一種右旋糖酐的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種右旋糖酐的制備方法，屬于右旋糖酐制備技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將培養(yǎng)得到的腸膜狀明串珠菌菌體和產(chǎn)黃青霉菌菌體與海藻酸鈉混合，滴入氯化鈣中造粒，之后過濾，干燥，得固定化顆粒，置于裝有甘蔗溶液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵后提升溫度攪拌滅活，從而得到右旋糖酐的制備方法。實(shí)例證明，本發(fā)明方法獨(dú)特新穎，發(fā)酵過程簡(jiǎn)單易行，無需后續(xù)加工，且在制備的過程中無任何大量氯化物，簡(jiǎn)化工藝的同時(shí)保證了右旋糖酐的質(zhì)量和品質(zhì)，使得最終制得的右旋糖酐重均分子量為5000～7000D，分子量分布小于2.0，完全符藥用標(biāo)準(zhǔn)。
【專利說明】
一種右旋糖酐的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明公開了一種右旋糖酐的制備方法，屬于右旋糖酐制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]右旋糖酐又名葡聚糖，是若干葡萄糖脫水形成的聚合物。它是世界上最早發(fā)現(xiàn)的并較早作為主要血漿代用品的微生物多糖。右旋糖酐是若干葡聚糖脫水形成的聚合物，主要由葡萄糖α-1，6糖苷鍵連接而成，由腸膜狀明串菌株產(chǎn)生的右旋糖酐蔗糖酶。
[0003]目前已經(jīng)應(yīng)用于許多藥物中作為載體，包括有降血糖藥、抗腫瘤藥、免疫蛋白和DNA等。在食品工業(yè)上的應(yīng)用，右旋糖酐作為一種天然的來源豐富的微生物多糖是食品的一種優(yōu)良的配料。主要是作為在食品中的保濕劑、穩(wěn)定劑、增量劑和增稠劑。在石油工業(yè)上，右旋糖酐被作為油井鉆泥的添加劑。
[0004]目前，微生物發(fā)酵合成右旋糖酐是目前工業(yè)上主要采用的一種方法。
[0005]微生物發(fā)酵法是將右旋糖酐蔗糖酶的生成和合成右旋糖酐兩大步合到同一個(gè)反應(yīng)器中同時(shí)進(jìn)行。傳統(tǒng)的右旋糖酐生產(chǎn)工藝是以蔗糖作為底物，以游離的微生物為轉(zhuǎn)化菌，控制一定的發(fā)酵條件，經(jīng)微生物發(fā)酵利用蔗糖分子中的葡萄糖單元，因發(fā)酵過程對(duì)形成的分子量不能調(diào)控，最終發(fā)酵合成分子量巨大的右旋糖酐產(chǎn)物;而分子量巨大的右旋糖酐產(chǎn)物一般很少能直接使用。因此，發(fā)酵合成的分子量巨大的右旋糖酐須再經(jīng)過一系列的后續(xù)加工(一般包括乙醇沉淀、捏洗、酸水解、劃分、純化、干燥等工序)，最終才得到不同分子量級(jí)別的右旋糖酐成品。
[0006]除此以外，發(fā)酵方法制備高分子右旋糖酐，再利用鹽酸水解得到不同分子量的藥用右旋糖酐，由于生產(chǎn)的右旋糖酐含有大量的氯化物嚴(yán)重影響了右旋糖酐的質(zhì)量和品質(zhì)，在臨床使用過程中常出現(xiàn)過敏反應(yīng)，可引起皮膚反應(yīng)、嚴(yán)重的呼吸和循環(huán)衰竭，甚至導(dǎo)致死亡。同時(shí)由于是酸催化水解，水解過程無序，得到的產(chǎn)品分子量分布不集中，影響產(chǎn)品的質(zhì)量。另外，由于利用鹽酸水解需要高溫高酸等惡劣條件，不利于環(huán)保、低碳。
[0007]因而，通過適當(dāng)?shù)姆椒▉矶ㄏ蛑频糜倚囚?，以到達(dá)臨床醫(yī)學(xué)所需的右旋糖酐，是非常有必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題:針對(duì)目前傳統(tǒng)微生物發(fā)酵法在制備右旋糖酐的過程中，發(fā)酵過程對(duì)形成的分子量不能調(diào)控，最終形成分子量巨大的右旋糖酐產(chǎn)物，導(dǎo)致不能夠直接使用，需后續(xù)加工，使得操作復(fù)雜，且生產(chǎn)出來的右旋糖酐含有大量的氯化物，嚴(yán)重影響了右旋糖酐的質(zhì)量和品質(zhì)的現(xiàn)狀，提供了一種將培養(yǎng)得到的腸膜狀明串珠菌菌體和產(chǎn)黃青霉菌菌體與海藻酸鈉混合，滴入氯化鈣中造粒，之后過濾，干燥，得固定化顆粒，置于裝有甘蔗溶液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵后提升溫度攪拌滅活，從而得到右旋糖酐的制備方法。