一種正常人ncm460細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的建立方法及鑒定方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種正常人NCM460細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的建立方法，包括如下步驟：(1)細(xì)胞培養(yǎng)：將正常人結(jié)直腸上皮細(xì)胞接種于含有10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用；(2)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程：其鑒定方法包括如下步驟：(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察；(2)MTT比色實(shí)驗(yàn)；(3)血清抗性試驗(yàn)；(4)錨著獨(dú)立生長(zhǎng)試驗(yàn)；(5)細(xì)胞劃痕試驗(yàn)；為更好地了解結(jié)腸癌發(fā)生過(guò)程提供了較好的細(xì)胞研究模型，對(duì)于闡明結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制，減緩結(jié)腸癌進(jìn)展，以及結(jié)腸癌的治療具有重要意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種正常人NCM460細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的建立方法及鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及細(xì)胞模型技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種正常人NCM460細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的 建立方法及鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前結(jié)腸癌的研究?jī)H局限用結(jié)腸癌細(xì)胞，并沒(méi)有結(jié)腸癌相關(guān)的正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化 模型；腫瘤細(xì)胞鑒定方法基本都包括細(xì)胞活力測(cè)定(MTT比色試驗(yàn)或XTT比色試驗(yàn)）、細(xì)胞增 殖能力測(cè)定(軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)或錨著獨(dú)立生長(zhǎng)試驗(yàn)）以及細(xì)胞迀移能力測(cè)定(細(xì)胞劃痕 試驗(yàn)或MiLLicell小室測(cè)定法)及裸鼠成瘤試驗(yàn)，結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段 的復(fù)雜過(guò)程，直接運(yùn)用結(jié)腸癌細(xì)胞不能研究人正常結(jié)腸細(xì)胞癌變整個(gè)過(guò)程中各種生物學(xué)特 性的變化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)以上問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種正常人NCM460細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的建立方法及 鑒定方法，為更好地了解結(jié)腸癌發(fā)生過(guò)程提供了較好的細(xì)胞研究模型，對(duì)于闡明結(jié)腸癌發(fā) 病機(jī)制，減緩結(jié)腸癌進(jìn)展，以及結(jié)腸癌的治療具有重要意義，可以有效解決【背景技術(shù)】中的問(wèn) 題。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種正常人NCM460細(xì)胞惡性轉(zhuǎn) 化模型的建立方法，包括如下步驟：
[0005] (1)細(xì)胞培養(yǎng):將正常人結(jié)直腸上皮細(xì)胞接種于含有10 %胎牛血清的DMEM高糖培 養(yǎng)液中，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用；
[0006] (2)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程:在步驟（1)基礎(chǔ)上，待細(xì)胞貼壁融合率達(dá)78 % -82 %時(shí)，棄 培養(yǎng)液，用PBS洗液3次，加入含有50ul/ml MNNG的DMEM培養(yǎng)液，于37°C，5%C02條件下培養(yǎng) 2h，棄培養(yǎng)液，用PBS洗液3次，加入含有100ng/ml PMA的DMEM培養(yǎng)液，于37°C，5 %C02條件下 培養(yǎng)48h，棄培養(yǎng)液，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37°C，5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng) 24h，按上述步驟進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，傳代過(guò)程中觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變；
