濾液補(bǔ)充水分到lOOOmL，加入葡萄糖20g，亞砸酸鈉的含量為0.5mg/mL；
[0124](4)砸含量測(cè)定:采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)砸法，稱取0.1g樣品消解24h，調(diào)節(jié)pH至中性，利用鄰苯二胺的顯色檢測(cè)樣品中總砸含量及有機(jī)砸含量，得到一株富砸米曲霉菌株，標(biāo)記為YSY032，其有機(jī)砸含量為2.lmg/g。
[0125]實(shí)施例5
[0126]富砸米曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化:
[0127](I)菌種:采用實(shí)施例1篩選出的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035。
[0128](2)將該米曲霉菌株接種于察氏培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)4d，得到斜面孢子，再將該斜面孢子接種于PDA培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)4d，得到活化的孢子。
[0129]其中，察氏培養(yǎng)基的組成為:硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀Ig，硫酸鎂0.5g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.0lg，蔗糖30g，瓊脂15g，水1000mL，pH值7.1-7.5;PDA培養(yǎng)基的組成為:去皮土豆200g加500-1000mL水，加熱至沸騰，維持20_30min，4層紗布過濾，濾液補(bǔ)充水分到100mL，加入葡萄糖20g和瓊脂15-20g。
[0130](3)收集活化的孢子接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，然后以2%接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h。
[0131]其中，種子培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖10_20g，酵母浸粉l_5g，蛋白胨2_5g，硫酸銨1-2g，磷酸二氫鉀l_2g，硫酸鎂0.5-lg和水1000mL。
[0132](4)考察碳源對(duì)富砸米曲霉產(chǎn)量及富砸能力的影響
[0133]基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基A:蛋白胨2g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸銨0.5g/L，亞砸酸鈉0.2g/L。
[0134]分別加入葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、淀粉(濃度為20g/L)28 V培養(yǎng)4d，收集菌體進(jìn)行清洗、干燥、粉碎，測(cè)定其總砸及有機(jī)砸含量。結(jié)果表明:該富砸米曲霉在以濃度為20g/L的淀粉作為主要碳源的培養(yǎng)基中的富砸效果最好，果糖次之(如圖2所示)。
[0135](5)考察氮源對(duì)富砸米曲霉產(chǎn)量及富砸能力的影響
[0136]基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基A:淀粉20g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸銨0.5g/L，亞砸酸鈉0.2g/L。
[0137]分別加入酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏(濃度為2g/L)28°C培養(yǎng)4d，收集菌體用無(wú)菌水進(jìn)行清洗、干燥、粉碎，測(cè)定其總砸及有機(jī)砸含量。結(jié)果表明:該富砸米曲霉在以濃度為2g/L的蛋白胨作為主要氮源的培養(yǎng)基中的富砸效果最好，酵母浸粉次之(如圖3所示)。
[0138](6)經(jīng)過碳源、氮源以及接種量、pH、溫度、培養(yǎng)時(shí)間等條件優(yōu)化，富砸米曲霉最佳的富砸配方為:淀粉20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氫鉀I g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸銨0.5g/L和亞砸酸鈉0.2g/L。也就是說，通過采用該培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基，能夠提高富砸米曲霉的砸含量。
[0139]實(shí)施例6
[0140]—種提高米曲霉砸含量的方法，包括如下步驟:
[0141 ] (I)菌種:采用實(shí)施例2篩選出的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY033。
[0142](2)將該米曲霉菌株接種于察氏培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)4d，得到斜面孢子，再將該斜面孢子接種于PDA培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)4d，得到活化的孢子。
