一種樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法及其制備的樟芝發(fā)酵谷物粉的制作方法
【專利摘要】根據(jù)本發(fā)明提供的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，由于將樟芝液態(tài)發(fā)酵與固態(tài)發(fā)酵偶聯(lián)起來，利用液態(tài)發(fā)酵后離心廢棄的上清液進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，代替原本固態(tài)發(fā)酵時(shí)浸泡谷物培養(yǎng)基中所用的自來水，一方面上清液中含有利于菌體生長的營養(yǎng)成分，加快了固態(tài)發(fā)酵過程中菌體生長速度，有利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用；另一方面，該方法節(jié)約了生產(chǎn)發(fā)酵用水，減少了液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的排放，進(jìn)而減輕了環(huán)境壓力，是一種綠色生產(chǎn)技術(shù)；根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法所得到的樟芝谷物粉，和非偶聯(lián)的固態(tài)發(fā)酵方法所得到的樟芝谷物粉相比，其中的安卓奎諾爾以及安卓奎諾爾B的含量存在顯著提高。CGMCC NO.959020140909
【專利說明】
一種樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法及其制備的樟芝發(fā)酵谷物粉
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明公開了一種樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法粉，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]樟芝菌，又名牛樟芝，是我國臺(tái)灣特有的珍稀食用和藥用真菌，其子實(shí)體寄生于牛樟樹樹干腐朽的內(nèi)壁，或倒伏在地上靠近土表的無樹皮表面，具有強(qiáng)烈的牛樟樹香氣，可產(chǎn)三萜、多糖、留醇、苯環(huán)類化合物等多種活性成分。樟芝子實(shí)體極難培育，且產(chǎn)量極低，很難滿足目前市場需求，因此許多學(xué)者開發(fā)了人工培養(yǎng)方式。樟芝人工培養(yǎng)物具有保肝、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力、抗炎癥等藥理活性。尤其是馬來酸和琥珀酸衍生物以及泛醌類化合物，在保肝、抗癌方面具有卓越的療效。
[0003]樟芝菌固態(tài)發(fā)酵，可以利用太空包或是三角瓶等進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)1-3個(gè)月時(shí)間，可以得到與子實(shí)體相近的成分，但是在特征成分上還是有一定差異。與深層液態(tài)發(fā)酵法相比，固態(tài)發(fā)酵條件下，樟芝生長良好，并產(chǎn)生大量的胞外酶以及芳香性成分，產(chǎn)品的性狀和得率也得到較好的改善，然而目前樟芝固態(tài)發(fā)酵還處于起步階段，諸如培養(yǎng)條件、活性成分與功能的分析、大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)等方面還存在較多問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是是提供一種樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，將樟芝菌液態(tài)發(fā)酵與固態(tài)發(fā)酵偶聯(lián)，培養(yǎng)出的樟芝發(fā)酵谷物經(jīng)簡單烘干粉碎即可制成泛醌類活性成分產(chǎn)量顯著提高的樟芝谷物粉。
[0005]本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
[0006]本發(fā)明提供的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0007]步驟一，液態(tài)種子的培養(yǎng):以樟芝菌株(Antrodia camphorata)S_29為生產(chǎn)菌株，接入到液態(tài)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到液態(tài)種子；
[0008]步驟二，液態(tài)發(fā)酵:將液態(tài)種子按一定接入比例接入到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度28°C的條件下培養(yǎng)8-12天，得到樟芝發(fā)酵液；
[0009]步驟三，固液分離:將樟芝發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，得到上清液以及樟芝菌絲體；
[0010]步驟四，谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的浸泡:將上清液與自來水按一定加入比例加入到谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在15?30°C的條件下對谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行浸泡6-20小時(shí)，得到混合谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0011 ]步驟五，固態(tài)發(fā)酵:按步驟一制作新的液態(tài)種子，將新的液態(tài)種子按一定新的接入比例接入到混合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度28°C的條件下，進(jìn)行15?25天的固態(tài)發(fā)酵，得到樟芝發(fā)酵谷物。