[0007] 作為本發(fā)明一種優(yōu)選的技術(shù)方案，細(xì)胞傳代培養(yǎng)過(guò)程中，從第17代開(kāi)始細(xì)胞形態(tài) 學(xué)發(fā)生改變，出現(xiàn)形態(tài)多樣，大小不一，此后，每隔3代進(jìn)行細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化鑒定試驗(yàn)。
[0008] 另外本發(fā)明還設(shè)計(jì)了一種正常人NCM460細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的鑒定方法，包括如下 步驟：
[0009] (1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察；
[0010] (2)MTT比色實(shí)驗(yàn)：取胰酶消化NCM460正常細(xì)胞、第17代處理細(xì)胞NCM460-M-P17和 第30代處理細(xì)胞NCM460-M-P30，離心后用DMEM培養(yǎng)液配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1 X 104 個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔200ul，每組32孔，于37°C，5 %C02條件下培養(yǎng)3天后，加入20ul (5mg/ml )MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入150ulDMS0，震蕩lOmin，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 490nm下測(cè)定各孔吸光度值，對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行分析；
[0011] (3)血清抗性試驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30,常規(guī) 消化后用DMEM培養(yǎng)液配制單個(gè)細(xì)胞懸液，按每孔500個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，每組細(xì)胞接種6 孔，其中3孔加入10 %胎牛血清，在37 °C，5 % C02條件下培養(yǎng)6天后終止培養(yǎng)，PBS洗液3次，甲 醇固定20min,吉母薩染液染色15min，沖洗瞭干后顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)，計(jì)算接種效率= (克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）X 100% ;
[0012] (4)錨著獨(dú)立生長(zhǎng)試驗(yàn)：用DMEM培養(yǎng)液配制1.4 %的備用瓊脂糖，高溫滅菌，稍冷卻 后放于39°C水浴中保溫，然后加入預(yù)熱37°C含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液稀釋為0.7%瓊脂 糖，每皿3ml倒入60mm培養(yǎng)皿中，鋪制底層凝膠，待凝固后備用，常規(guī)消化NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30，離心收集細(xì)胞與0.7 %瓊脂糖1:1混勻，稀釋成0.35 %細(xì)胞瓊脂糖混合 液，加到60mm培養(yǎng)皿中0.7 %瓊脂糖凝膠上，每孔1 X 104個(gè)細(xì)胞，每組6皿，待上層瓊脂糖凝 固后，每孔加入2mlDMEM培養(yǎng)液，于37°C，5%C02條件下培養(yǎng)，每3天換液1次，4周后鏡下計(jì)數(shù) 直徑大于75um或細(xì)胞數(shù)多于50個(gè)的克隆數(shù)，克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞）X 100%;
[0013] (5)細(xì)胞劃痕試驗(yàn):將NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30接種于6孔板中，每組 6孔，其中3孔加入DMEM培養(yǎng)液，另外3孔加入10 %胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，作為陽(yáng)性對(duì)照，于37 °C，5%C02條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁融合率達(dá)100%時(shí)，用10ul槍頭垂直劃痕，PBS洗3次，加 入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24h，48h，72h后鏡下觀(guān)察細(xì)胞迀移情況。
[0014] 作為本發(fā)明一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述MTT比色試驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞活力;所述血清 抗性試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力及自主生長(zhǎng)能力;所述錨著獨(dú)立生長(zhǎng)試驗(yàn)測(cè)定單個(gè)細(xì) 胞增殖能力;所述細(xì)胞劃痕試驗(yàn)判斷細(xì)胞是否具有迀移能力。
[0015] 本發(fā)明的有益效果：