[0143]其中，察氏培養(yǎng)基的組成為:硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀Ig，硫酸鎂0.5g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.0lg，蔗糖30g，瓊脂15g，水1000mL，pH值7.1-7.5;PDA培養(yǎng)基的組成為:去皮土豆200g加500-1000mL水，加熱至沸騰，維持20_30min，4層紗布過濾，濾液補(bǔ)充水分到100mL，加入葡萄糖20g和瓊脂15-20g。
[0144](3)收集活化的孢子接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，然后以2%接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h。
[0145]其中，種子培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖10_20g，酵母浸粉l_5g，蛋白胨2_5g，硫酸銨1-2g，磷酸二氫鉀l_2g，硫酸鎂0.5-lg和水100mL;發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:淀粉20g/L，蛋白胨2/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸銨0.5g/L和亞砸酸鈉0.2g/L。
[0146](4)收集菌體，清洗并干燥。
[0147]實(shí)施例7
[0148]一種富砸干粉的制備方法，包括以下步驟:
[0149](I)將斜面保藏的富砸米曲霉菌株(Aspergi I Ius oryzae)YSY035的孢子接種于PDA斜面中，28 °C培養(yǎng)4d，進(jìn)行活化；
[0150](2)將活化的孢子接種于裝有60mL PDA的茄子瓶斜面中，28°C培養(yǎng)7d，進(jìn)行活化；
[0151](3)收集茄子瓶中的孢子先后進(jìn)行一級(jí)液體種子培養(yǎng)和二級(jí)液體種子培養(yǎng);該步驟中用到的一級(jí)液體種子培養(yǎng)基為roA培養(yǎng)基;二級(jí)液體種子培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖1g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，硫酸錢2g，磷酸二氫鉀Ig，硫酸鎂0.5g和水lOOOmL。
[0152](4)將二級(jí)種子培養(yǎng)液接種到1000L的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:淀粉20g/L，蛋白胨2/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸銨0.5g/L和亞砸酸鈉
0.2g/L；
[0153](5)采用疊片式分離機(jī)或者板框過濾對(duì)菌體進(jìn)行收集，洗滌除去胞外砸；
[0154](6)采用烘箱或者冷凍干燥的方法對(duì)菌體進(jìn)行干燥，制成粉末狀產(chǎn)品，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行砸含量的測(cè)定，其砸含量在11.0mg/g，有機(jī)砸含量為10.5mg/g。
[0155]實(shí)施例8
[0156]一種富砸干粉的制備方法，包括以下步驟:
[0157](I)將斜面保藏的富砸米曲霉菌株(Aspergi I Ius oryzae)YSY033的孢子接種于PDA斜面中，28 °C培養(yǎng)4d，進(jìn)行活化；
[0158](2)將活化的孢子接種于裝有60mL PDA的茄子瓶斜面中，28°C培養(yǎng)7d，進(jìn)行活化；
[0159](3)收集茄子瓶中的孢子先后進(jìn)行一級(jí)液體種子培養(yǎng)和二級(jí)液體種子培養(yǎng);該步驟中用到的一級(jí)液體種子培養(yǎng)基為TOA培養(yǎng)基;二級(jí)液體種子培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖1g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，硫酸錢2g，磷酸二氫鉀Ig，硫酸鎂0.5g和水lOOOmL。
[0160](4)將二級(jí)種子培養(yǎng)液接種到1000L的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:淀粉20g/L，蛋白胨2/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸銨0.5g/L和亞砸酸鈉
0.2g/L；
[0161](5)采用疊片式分離機(jī)或者板框過濾對(duì)菌體進(jìn)行收集，洗滌除去胞外砸；
[0162](6)采用烘箱或者冷凍干燥的方法對(duì)菌體進(jìn)行干燥，制成粉末狀產(chǎn)品，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行砸含量的測(cè)定，其砸含量在9.lmg/g，其有機(jī)砸含量為8.5mg/go
[0163]實(shí)施例9
[0164]—種富砸干粉的制備方法，包括以下步驟:
[0165](I)將斜面保藏的富砸米曲霉菌株(Aspergi I Ius oryzae )YSY032的孢子接種于PDA斜面中，28 °C培養(yǎng)4d，進(jìn)行活化；