[0012]本發(fā)明提供的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，還具有這樣的特征，其中，在步驟二中，接入比例為每I OOml液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入8?20ml的液態(tài)種子。
[0013]本發(fā)明提供的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，還具有這樣的特征，其中，在步驟四中，加入比例為每10g谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入總體積為60-100ml的發(fā)酵上清夜和自來水，總體積中的上清液和自來水的體積比為I: 4?7:1。
[0014]本發(fā)明提供的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，還具有這樣的特征，其中，其中，在步驟五中，谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的主體物質(zhì)為糧食谷物類，新的接入比例為每10g糧食谷物類中接入1?40m I的新的液態(tài)種子。
[0015]本發(fā)明提供的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，還具有這樣的特征，其中，糧食谷物類為玉米、黑米、大米、小米、青稞中的任意一種或至少任意兩種的組合。
[0016]本發(fā)明提供的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，還具有這樣的特征，其中，步驟二中得到的樟芝菌絲體，經(jīng)冷凍干燥，得到樟芝菌絲體產(chǎn)物。
[0017]本發(fā)明提供的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，還具有這樣的特征，其中，步驟五中得到的樟芝發(fā)酵谷物，經(jīng)烘干粉碎后得到樟芝發(fā)酵谷物粉。
[0018]本發(fā)明還提供一致根據(jù)上述的的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法得到的樟芝發(fā)酵谷物粉，其特征在于，每Ig樟芝發(fā)酵谷物粉中含有2.4?4.5mg的安卓奎諾爾、2.1?3.9mg的安卓奎諾爾B。
[0019]發(fā)明作用與效果
[0020]根據(jù)本發(fā)明提供的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，由于將樟芝液態(tài)發(fā)酵與固態(tài)發(fā)酵偶聯(lián)起來，利用液態(tài)發(fā)酵后離心廢棄的上清液進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，代替原本固態(tài)發(fā)酵時(shí)浸泡谷物培養(yǎng)基中所用的自來水，一方面上清液中含有利于菌體生長的營養(yǎng)成分，加快了固態(tài)發(fā)酵過程中菌體生長速度，有利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用；另一方面，該方法節(jié)約了生產(chǎn)發(fā)酵用水，減少了液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的排放，進(jìn)而減輕了環(huán)境壓力，是一種綠色生產(chǎn)技術(shù)。
[0021]另外，根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法所得到的樟芝谷物粉，和非偶聯(lián)的固態(tài)發(fā)酵方法所得到的樟芝谷物粉相比，其中的安卓奎諾爾以及安卓奎諾爾B的含量存在顯著提尚O
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。對于實(shí)施例中所用到的具體方法或材料，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明技術(shù)思路的基礎(chǔ)上，根據(jù)已有的技術(shù)進(jìn)行常規(guī)的替換選擇，而不僅限于本發(fā)明實(shí)施例的具體記載。
[0023]下述實(shí)施實(shí)例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法;所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0024]對照例
[0025]本對照例為對照實(shí)施例，采用非偶聯(lián)發(fā)酵方法，進(jìn)行樟芝谷物粉的制備。包括以下步驟:
[0026]步驟一，準(zhǔn)備階段，
[0027]斜面培養(yǎng)基:采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基；
[0028]液態(tài)種子培養(yǎng)基組成為(g/L):每IL液態(tài)培養(yǎng)基中包括葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、玉米楽粉2g ；