[0016] 本發(fā)明為更好地了解結(jié)腸癌發(fā)生過(guò)程提供了較好的細(xì)胞研究模型，對(duì)于闡明結(jié)腸 癌發(fā)病機(jī)制，減緩結(jié)腸癌進(jìn)展，以及結(jié)腸癌的治療具有重要意義;該種建立方法僅涉及到細(xì) 胞培養(yǎng)技術(shù)，操作簡(jiǎn)單;建立人體細(xì)胞體外培養(yǎng)及惡性轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)既能排除免疫系統(tǒng)的干擾， 又能更深入研究人體細(xì)胞在暴露于致癌物質(zhì)情況下，細(xì)胞在惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的各種生物學(xué) 特性的變化;腫瘤細(xì)胞鑒定試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、方便、費(fèi)用低廉。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為本發(fā)明的NC460細(xì)胞形態(tài)圖。
[0018] 圖2為本發(fā)明中NCM460-M-P30細(xì)胞形態(tài)圖。
[0019] 圖3為本發(fā)明錨著獨(dú)立生長(zhǎng)試驗(yàn)中NCM460細(xì)胞克隆數(shù)圖。
[0020] 圖4為本發(fā)明錨著獨(dú)立生長(zhǎng)試驗(yàn)中NCM460-M-P30細(xì)胞克隆數(shù)圖。
[0021]圖5為本發(fā)明細(xì)胞劃痕試驗(yàn)中t = 0h時(shí)NCM460細(xì)胞迀移情況圖。
[0022]圖6為本發(fā)明細(xì)胞劃痕試驗(yàn)中t = 24h時(shí)NCM460細(xì)胞迀移情況圖 [0023] 圖7為本發(fā)明細(xì)胞劃痕試驗(yàn)中t = 0h時(shí)NCM460-M-P30細(xì)胞迀移情況圖。
[0024] 圖8為本發(fā)明細(xì)胞劃痕試驗(yàn)中t = 24h時(shí)NCM460-M-P30細(xì)胞迀移情況圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0026] 實(shí)施例：
[0027] 一種正常人NCM460細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的建立方法，包括如下步驟：
[0028] (1)細(xì)胞培養(yǎng):將正常人結(jié)直腸上皮細(xì)胞接種于含有10 %胎牛血清的DMEM高糖培 養(yǎng)液中，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用；
[0029] (2)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程:在步驟（1)基礎(chǔ)上，待細(xì)胞貼壁融合率達(dá)78%-82%時(shí)，棄 培養(yǎng)液，用PBS洗液3次，加入含有50ul/ml MNNG的DMEM培養(yǎng)液，于37°C，5%C02條件下培養(yǎng) 2h，棄培養(yǎng)液，用PBS洗液3次，加入含有100ng/ml PMA的DMEM培養(yǎng)液，于37°C，5 %C02條件下 培養(yǎng)48h，棄培養(yǎng)液，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37°C，5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng) 24h，按上述步驟進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，傳代過(guò)程中觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變；
[0030] 作為本發(fā)明一種優(yōu)選的技術(shù)方案，細(xì)胞傳代培養(yǎng)過(guò)程中，從第17代開(kāi)始細(xì)胞形態(tài) 學(xué)發(fā)生改變，出現(xiàn)形態(tài)多樣，大小不一，此后，每隔3代進(jìn)行細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化鑒定試驗(yàn)。
[0031] 一種正常人NCM460細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的鑒定方法，包括如下步驟：
[0032] (1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察；
[0033] (2)MTT比色實(shí)驗(yàn)：取胰酶消化NCM460正常細(xì)胞、第17代處理細(xì)胞NCM460-M-P17和 第30代處理細(xì)胞NCM460-M-P30，離心后用DMEM培養(yǎng)液配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1 X 104 個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔200ul，每組32孔，于37°C，5 %C02條件下培養(yǎng)3天后，加入20ul (5mg/ml )MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入150ulDMS0，震蕩lOmin，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 490nm下測(cè)定各孔吸光度值，對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行分析；
