一種原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，開創(chuàng)性的采用了活檢針采取處理后的組織，使得采樣直接針對目的細胞，不但直接有效，同時巧妙地避免了表面包膜細胞以及細菌的混入，降低了細胞、細菌污染的同時，大大提高了目的細胞的純度，分離細胞時即可接近100％。同時，本發(fā)明的原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，使用特殊制備的復(fù)合酶消化液，并使用4℃條件過夜消化(4?20h)，相比傳統(tǒng)單一的膠原酶預(yù)熱消化，不但避免了對組織過度消化過度吹打所導(dǎo)致的細胞活性低、得率差的問題，而且消化的更均勻透徹。
【專利說明】
_種原代小鼠或大鼠骨路肌細胞的分禹培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離 培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨骼肌細胞是機體最大的細胞之一，含多個細胞核，由多個成肌細胞融合而成。骨 骼肌細胞的再生是一個非常復(fù)雜的過程。當骨骼肌細胞受損時，肌肉內(nèi)沉默的成肌細胞(又 叫肌衛(wèi)星細胞)被激活，發(fā)生增殖、迀移和分化。研究發(fā)現(xiàn)，在骨骼肌細胞生長發(fā)育過程中， 有多種細胞信號通路發(fā)揮重要作用，如：磷脂酰肌醇激酶3、磷酸酶、JAK2、STAT3、MAPK等。 GLUT4介導(dǎo)了培養(yǎng)的骨骼肌細胞中胰島素激活的葡萄糖轉(zhuǎn)運，骨骼肌細胞的分化則與硫酸 肝素蛋白多糖有關(guān)。多核細胞的融合形成多核的肌小管是骨骼肌細胞發(fā)育過程中的重要過 程?？刂七@一過程的開啟和進展，需要成肌細胞和其所處環(huán)境進行復(fù)雜地相互作用。因此， 骨骼肌細胞的培養(yǎng)是研究細胞分化過程的一種很有用的模型，而這種模型的一般是建立在 小鼠/大鼠的骨骼肌細胞的分離和培養(yǎng)上。
[0003] 但在實際操作中，小鼠/大鼠的骨骼肌細胞的分離和培養(yǎng)存在諸多問題。
[0004] 首先，國內(nèi)外既往的研究多采用I型膠原酶37度消化1個小時，再用0.25%胰酶37 度水浴消化30分鐘。其缺點在于，絕大多數(shù)的酶在37度的條件下都會發(fā)生劇烈的消化作用， 因此，一方面可以加快消化的速度，但是另一方面，又會對細胞造成極大的傷害，尤其是胰 酶更是如此。從而導(dǎo)致的結(jié)果是，消化時間不好掌握，往往消化時間過長，細胞碎片居多，雜 細胞比較多而骨骼肌細胞比較少，并且獲得的細胞活力差，隨著培養(yǎng)時間的延長及傳代，有 活力的骨骼肌細胞越來越少，細胞逐漸死亡。
[0005] 其次，骨骼肌的分離和培養(yǎng)過程中常常有雜細胞和細菌等污染，大大影響原代和 傳代培養(yǎng)效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出的一種高純度、高活率、高活性同時低 污染的原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法。
[0007] 為了實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施為：
[0008] -種原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0009] 步驟1:骨骼肌組織的預(yù)處理
[0010] 清理離體的骨骼肌組織，并利用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗；
[0011]步驟2:取骨骼肌細胞
[0012] 使用活檢針刺入步驟1處理后的骨骼肌組織，切取骨骼肌細胞；
[0013] 步驟3:酶消化
[0014] 將步驟2獲得的骨骼肌細胞置于復(fù)合酶消化液中消化，其中復(fù)合酶消化液中包括 質(zhì)量比為1:1:1:1的I型膠原酶、Π 型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶；
[0015]步驟4:分離培養(yǎng)骨骼肌細胞
[0016]將步驟3消化完畢的骨骼肌細胞過70um篩網(wǎng)，進行離心洗滌，然后進行重懸并再次 離心，最后用無血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到骨骼肌細胞，使用含10%-20%胎牛血清、 2 %雙抗的培養(yǎng)基在37 °C 5 % C02的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
[0017]為了進一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：
[0018] 進一步地，上述步驟1中清理離體的骨骼肌組織的操作為使用眼科剪剝除骨骼肌 組織的皮膚、脂肪、肌腱和肌膜結(jié)締組織。
[0019] 進一步地，上述步驟2中使用的活檢針為半自動或全自動活檢針。
[0020] 進一步地，上述步驟3中復(fù)合酶消化液中各個酶的濃度均為lmg/ml。
[0021] 進一步地，上述步驟3中酶消化過程為使用4°C復(fù)合酶消化液消化4_20h;消化時間 更優(yōu)選為12h。
[0022] 進一步地，上述步驟3中酶消化過程還可以為使用37°C預(yù)熱的復(fù)合酶消化液消化 10min_2h〇
[0023] 進一步地，上述步驟4的培養(yǎng)基選自DMEM培養(yǎng)基、Williams'medium E培養(yǎng)基或 DMEM/F12培養(yǎng)基;優(yōu)選為DMEM培養(yǎng)基。
[0024]進一步地，上述雙抗為1 %青鏈霉素。
[0025] 本發(fā)明另一方面還提供根據(jù)上述的原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法 所培養(yǎng)的小鼠和大鼠骨骼肌細胞。
[0026] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：