[0029]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:采用以下谷物玉米、黑米、大米、小米、青稞中的任意一種或任意兩種以上作為基本料制成谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，本實(shí)施例中的固態(tài)培養(yǎng)基組成為:每100ml的錐形瓶中包括玉米100g、大豆蛋白胨0.6g、MgS04 0.05g,KH2PO4 0.05g；
[0030]生產(chǎn)菌株:米用牛樟芝菌株(Antrodia camphorata)S_29為生產(chǎn)菌株。該牛樟芝菌株(Antrodia ?&11^)110瓜七3)3-29已于2014年09月09日保藏于中國普通微生物保藏中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，其保藏編號為CGMCC 9590。
[0031]步驟二，激活菌種，
[0032]將準(zhǔn)備好的樟芝菌株在斜面培養(yǎng)基內(nèi)在溫度28°C的條件下培養(yǎng)12天，得到激活的樟芝菌種。
[0033]步驟三，培養(yǎng)液態(tài)種子，
[0034]將步驟二激活得到的樟芝菌種接入到液態(tài)種子培養(yǎng)基中，在溫度30°C的條件下培養(yǎng)3天得到液態(tài)種子。
[0035]步驟四，浸泡谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，按以下比例向谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入自來水:每10g玉米中加入80ml ；
[0036]然后在溫度25°C的條件下浸泡谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基15個(gè)小時(shí)。
[0037]步驟五，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，
[0038]將以下接入比例將步驟三得到的液態(tài)種子接入自來水浸泡后的谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中:每10g谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入20ml的液態(tài)種子，在溫度28°C的條件下進(jìn)行20天的固態(tài)發(fā)酵，得到樟芝發(fā)酵谷物。
[0039]步驟五，將發(fā)酵谷物放入烘箱內(nèi)，在40°C下烘干，然后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，得到樟芝發(fā)酵谷物粉。
[0040]產(chǎn)物成分分析
[0041]采用高效液相色譜法(HPLC)對根據(jù)本實(shí)施例的方法所得到的樟芝發(fā)酵谷物粉進(jìn)行分析，具體分析方法如下:
[0042]取烘干粉碎的牛樟芝液態(tài)發(fā)酵菌粉末0.5g，加入60ml乙醇，50°C，振蕩萃取1.5h，靜置后取上清經(jīng)過0.22μπι濾膜微濾，進(jìn)行HPLC分析。分析條件如下:色譜柱:SepaxAmethyst C18(4.6mmX 250mm);流速:lmL/min;檢測波長:254nm;流動(dòng)相A:水/乙酸=100/
0.5，流動(dòng)相B:乙腈；洗脫梯度如下:0-10min，流動(dòng)相B 35%-50% ； 10_35min，流動(dòng)相B50%-60% ;35-50min，流動(dòng)相B 60%-80% ;50_60min，流動(dòng)相B 80%-100%。
[0043]分析表明本實(shí)施例得到的每Ig樟芝發(fā)酵谷物粉中含有2.2mg的安卓奎諾爾、1.5mg的安卓奎諾爾B。
[0044]實(shí)施例1
[0045]本實(shí)施例提供的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵，包括以下步驟:
[0046]步驟一，準(zhǔn)備階段，
[0047]斜面培養(yǎng)基:采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基；
[0048]液態(tài)種子培養(yǎng)基組成為:每IL液態(tài)培養(yǎng)基中包括葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、玉米漿粉2g;
[0049]液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:每IL液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中包括葡萄糖
[0050]40g、胰蛋白胨5g、玉米漿粉2g、K2HP04 0.3g,MgSO4 0.3g，
[0051 ]所用液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基需在115°C下滅菌20min;
[0052]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:采用以下谷物玉米、黑米、大米、小米、青稞中的任意一種或任意兩種以上作為基本料制成谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，本實(shí)施例中的固態(tài)培養(yǎng)基組成為:每100ml的錐形瓶中包括玉米100g、大豆蛋白胨0.6g、MgS04 0.05g,KH2PO4 0.05g；
[0053]生產(chǎn)菌株:米用牛樟芝菌株(Antrodia camphorata)S_29為生產(chǎn)菌株。該牛樟芝菌株(Antrodia ?&11^)110瓜七3)3-29已于2014年09月09日保藏于中國普通微生物保藏中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，其保藏編號為CGMCC 9590。