[0034] (3)血清抗性試驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30,常規(guī) 消化后用DMEM培養(yǎng)液配制單個(gè)細(xì)胞懸液，按每孔500個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，每組細(xì)胞接種6 孔，其中3孔加入10 %胎牛血清，在37 °C，5 % C02條件下培養(yǎng)6天后終止培養(yǎng)，PBS洗液3次，甲 醇固定20min,吉母薩染液染色15min，沖洗瞭干后顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)，計(jì)算接種效率= (克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）X 100% ;
[0035] (4)錨著獨(dú)立生長(zhǎng)試驗(yàn):用DMEM培養(yǎng)液配制1.4 %的備用瓊脂糖，高溫滅菌，稍冷卻 后放于39°C水浴中保溫，然后加入預(yù)熱37°C含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液稀釋為0.7%瓊脂 糖，每皿3ml倒入60mm培養(yǎng)皿中，鋪制底層凝膠，待凝固后備用，常規(guī)消化NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30，離心收集細(xì)胞與0.7 %瓊脂糖1:1混勻，稀釋成0.35 %細(xì)胞瓊脂糖混合 液，加到60mm培養(yǎng)皿中0.7 %瓊脂糖凝膠上，每孔1 X 104個(gè)細(xì)胞，每組6皿，待上層瓊脂糖凝 固后，每孔加入2mlDMEM培養(yǎng)液，于37°C，5%C02條件下培養(yǎng)，每3天換液1次，4周后鏡下計(jì)數(shù) 直徑大于75um或細(xì)胞數(shù)多于50個(gè)的克隆數(shù)，克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞）X 100%;
[0036] (5)細(xì)胞劃痕試驗(yàn):將NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30接種于6孔板中，每組 6孔，其中3孔加入DMEM培養(yǎng)液，另外3孔加入10 %胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，作為陽(yáng)性對(duì)照，于37 °C，5%C02條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁融合率達(dá)100%時(shí)，用10ul槍頭垂直劃痕，PBS洗3次，加 入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24h，48h，72h后鏡下觀(guān)察細(xì)胞迀移情況。
[0037] 作為本發(fā)明一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述MTT比色試驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞活力;所述血清 抗性試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力及自主生長(zhǎng)能力;所述錨著獨(dú)立生長(zhǎng)試驗(yàn)測(cè)定單個(gè)細(xì) 胞增殖能力;所述細(xì)胞劃痕試驗(yàn)判斷細(xì)胞是否具有迀移能力。
[0038]具體的，鑒定方法的鑒定結(jié)果：
[0039] (1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察:NCM460細(xì)胞經(jīng)過(guò)MNNG和PMA低濃度誘導(dǎo)后，在17代觀(guān)察到有 形態(tài)學(xué)改變，呈現(xiàn)形態(tài)多樣，大小不一，排列緊密，團(tuán)塊狀生長(zhǎng)。此后，每隔3代進(jìn)行一次鑒定 試驗(yàn)(20代、23代、27代和30代）。以下鑒定試驗(yàn)對(duì)象選取最具代表性的細(xì)胞代數(shù)進(jìn)行；
[0040] 在NCM460鏡下呈單層生長(zhǎng)，排列有序，形態(tài)為梭形，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰。NCM460-M-P30 形態(tài)發(fā)生明顯變化，倒置顯微鏡下呈現(xiàn)形態(tài)多樣，大小不一，排列緊密，團(tuán)塊狀生長(zhǎng)，無(wú)細(xì)胞 間接觸抑制或密度抑制，鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底壁后出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象;如圖1和圖2所示。
[0041 ] (2)MTT比色試驗(yàn):胰酶消化NCM460正常細(xì)胞(NCM460)、第17代處理細(xì)胞(NCM460- M-P17)和第30代處理細(xì)胞(NCM460-M-P30)，離心后用DMEM培養(yǎng)液配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，以 每孔1 X 104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔200ul，每組32孔，于37°C，5%C02條件下培養(yǎng)3天 后，加入20ul (5mg/ml )MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入150ulDMS0，震蕩lOmin，酶聯(lián) 免疫檢測(cè)儀490nm下測(cè)定各孔吸光度值，對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行分析，如下表1:
[0042] 表1MTT比色試驗(yàn)
[0043] (11 = 32,? 土g)
[0044]
[0045] **P<〇.〇〇lvs對(duì)照 MpSO.OOlvsNCiMeO-MPn
[0046] 結(jié)論：由表1可知，NCM460-M-P17與NCM460存活率無(wú)明顯差異，NCM460-M-P30與 NCM460相比細(xì)胞存活率有顯著性差異(p<0.001)，與NCM460-M-P17相比細(xì)胞存活率有顯著 性差異(P<〇.001)。由此說(shuō)明，長(zhǎng)期生長(zhǎng)在含有低濃度MNNG和PMA環(huán)境中的細(xì)胞增殖能力增 強(qiáng)，提示有惡性轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。
[0047] (3)血清抗性試驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30,常規(guī) 消化后用DMEM培養(yǎng)液配制單個(gè)細(xì)胞懸液，按每孔500個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，每組細(xì)胞接種6 孔，其中3孔加入10 %胎牛血清，在37 °C，5 % C02條件下培養(yǎng)6天后終止培養(yǎng)，PBS洗液3次，甲 醇固定20min,吉母薩染液染色15min，沖洗瞭干后顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)，計(jì)算接種效率= (克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）X 100%。結(jié)果詳見(jiàn)表2。
[0048] 表2血清抗性試驗(yàn)
[0049] (n = 6，：±:g，％)
[0050]
[0051] **?<0.001￥8對(duì)照組厶厶卩<0.001￥8無(wú)血清
[0052] 結(jié)論:NCM460有血清組與無(wú)血清組相比，細(xì)胞接種效率無(wú)差異，而經(jīng)MNNG和PMA分 階段多次誘導(dǎo)細(xì)胞的接種效率與對(duì)照組相比明顯升高(P<〇. 001)，說(shuō)明MNNG和PMA對(duì)細(xì)胞 有明顯的促增殖作用，并且NCM460-MP30接種效率在有血清的條件下明顯高于無(wú)血清組(p <0.001 )，表明經(jīng)多次誘導(dǎo)處理的細(xì)胞對(duì)環(huán)境依賴(lài)性降低，適應(yīng)能力增強(qiáng)，細(xì)胞的自主生存 能力增強(qiáng)，細(xì)胞有惡性轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。
[0053] (4)錨著獨(dú)立生長(zhǎng)試驗(yàn)：用DMEM培養(yǎng)液配制1.4 %的備用瓊脂糖高溫滅菌，稍冷卻 后放于39°C水浴中保溫，然后加入預(yù)熱37°C含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液稀釋為0.7%瓊脂 糖。每皿3ml倒入60mm培養(yǎng)皿中，鋪制底層凝膠，待凝固后備用。常規(guī)消化NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30，離心收集細(xì)胞與0.7 %瓊脂糖1:1混勻，稀釋成0.35 %細(xì)胞瓊脂糖混合 液，加到60mm培養(yǎng)皿中0.7 %瓊脂糖凝膠上，每孔1 X 104個(gè)細(xì)胞，每組6皿。待上層瓊脂糖凝 固后，每孔加入2mlDMEM培養(yǎng)液，于37°C，5%C02條件下培養(yǎng)。每3天換液1次，4周后鏡下計(jì)數(shù) 直徑大于75um或細(xì)胞數(shù)多于50個(gè)的克隆數(shù)，克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞）X 100%。結(jié) 果詳見(jiàn)表3、圖3和圖4。
[0054] 表3錨著獨(dú)立生長(zhǎng)試驗(yàn)
[0055] (n = 6，$±:s)
[0056]
[0057]
[0058] **P<〇. 001vsNCM460 ^<0.001vsNCM460-M-P17
[0059] 結(jié)論：用來(lái)判斷細(xì)胞在軟瓊脂中克隆生長(zhǎng)的能力，是細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的重要標(biāo) 志。培養(yǎng)1周后，經(jīng)MNNG和PMA多次誘導(dǎo)的細(xì)胞出現(xiàn)較小的團(tuán)塊狀細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)4周后，細(xì)胞集 落大量形成，且多數(shù)集落細(xì)胞數(shù)量大于50個(gè)。正常細(xì)胞形成的克隆細(xì)胞團(tuán)很小，數(shù)量極少， 培養(yǎng)4周后細(xì)胞固縮死亡（圖3)?？寺⌒纬陕蕼y(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表3,經(jīng)MNNG和PMA處理細(xì)胞的克 隆形成率明顯高于對(duì)照組(p<〇. 001)，并且NCM460-M-P30與對(duì)照組相比，克隆形成率明顯 高于對(duì)照組(P <0.001)。