[0027] 首先，本發(fā)明開創(chuàng)性的采用了活檢針采取處理后的組織，使得采樣直接針對目的 細胞，不但直接有效，同時巧妙地避免了表面包膜細胞以及細菌的混入，降低了細胞、細菌 污染的同時，大大提高了目的細胞的純度，分離細胞時即可接近1〇〇%。其次，本發(fā)明的原代 小鼠/大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，使用的為
【申請人】特殊制備的復(fù)合酶消化液，復(fù)合酶 消化液由I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶組成，并使用4°C條件過夜消化 (4_20h)，相比傳統(tǒng)單一的膠原酶預(yù)熱消化，不但避免了對組織過度消化過度吹打所導(dǎo)致的 細胞活性低、得率差的問題，而且消化的更均勻透徹。綜上所述，本發(fā)明的的原代小鼠/大鼠 骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，能夠獲得高純度、高活率、高活性同時污染風(fēng)險極低的原代小 鼠/大鼠骨骼肌細胞，培養(yǎng)的細胞分化好、細胞活力高，具有較大的推廣意義。
【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法得到的小鼠骨骼肌細胞使用熒光染色(DAPI)細胞核 拍攝的顯微照片（10X);
[0029] 圖2為本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法得到的小鼠骨骼肌細胞使用熒光染色肌球蛋白拍攝 的顯微照片（10X)。
【具體實施方式】
[0030] 本發(fā)明提供了一種原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0031] 步驟1:骨骼肌組織的預(yù)處理
[0032]清理離體的骨骼肌組織，并利用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗；
[0033]步驟2:取骨骼肌細胞
[0034] 使用活檢針刺入步驟1處理后的骨骼肌組織，切取骨骼肌細胞；
[0035]步驟3:酶消化
[0036]將步驟2獲得的骨骼肌細胞置于復(fù)合酶消化液中消化，其中復(fù)合酶消化液中包括 質(zhì)量比為1:1:1:1的I型膠原酶、Π 型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶；
[0037]步驟4:分離培養(yǎng)骨骼肌細胞
[0038]將步驟3消化完畢的骨骼肌細胞過70um篩網(wǎng)，進行離心洗滌，然后進行重懸并再次 離心，最后用無血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到骨骼肌細胞，使用含10%-20%胎牛血清、 2 %雙抗的培養(yǎng)基在37 °C 5 % C02的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
[0039] 下面通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明， 但是下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0040] 實施例1
[0041] 本實施例采用小鼠，使用本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法分離骨骼肌細胞，具體步驟如下：
[0042] 1.小鼠四肢的提取
[0043] 首先處死新生小鼠（冰凍10分鐘或者頸椎脫臼），酒精浸泡5分鐘。剪取四肢，將取 下的四肢初步清理后放在冰上保存，獲得離體的骨骼肌組織。
[0044] 2.骨骼肌組織的預(yù)處理
[0045]清理離體的骨骼肌組織，在解剖顯微鏡下，用眼科剪仔細剝除四肢的皮膚、脂肪、 肌腱和肌膜等結(jié)締組織，盡量完全去除，以免雜細胞的污染。反復(fù)清洗去除骨髂肌表面的血 液以及可能誤帶的結(jié)締組織，并利用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗。骨髂肌處理 成功的標志為，肌組織呈白色，沒有紅色的血凝塊、黃色的脂肪及白色的筋膜組織殘留。 [0046] 3.骨髂肌細胞的提取和復(fù)合酶消化
[0047]使用半自動活檢針刺入處理后的骨骼肌，切取內(nèi)部骨骼肌細胞（可取多次），轉(zhuǎn)入 復(fù)合酶消化液4 °C消化過夜。
[0048] 4.離心純化
[0049]消化完畢的骨骼肌細胞過70um篩網(wǎng)，取過篩后的細胞濾液，根據(jù)體積加入對等的 PBS，400g離心5分鐘，即可獲得進一步純化的小鼠骨髂肌細胞，然后用0.2%臺盼蘭計數(shù)活 細胞數(shù)，接種培養(yǎng)。
[0050] 5.培養(yǎng)基配制
[0051]由于骨髂肌細胞的特殊性，在原代培養(yǎng)、傳代和復(fù)蘇的第一天，用含20 %胎牛血 清、1 %青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。其它時間，用含10%胎牛血清、1 %青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。
[0052] 6.二維培養(yǎng)
[0053] 將純化的小鼠或大鼠骨髂肌細胞用上述培養(yǎng)基重懸，制得骨髂肌細胞重懸液，加 入到T25培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，接種密度為0.5*10 6/瓶。置于37度，5 % C02的培養(yǎng)箱中進行培 養(yǎng)。為了充分去除骨髂肌成纖維細胞，根據(jù)差速貼壁的原理，分別在細胞接種后的1小時和2 小時，將細胞懸液更換至新的培養(yǎng)瓶，這樣便可在第3個培養(yǎng)瓶中獲得純化的骨髂肌細胞。 第2天更換培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、1 %青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。每3天更換新的培養(yǎng)基， 每天于顯微鏡下觀察細胞生長情況，至細胞融合度達70 %~80 %，進行傳代培養(yǎng)。