[0054]步驟二，激活菌種，
[0055]將準(zhǔn)備好的樟芝菌株在斜面培養(yǎng)基內(nèi)在溫度28°C的條件下培養(yǎng)12天，得到激活的樟芝菌種。
[0056]步驟三，培養(yǎng)液態(tài)種子，
[0057]將步驟一激活得到的樟芝菌種接入到液態(tài)種子培養(yǎng)基中，在溫度30°C的條件下培養(yǎng)3天得到液態(tài)種子。
[0058]步驟四，液態(tài)發(fā)酵，
[0059]將液態(tài)種子按如下接入比例接入到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中:每10ml液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入8ml的液態(tài)種子，
[0060]之后在培養(yǎng)溫度28°C的條件下培養(yǎng)8天，得到樟芝發(fā)酵液。
[0061]步驟五，固液分離，
[0062]將樟芝發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，得到上清液以及樟芝菌絲體；
[0063]另外，將該步驟中得到的樟芝菌絲體經(jīng)冷凍干燥，可得到樟芝菌絲體產(chǎn)物。
[0064]步驟六，谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的浸泡，
[0065]將上清液與自來水按如下加入比例加入到谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中:每10g谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入總體積為60ml的發(fā)酵上清夜和自來水，并且總體積中的發(fā)酵上清液和自來水的體積比為1:4;
[0066]然后在15°C的條件下對谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行浸泡10小時(shí)，得到混合谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0067]步驟七，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，
[0068]按步驟一制作新的液態(tài)種子，將新的液態(tài)種子按如下的新的接入比例接入到混合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中:每10g混合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入1ml的新的液態(tài)種子；
[0069]然后在溫度28°C的條件下，進(jìn)行15天的固態(tài)發(fā)酵，得到樟芝發(fā)酵谷物。
[0070]步驟八，將步驟七得到的樟芝發(fā)酵谷物放入烘箱內(nèi)，在400C下烘干，然后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，能得到樟芝發(fā)酵谷物粉。
[0071 ]產(chǎn)物成分分析
[0072]采用高效液相色譜法(HPLC)對根據(jù)本實(shí)施例的方法所得到的樟芝發(fā)酵谷物粉進(jìn)行分析，具體分析方法如下:
[0073]取烘干粉碎的牛樟芝液態(tài)發(fā)酵菌粉末0.5g，加入60ml乙醇，50°C，振蕩萃取1.5h，靜置后取上清經(jīng)過0.22μπι濾膜微濾，進(jìn)行HPLC分析。分析條件如下:色譜柱:SepaxAmethyst C18(4.6mmX 250mm);流速:lmL/min;檢測波長:254nm;流動(dòng)相A:水/乙酸=100/
0.5，流動(dòng)相B:乙腈；洗脫梯度如下:0-10min，流動(dòng)相B 35%-50% ； 10_35min，流動(dòng)相B50%-60% ;35-50min，流動(dòng)相B 60%-80% ;50_60min，流動(dòng)相B 80%-100%。
[0074]分析表明本實(shí)施例得到的每Ig樟芝發(fā)酵谷物粉中含有2.4mg的安卓奎諾爾2.1mg的安卓奎諾爾B。
[0075]實(shí)施例2
[0076]本實(shí)施例提供的樟芝固態(tài)偶聯(lián)發(fā)酵，包括以下步驟:
[0077]步驟一，準(zhǔn)備階段，
[0078]斜面培養(yǎng)基:采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基；
[0079]液態(tài)種子培養(yǎng)基組成為:每IL液態(tài)培養(yǎng)基中包括葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、玉米漿粉2g;
[0080]液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:每IL液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中包括葡萄糖[0081 ] 40g、胰蛋白胨5g、玉米漿粉2g、K2HP04 0.3g,MgSO4 0.3g，
[0082]所用液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基需在115°C下滅菌20min;