[0060] (5)細(xì)胞劃痕試驗(yàn):將NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30接種于6孔板中，每組 6孔，其中3孔加入DMEM培養(yǎng)液，另外3孔加入10 %胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，作為陽(yáng)性對(duì)照，于37 °C，5%C02條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁融合率達(dá)100%時(shí)，用10ul槍頭垂直劃痕，PBS洗3次，加 入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h，48h，72h后鏡下觀(guān)察細(xì)胞迀移情況。詳見(jiàn)表4、圖5、圖6、圖7、圖 8〇
[0061 ]表4細(xì)胞劃痕試驗(yàn)
[0062] (n = 6，l±s)
[0063]
[0064] **P<〇. 001vsNCM460 ^<0.001vsNCM460-M-P17
[0065] 結(jié)論:細(xì)胞劃痕試驗(yàn)主要用于判斷轉(zhuǎn)化細(xì)胞是否具有迀移能力。
[0066] NCM460細(xì)胞培養(yǎng)24h及48h后的迀移細(xì)胞數(shù)都是0(圖4)，說(shuō)明NCM460細(xì)胞無(wú)迀移能 力；經(jīng)MNNG和PMA分階段誘導(dǎo)處理的細(xì)胞在培養(yǎng)24h后，鏡下可見(jiàn)劃痕處有細(xì)胞生長(zhǎng)（圖5)， 表明經(jīng)MNNG和PMA分階段誘導(dǎo)處理的細(xì)胞具有迀移能力。并且，經(jīng)處理細(xì)胞與NCM460相比迀 移細(xì)胞數(shù)具有顯著性差異(P<〇. 001)，培養(yǎng)48h后，NCM460-M-P30與NCM460-M-P17相比迀移 細(xì)胞數(shù)具有顯著性差異(P<〇.001)，由此說(shuō)明，經(jīng)過(guò)MNNG和PMA分階段長(zhǎng)期誘導(dǎo)處理的細(xì)胞 獲得了迀移能力，可能具有了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移特性。
[0067] 基于上述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明為更好地了解結(jié)腸癌發(fā)生過(guò)程提供了較好 的細(xì)胞研究模型，對(duì)于闡明結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制，減緩結(jié)腸癌進(jìn)展，以及結(jié)腸癌的治療具有重要 意義;該種建立方法僅涉及到細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，操作簡(jiǎn)單;建立人體細(xì)胞體外培養(yǎng)及惡性轉(zhuǎn)化 實(shí)驗(yàn)既能排除免疫系統(tǒng)的干擾，又能更深入研究人體細(xì)胞在暴露于致癌物質(zhì)情況下，細(xì)胞 在惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的各種生物學(xué)特性的變化；腫瘤細(xì)胞鑒定試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、方便、費(fèi)用低 廉。
[0068] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種正常人NCM460細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 細(xì)胞培養(yǎng):將正常人結(jié)直腸上皮細(xì)胞接種于含有10 %胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液 中，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用； (2) 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程:在步驟（1)基礎(chǔ)上，待細(xì)胞貼壁融合率達(dá)78 %-82%時(shí)，棄培養(yǎng) 液，用PBS洗液3次，加入含有50ul/ml MNNG的DMEM培養(yǎng)液，于37°C，5%C02條件下培養(yǎng)2h，棄 培養(yǎng)液，用PBS洗液3次，加入含有100ng/ml PMA的DMEM培養(yǎng)液，于37°C，5 % C02條件下培養(yǎng) 48h，棄培養(yǎng)液，加入含有10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37°C，5 %C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h， 按上述步驟進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，傳代過(guò)程中觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種正常人NCM460細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的建立方法，其特征在 于:細(xì)胞傳代培養(yǎng)過(guò)程中，從第17代開(kāi)始細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，出現(xiàn)形態(tài)多樣，大小不一，此 后，每隔3代進(jìn)行細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化鑒定試驗(yàn)。