[0166](2)將活化的孢子接種于裝有60mL PDA的茄子瓶斜面中，28°C培養(yǎng)7d，進(jìn)行活化；
[0167](3)收集茄子瓶中的孢子先后進(jìn)行一級(jí)液體種子培養(yǎng)和二級(jí)液體種子培養(yǎng);該步驟中用到的一級(jí)液體種子培養(yǎng)基為TOA培養(yǎng)基;二級(jí)液體種子培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖1g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，硫酸錢2g，磷酸二氫鉀Ig，硫酸鎂0.5g和水lOOOmL。
[0168](4)將二級(jí)種子培養(yǎng)液接種到1000L的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:淀粉20g/L，蛋白胨2/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸銨0.5g/L和亞砸酸鈉
0.2g/L；
[0169](5)采用疊片式分離機(jī)或者板框過濾對(duì)菌體進(jìn)行收集，洗滌除去胞外砸；
[0170](6)采用烘箱或者冷凍干燥的方法對(duì)菌體進(jìn)行干燥，制成粉末狀產(chǎn)品，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行砸含量的測(cè)定，其砸含量在8.2mg/g，有機(jī)砸含量為7.lmg/g ο
[0171]實(shí)施例10
[0172]將實(shí)施例7-9制得的富砸干粉添加到面粉中，其添加量為20-30mg/kg，可以做成砸含量在200-300yg/kg的蛋撻、蝴蝶酥、老婆餅等富砸糕點(diǎn)，達(dá)到增強(qiáng)砸的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化的目的。
[0173]另外，還可將上述制得的富砸干粉添加到果蔬、飲料或保健品中，同樣能夠達(dá)到增強(qiáng)砸的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化的目的。
[0174]通過上述實(shí)施例可以看出，本發(fā)明提供的米曲霉菌株YSY035菌株以及由本發(fā)明提供的富砸米曲霉分離篩選方法中獲得的其它富砸米曲霉，其均具有富砸效率高、易于培養(yǎng)和對(duì)培養(yǎng)基要求低的特點(diǎn)，在對(duì)其培養(yǎng)后干燥制成粉末狀產(chǎn)品，砸含量可達(dá)到8.0-11.0mg/g，有機(jī)砸含量為7.0-10.5mg/g，富砸米曲霉生物量的干重可達(dá)到20-25g/L，其在果蔬、飲料、糕點(diǎn)或保健品中，均能夠達(dá)到增強(qiáng)砸的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化的目的。
[0175]
【申請(qǐng)人】聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
[0176]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0177]另外需要說明的是，在上述【具體實(shí)施方式】中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說明。
[0178]此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種米曲霉菌株(Aspergillusoryzae)YSY035，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2016年5月11日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.12378。2.—種富砸米曲霉的分離篩選方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)菌種分離； (2)菌種純化; (3)富砸米曲霉初篩:將得到的純種米曲霉點(diǎn)種于亞砸酸含量為0.1-0.5mg/mL的亞砸酸鈉抗性平板中觀察菌落生長(zhǎng)狀況，當(dāng)菌株變成紅色時(shí)，初篩得到具有富砸能力的米曲霉菌株； (4)富砸米曲霉復(fù)篩:將初篩得到的米曲霉菌株接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)3-4d，然后測(cè)定該富砸米曲霉的砸含量，篩選得到有機(jī)砸含量在2.0-5.0mg/g的富砸米曲霉O3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述菌種分離是將收集到的樣品利用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋，再將其加入到馬丁氏培養(yǎng)基平板中進(jìn)行涂布； 優(yōu)選地，步驟(2)所述菌種純化是將步驟(I)分離的單菌落用無(wú)菌接種環(huán)挑取置于無(wú)菌水中稀釋，接種于馬丁氏培養(yǎng)基進(jìn)行單菌落培養(yǎng)，25-28°C培養(yǎng)3-4d，反復(fù)多次直至平皿中菌落形態(tài)一致，得到純種絲狀真菌； 優(yōu)選地，步驟(I)和步驟(2)所述馬丁氏培養(yǎng)基的組成為:ΚΗ2Ρ04 lg,MgSO4.