[0083]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:采用以下谷物玉米、黑米、大米、小米、青稞中的任意一種或任意兩種以上作為基本料制成谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，本實(shí)施例中的固態(tài)培養(yǎng)基組成為:每100ml的錐形瓶中包括玉米100g、大豆蛋白胨0.6g、MgS04 0.05g,KH2PO4 0.05g；
[0084]生產(chǎn)菌株:米用牛樟芝菌株(Antrodia camphorata)S_29為生產(chǎn)菌株。該牛樟芝菌株(Antrodia camphorata)S_29已于年月日保藏于中國普通微生物保藏中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，其保藏編號為CGMCC 9590。
[0085]步驟二，激活菌種，
[0086]將準(zhǔn)備好的樟芝菌株在斜面培養(yǎng)基內(nèi)在溫度28°C的條件下培養(yǎng)12天，得到激活的樟芝菌種。
[0087]步驟三，培養(yǎng)液態(tài)種子，
[0088]將步驟一激活得到的樟芝菌種接入到液態(tài)種子培養(yǎng)基中，在溫度30°C的條件下培養(yǎng)3天得到液態(tài)種子。
[0089]步驟四，液態(tài)發(fā)酵，
[0090]將液態(tài)種子按如下接入比例接入到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中:每10ml液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入14ml的液態(tài)種子，
[0091]之后在培養(yǎng)溫度28°C的條件下培養(yǎng)10天，得到樟芝發(fā)酵液。
[0092]步驟五，固液分離，
[0093]將樟芝發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，得到上清液以及樟芝菌絲體；
[0094]另外，將該步驟中得到的樟芝菌絲體經(jīng)冷凍干燥，可得到樟芝菌絲體產(chǎn)物。
[0095]步驟六，谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的浸泡，
[0096]將上清液與自來水按如下加入比例加入到谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中:每10g谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入總體積為80ml的發(fā)酵上清夜和自來水，并且總體積中的發(fā)酵上清液和自來水的體積比為1:1;
[0097]然后在25°C的條件下對谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行浸泡15小時(shí)，得到混合谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0098]步驟七，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，
[0099]按步驟一制作新的液態(tài)種子，將新的液態(tài)種子按如下的新的接入比例接入到混合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中:每10g混合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入25ml的新的液態(tài)種子；
[0100]然后在溫度280C的條件下，進(jìn)行20天的固態(tài)發(fā)酵，得到樟芝發(fā)酵谷物。[0101 ]步驟八，將步驟七得到的樟芝發(fā)酵谷物放入烘箱內(nèi)，在400C下烘干，然后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，能得到樟芝發(fā)酵谷物粉。
[0102]產(chǎn)物成分分析
[0103]采用高效液相色譜法(HPLC)對根據(jù)本實(shí)施例的方法所得到的樟芝發(fā)酵谷物粉進(jìn)行分析，具體分析方法如下:
[0104]取烘干粉碎的牛樟芝液態(tài)發(fā)酵菌粉末0.5g，加入60ml乙醇，50 °C，振蕩萃取1.5h，靜置后取上清經(jīng)過0.22μπι濾膜微濾，進(jìn)行HPLC分析。分析條件如下:色譜柱:SepaxAmethyst C18(4.6mmX 250mm);流速:lmL/min;檢測波長:254nm;流動(dòng)相A:水/乙酸=100/
0.5，流動(dòng)相B:乙腈；洗脫梯度如下:0-10min，流動(dòng)相B 35%-50% ； 10_35min，流動(dòng)相B50%-60% ;35-50min，流動(dòng)相B 60%-80% ;50_60min，流動(dòng)相B 80%-100%。
[0105]分析表明本實(shí)施例得到的每Ig樟芝發(fā)酵谷物粉中含有4.5mg的安卓奎諾爾3.9mg的安卓奎諾爾B。
[0106]實(shí)施例3
[0107]本實(shí)施例提供的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵，包括以下步驟:
[0108]步驟一，準(zhǔn)備階段，
[0109]斜面培養(yǎng)基:采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基；
[0110]液態(tài)種子培養(yǎng)基組成為:每IL液態(tài)培養(yǎng)基中包括葡萄糖20g、胰蛋白胨4g、玉米漿粉2g;
[0111]液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:每IL液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中包括葡萄糖40g、胰蛋白胨5g、玉米漿粉2g、K2HP04 0.3g,MgSO4 0.3g，所用液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基需在115°C下滅菌20min;