3. -種正常人NCM460細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的鑒定方法，其特征在于:包括如下步驟： (1) 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察； (2) MTT比色實(shí)驗(yàn)：取胰酶消化NCM460正常細(xì)胞、第17代處理細(xì)胞NCM460-M-P17和第30 代處理細(xì)胞NCM460-M-P30，離心后用DMEM培養(yǎng)液配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔I X 104個(gè)細(xì) 胞接種于96孔板中，每孔200ul，每組32孔，于37 °C，5 %⑶2條件下培養(yǎng)3天后，加入20ul (5mg/ml )MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入150ulDMS0，震蕩IOmin，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 490nm下測(cè)定各孔吸光度值，對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行分析； (3) 血清抗性試驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30，常規(guī)消化 后用DMEM培養(yǎng)液配制單個(gè)細(xì)胞懸液，按每孔500個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，每組細(xì)胞接種6孔， 其中3孔加入10 %胎牛血清，在37 °C，5 % C02條件下培養(yǎng)6天后終止培養(yǎng)，PBS洗液3次，甲醇 固定20min，吉母薩染液染色15min，沖洗瞭干后顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)，計(jì)算接種效率=(克 隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）X 100% ; (4) 錨著獨(dú)立生長(zhǎng)試驗(yàn)：用DMEM培養(yǎng)液配制1.4%的備用瓊脂糖，高溫滅菌，稍冷卻后放 于39 °C水浴中保溫，然后加入預(yù)熱37 °C含10 %胎牛血清DMEM培養(yǎng)液稀釋為0.7 %瓊脂糖，每 皿3ml倒入60mm培養(yǎng)皿中，鋪制底層凝膠，待凝固后備用，常規(guī)消化NCM460、NCM460-M-P17和 NCM460-M-P30，離心收集細(xì)胞與0.7 %瓊脂糖1:1混勻，稀釋成0.35 %細(xì)胞瓊脂糖混合液，加 到60mm培養(yǎng)皿中0.7 %瓊脂糖凝膠上，每孔I X 104個(gè)細(xì)胞，每組6皿，待上層瓊脂糖凝固后， 每孔加入2mlDMEM培養(yǎng)液，于37°C，5%⑶2條件下培養(yǎng)，每3天換液1次，4周后鏡下計(jì)數(shù)直徑 大于75um或細(xì)胞數(shù)多于50個(gè)的克隆數(shù)，克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞）X 100% ; (5) 細(xì)胞劃痕試驗(yàn):將NCM460、NCM460-M-P17和NCM460-M-P30接種于6孔板中，每組6孔， 其中3孔加入DMEM培養(yǎng)液，另外3孔加入10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，作為陽(yáng)性對(duì)照，于37°C， 5 % C02條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁融合率達(dá)100 %時(shí)，用IOul槍頭垂直劃痕，PBS洗3次，加入培 養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24h，48h，72h后鏡下觀(guān)察細(xì)胞迀移情況。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種正常人NCM460細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的鑒定方法，其特征在 于:所述MTT比色試驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞活力;所述血清抗性試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力及 自主生長(zhǎng)能力;所述錨著獨(dú)立生長(zhǎng)試驗(yàn)測(cè)定單個(gè)細(xì)胞增殖能力;所述細(xì)胞劃痕試驗(yàn)判斷細(xì) 胞是否具有迀移能力。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK105907702SQ201610311999
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年5月12日
【發(fā)明人】何顯力, 袁利娟, 包國(guó)強(qiáng), 魏剛, 喬慶, 劉梓渝
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)