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉紅水溶液3.3mL，瓊脂15_20g，水100mL，pH值自然；臨用時(shí)每I OOmL培養(yǎng)基中加I %鏈霉素液0.3mL。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述富砸米曲霉復(fù)篩中，馬鈴薯液體培養(yǎng)基的組成為:去皮土豆200g加500-1000mL水，加熱至沸騰，維持20-30min，4層紗布過濾，濾液補(bǔ)充水分到100mL，加入葡萄糖20g，亞砸酸鈉的含量為0.5mg/mL; 優(yōu)選地，步驟(4)所述砸含量的測(cè)定采用分光光度計(jì)法進(jìn)行； 優(yōu)選地，所述分光光度計(jì)法是采用鄰苯二胺為顯色劑檢測(cè)樣品中的總砸含量和無(wú)機(jī)砸含量，通過差減法獲得有機(jī)砸含量。5.根據(jù)權(quán)利要求2-4之一所述的富砸米曲霉的分離篩選方法分離篩選得到的富砸米曲霉O6.一種提高米曲霉砸含量的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將米曲霉菌株接種于察氏培養(yǎng)基中，25-28°C培養(yǎng)4-7d，得到斜面孢子； (2)將斜面孢子接種于PDA培養(yǎng)基中，25-28°C培養(yǎng)4_7d，得到活化的孢子； (3)收集活化的孢子接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24-48h，然后以2-10%的接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48-72h;所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:淀粉10-20g/L，蛋白胨2_10g/L，磷酸二氫鉀l_2g/L，硫酸鎂0.5-lg/L，硫酸銨0.5-lg/L和亞砸酸鈉0.1-0.5g/L ； (4)收集菌體，清洗并干燥。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述察氏培養(yǎng)基的組成為:硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀Ig，硫酸鎂0.5g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.0lg,鹿糖30g，瓊脂15g，水100mL，pH值7.1-7.5; 優(yōu)選地，步驟(2)所述PDA培養(yǎng)基的組成為:去皮土豆200g加500-1OOOmL水，加熱至沸騰，維持20-30min，4層紗布過濾，濾液補(bǔ)充水分到100mL，加入葡萄糖20g和瓊脂15_20g; 優(yōu)選地，步驟(3)所述種子培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖10-20g，酵母浸粉l-5g，蛋白胨2-5g，硫酸銨l_2g，磷酸二氫鉀l-2g，硫酸鎂0.5-lg和水100mL; 優(yōu)選地，步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:淀粉20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸銨0.5g/L和亞砸酸鈉0.2g/L。8.—種富砸制劑，其特征在于，所述富砸制劑是由富砸米曲霉制得的，存在形式為干粉;所述富砸制劑中的有機(jī)砸含量為7.0-10.5mg/go9.根據(jù)權(quán)利要求8所述富砸制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將斜面保藏的富砸米曲霉孢子接種于PDA斜面中，25-28°C培養(yǎng)4-7d，進(jìn)行活化； (2)將活化的孢子接種于裝有PDA的茄子瓶斜面中，25-28°C培養(yǎng)4-7d，進(jìn)行活化； (3)收集前子瓶中的孢子先后進(jìn)行一級(jí)液體種子培養(yǎng)和二級(jí)液體種子培養(yǎng)； (4)將二級(jí)種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)； (5)收集菌體，清洗并干燥； 優(yōu)選地，步驟(3)中用到的一級(jí)液體種子培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基;二級(jí)液體種子培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖10g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，硫酸銨2g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂0.5g和水100mL。10.如權(quán)利要求1所述的米曲霉菌株YSY035或權(quán)利要求5所述的富砸米曲霉或如權(quán)利要求8所述的富砸制劑在食品或保健品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK105907652SQ201610510932
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月30日
【發(fā)明人】于贊, 毛亮
【申請(qǐng)人】北京源生元科技發(fā)展有限公司