[0112]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:采用以下谷物玉米、黑米、大米、小米、青稞中的任意一種或任意兩種以上作為基本料制成谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，本實(shí)施例中的固態(tài)培養(yǎng)基組成為:每100ml的錐形瓶中包括玉米100g、大豆蛋白胨0.6g、MgS04 0.05g,KH2PO4 0.05g；
[0113]生產(chǎn)菌株:米用牛樟芝菌株(Antrodia camphorata)S-29為生產(chǎn)菌株。該牛樟芝菌株(Antrodia ?&11^)110瓜七3)3-29已于2014年09月09日保藏于中國普通微生物保藏中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，其保藏編號為CGMCC 9590
[0114]步驟二，激活菌種，
[0115]將準(zhǔn)備好的樟芝菌株在斜面培養(yǎng)基內(nèi)在溫度28°C的條件下培養(yǎng)12天，得到激活的樟芝菌種。
[0116]步驟三，培養(yǎng)液態(tài)種子，
[0117]將步驟一激活得到的樟芝菌種接入到液態(tài)種子培養(yǎng)基中，在溫度30°C的條件下培養(yǎng)3天得到液態(tài)種子。
[0118]步驟四，液態(tài)發(fā)酵，
[0119]將液態(tài)種子按如下接入比例接入到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中:每10ml液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入20ml的液態(tài)種子，
[0120]之后在培養(yǎng)溫度28°C的條件下培養(yǎng)12天，得到樟芝發(fā)酵液。
[0121]步驟五，固液分離，
[0122]將樟芝發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，得到上清液以及樟芝菌絲體；
[0123]另外，將該步驟中得到的樟芝菌絲體經(jīng)冷凍干燥，可得到樟芝菌絲體產(chǎn)物。
[0124]步驟六，谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的浸泡，
[0125]將上清液與自來水按如下加入比例加入到谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中:每10g谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入總體積為10ml的發(fā)酵上清夜和自來水，并且總體積中的發(fā)酵上清液和自來水的體積比為7:1 ；
[0126]然后在30°C的條件下對谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行浸泡20小時(shí)，得到混合谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0127]步驟七，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，
[0128]按步驟一制作新的液態(tài)種子，將新的液態(tài)種子按如下的新的接入比例接入到混合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中:每10g混合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入40ml的新的液態(tài)種子；
[0129]然后在溫度28°C的條件下，進(jìn)行25天的固態(tài)發(fā)酵，得到樟芝發(fā)酵谷物。
[0130]步驟八，將步驟七得到的樟芝發(fā)酵谷物放入烘箱內(nèi)，在400C下烘干，然后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，能得到樟芝發(fā)酵谷物粉。
[0131]產(chǎn)物成分分析
[0132]采用高效液相色譜法(HPLC)對根據(jù)本實(shí)施例的方法所得到的樟芝發(fā)酵谷物粉進(jìn)行分析，具體分析方法如下:
[0133]取烘干粉碎的牛樟芝液態(tài)發(fā)酵菌粉末0.5g，加入60ml乙醇，50 °C，振蕩萃取1.5h，靜置后取上清經(jīng)過0.22μπι濾膜微濾，進(jìn)行HPLC分析。分析條件如下:色譜柱:SepaxAmethyst C18(4.6mmX 250mm);流速:lmL/min;檢測波長:254nm;流動(dòng)相A:水/乙酸=100/
0.5，流動(dòng)相B:乙腈；洗脫梯度如下:0-10min，流動(dòng)相B 35%-50% ； 10_35min，流動(dòng)相B50%-60% ;35-50min，流動(dòng)相B 60%-80% ;50_60min，流動(dòng)相B 80%-100%。
[0134]分析表明本實(shí)施例得到的每Ig樟芝發(fā)酵谷物粉中含有4.0mg的安卓奎諾爾3.6mg的安卓奎諾爾B。
[0135]實(shí)施例作用與效果