[0054] 7.傳代培養(yǎng)
[0055] 當細胞融合度達70 %~80 %時，每瓶細胞加0.25 %胰酶-EDTA 1ml，在37度培養(yǎng)箱 中孵育消化2分鐘。顯微鏡下觀察，當細胞變圓、間隙增大時，用含血清的培養(yǎng)基終止消化， 并將細胞吹打下來。400g離心5分鐘，獲得的細胞再加入含20%胎牛血清、1 %青鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基，接種于T25培養(yǎng)瓶中，接種密度為0.5*106/瓶。置于37度，5%C02的培養(yǎng)箱中繼 續(xù)擴增培養(yǎng)。第2天更換培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、1 %青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，以后每3天 更換新的培養(yǎng)基。
[0056] 8.細胞形態(tài)觀察
[0057]使用熒光染色分別對原代分離培養(yǎng)的肌細胞進行細胞核和肌球蛋白染色，觀察細 胞形態(tài)，如圖1-2所示。
[0058] 9.其他相關(guān)指標測定
[0059 ]培養(yǎng)期間測定細菌及真菌污染情況、細胞污染情況、統(tǒng)計細胞活率等。
[0060] 對比實施例
[0061] 對比實施例采用傳統(tǒng)的組織塊消化法，分離獲得骨骼肌組織后，剝離去除其他連 帶組織，使用含有雙抗的PBS沖洗，在無菌操作下剪碎，并使用II膠原酶37°C消化2h，使用緩 沖液吹打組織，分散細胞，過篩網(wǎng)，進行離心洗滌，然后進行重懸并再次離心，最后用無血 清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到小鼠骨骼肌細胞，細胞計數(shù)后，加入到T25培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)， 接種密度為0.5*10 6/瓶，置于37度，5 % C02的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)并觀察和測定相關(guān)指標。
[0062] 上述的實施例和對比例實驗，
【申請人】進行了多次實驗，并進行了相關(guān)指標的比較 和數(shù)據(jù)統(tǒng)計。如表1所示：
[0063] 表 1
[0064]
[0065] 同時
【申請人】使用大鼠進行了若干次實驗，實驗結(jié)果同小鼠相同，證明本發(fā)明的方 法對大鼠和小鼠的骨骼肌分離培養(yǎng)的良好效果真實有效。
[0066] 綜上所述，本發(fā)明的原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，采用特制的復(fù) 合酶進行長期消化，使得獲得細胞總量大，分離度高，活率高；由于采集方式的不同，本發(fā)明 的方法獲得的骨骼肌細胞細菌、真菌和其他細胞的污染概率極低，同時還能夠進行傳代培 養(yǎng)，為以骨骼肌培養(yǎng)為基礎(chǔ)的相關(guān)研究提供了良好的細胞培養(yǎng)解決方案。
[0067]以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1:骨骼肌組織的預(yù)處理 清理離體的骨骼肌組織，并利用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗； 步驟2:取骨骼肌細胞 使用活檢針刺入步驟1處理后的骨骼肌組織，切取骨骼肌細胞； 步驟3:酶消化 將步驟2獲得的骨骼肌細胞置于復(fù)合酶消化液中消化，其中復(fù)合酶消化液中包括質(zhì)量 比為1: 1: 1:1的I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶； 步驟4:分離培養(yǎng)骨骼肌細胞 將步驟3消化完畢的骨骼肌細胞過70um篩網(wǎng)，進行離心洗滌，然后進行重懸并再次離 心，最后用無血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到骨骼肌細胞，使用含10%_20%胎牛血清、2% 雙抗的培養(yǎng)基在37 °C 5 % CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟1中清理離體的骨骼肌組織的操作為使用眼科剪剝除骨骼肌組織的皮膚、月旨 肪、肌腱和肌膜結(jié)締組織。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟2中使用的活檢針為半自動或全自動活檢針。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟3中復(fù)合酶消化液中各個酶的濃度均為lmg/ml。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟3中酶消化過程為使用4 °C復(fù)合酶消化液消化4-20h。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟3中酶消化過程為使用37°C預(yù)熱的復(fù)合酶消化液消化10min-2h。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟4的培養(yǎng)基選自DMEM培養(yǎng)基、Wi 11 iams 'medium E培養(yǎng)基或DMEM/F12培養(yǎng)基。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟4的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述雙抗為1 %青鏈霉素。10. -種根據(jù)權(quán)利要求1-8任意一項所述的原代小鼠或大鼠骨骼肌細胞的分離培養(yǎng)方 法所培養(yǎng)的小鼠或大鼠骨骼肌細胞。
【文檔編號】C12N5/077GK105907709SQ201610218242
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月8日
【發(fā)明人】王曉冰, 楊國峰
【申請人】王曉冰, 楊國峰