[0136]實(shí)施例1至實(shí)施例3提供的樟芝固態(tài)偶聯(lián)的方法，將樟芝液態(tài)發(fā)酵與固態(tài)發(fā)酵偶聯(lián)起來，與對照例中的不與液態(tài)發(fā)酵偶聯(lián)得方法相比，由于固態(tài)偶聯(lián)的方法利用了采用樟芝液態(tài)發(fā)酵進(jìn)行制備生產(chǎn)產(chǎn)生的發(fā)酵液體代替自來水作為固態(tài)發(fā)酵固態(tài)培養(yǎng)基的浸泡用水，而常規(guī)液態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)生的發(fā)酵液體作為廢棄液體排出，這樣節(jié)省發(fā)酵時(shí)間、節(jié)省了固態(tài)發(fā)酵用水，并不再排出廢棄液體，使得生產(chǎn)效率高且綠色環(huán)保節(jié)約；而且，采用樟芝固態(tài)偶聯(lián)的制備方法制備的產(chǎn)物樟芝發(fā)酵谷物經(jīng)烘干粉碎制備而成的樟芝發(fā)酵谷物粉，經(jīng)檢測，每Ig樟芝發(fā)酵谷物粉中含有的安奎諾爾高達(dá)4.5mg、含有的安卓奎諾爾B高達(dá)3.9mg，而非偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵制備的樟芝發(fā)酵谷物粉中，每Ig樟芝發(fā)酵谷物粉中含有的安卓奎諾爾平均為
2.2mg、含有的安卓奎諾爾B平均1.5mg，可見本發(fā)明提供的固態(tài)偶聯(lián)方法制備的樟芝發(fā)酵谷物粉中的安卓奎諾爾高達(dá)和安卓奎諾爾B的含量均得到了顯著的提高。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一，液態(tài)種子的培養(yǎng):以樟芝菌株(Antrodia camphorata)S_29為生產(chǎn)菌株，接入到液態(tài)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到液態(tài)種子； 步驟二，液態(tài)發(fā)酵:將所述液態(tài)種子按一定接入比例接入到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度28°C的條件下培養(yǎng)8-12天，得到樟芝發(fā)酵液； 步驟三，固液分離:將所述樟芝發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，得到上清液以及樟芝菌絲體；步驟四，谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的浸泡:將所述上清液與自來水按一定加入比例加入到所述谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在15?30°C的條件下對所述谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行浸泡6-20小時(shí)，得到混合谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基； 步驟五，固態(tài)發(fā)酵:按所述步驟一制作新的液態(tài)種子，將所述新的液態(tài)種子按一定新的接入比例接入到所述混合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度28°C的條件下，進(jìn)行15?25天的所述固態(tài)發(fā)酵，得到樟芝發(fā)酵谷物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于: 其中，在所述步驟二中，所述接入比例為每10ml所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入8?20ml的所述液態(tài)種子。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于: 其中，在所述步驟四中，所述加入比例為每10g所述谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入總體積為60-1 OOml的所述發(fā)酵上清夜和所述自來水， 所述總體積中的所述發(fā)酵上清液和所述自來水的體積比為1:4?7:1。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于: 其中，在所述步驟五中，所述谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的主體物質(zhì)為糧食谷物類， 所述新的接入比例按為所述谷物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中每10g所述糧食谷物類中接入10?40m I的所述新的液態(tài)種子。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于: 其中，所述糧食谷物類為玉米、黑米、大米、小米、青稞中的任意一種或至少任意兩種的組合。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于: 其中，所述步驟二中得到的所述樟芝菌絲體，經(jīng)冷凍干燥，得到樟芝菌絲體產(chǎn)物。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于: 其中，所述步驟五中得到的所述樟芝發(fā)酵谷物，經(jīng)烘干粉碎后得到樟芝發(fā)酵谷物粉。8.一種根據(jù)權(quán)利要求7的樟芝偶聯(lián)固態(tài)發(fā)酵方法得到的樟芝發(fā)酵谷物粉，其特征在于， 每Ig所述樟芝發(fā)酵谷物粉中含有2.4?4.5mg的安卓奎諾爾、2.1?3.9mg的安卓奎諾爾B。
【文檔編號】C12P1/02GK105907647SQ201610280794
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】夏永軍, 艾連中, 周璇, 趙慶, 王光強(qiáng), 張匯, 熊志強(qiáng), 劉曉鳳
【申請人】上海理工大學(xué)