該方法獨(dú)特新穎，發(fā)酵過程簡(jiǎn)單易行，無需后續(xù)加工，且在制備的過程中無任何大量氯化物，簡(jiǎn)化工藝的同時(shí)保證了右旋糖酐的質(zhì)量和品質(zhì)，使得最終制得的右旋糖酐重均分子量為5000?7000D，分子量分布小于2.0，完全符藥用標(biāo)準(zhǔn)。
[0009]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
(1)向500mL培養(yǎng)皿中依次加入10?20g蔗糖、0.2?0.4g蛋白胨、0.2?0.4g磷酸氫二鈉、0.03?0.05g磷酸二氫鉀、0.5?0.7g酵母浸膏、200?300mL去離子水，混合制成I號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)腸膜狀明串珠菌；
(2)稱取0.1?0.3g腸膜狀明串珠菌接種到上述I號(hào)培養(yǎng)基中，在20?25°C下，用搖床振蕩培養(yǎng)96?120h后，將培養(yǎng)液在5000?7000r/min下離心30?40min，棄去上清液，得到腸膜狀明串珠菌菌體，備用；
(3)稱取20?30g去皮土豆，切成塊后放入燒杯中，向燒杯中加入400?500mL去離子水，加熱至沸騰，保溫20?30min，再過濾，得濾液，向?yàn)V液中依次加入2?3g鹿糖、3?5g瓊脂，混合制成2號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)產(chǎn)黃青霉菌；
(4)稱取0.1?0.3g產(chǎn)黃青霉菌接種到上述2號(hào)培養(yǎng)基中，在25?30°C下，用搖床振蕩96?120h后，將培養(yǎng)液在6000?8000r/min下離心40?50min，棄去上清液，得到產(chǎn)黃青霉菌菌體；
(5)向燒杯中加入50?60mL質(zhì)量濃度為6?8%海藻酸鈉溶液，再稱取5?7g上述產(chǎn)黃青霉菌菌體和5?7g上述步驟(2)中備用的腸膜狀明串珠菌菌體依次加入到海藻酸鈉溶液中，攪拌20?30min，得到混合液，用5mL—次性注射器將混合液滴入盛有300?400mL0.05mol/L氯化鈣溶液中造粒，在25?27 °C下靜置固定化24h，過濾，將濾渣用去離子水洗滌3?5次，在45?55 °C烘箱中干燥5?6h，得到固定化顆粒；
(6)將上述固定化顆粒加入到盛有200?300mL質(zhì)量濃度為12?14%蔗糖溶液的發(fā)酵罐中，在30?50°C下，發(fā)酵24?26h，待發(fā)酵結(jié)束，將溫度升至70?100 V，持續(xù)攪拌直至腸膜狀明串珠菌、產(chǎn)黃青霉菌以及產(chǎn)生的內(nèi)切右旋糖酐酶滅活，過濾，將濾液進(jìn)行減壓蒸餾，從而得到一種右旋糖酐。
[0010]本發(fā)明的原理是:本發(fā)明用海藻酸鈉將腸膜狀明串珠菌與產(chǎn)黃青霉菌固定，共同發(fā)酵，腸膜狀明串珠菌產(chǎn)生右旋糖酐的同時(shí)，產(chǎn)黃青霉菌產(chǎn)生內(nèi)切右旋糖酐酶，水解右旋糖酐的α(1—6)鍵，使其分子量減小，避免了大分子右旋糖酐的產(chǎn)生。
[0011]本發(fā)明的應(yīng)用方法是:將本發(fā)明制得的右旋糖酐放入消毒后的醫(yī)用吊瓶中，其中每瓶醫(yī)用吊瓶規(guī)格含量為250mL，密封醫(yī)用吊瓶口，于干燥處保存即可，使用時(shí)，對(duì)患者采用靜滴形式注射，根據(jù)病情，每次靜滴250?500mL，連續(xù)靜滴2?4天，可以增加患者血漿容量和維持血壓，而且能夠阻止紅細(xì)胞及血小板聚集，降低血液粘滯行，效果顯著，可安全使用。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明操作簡(jiǎn)便易行，在發(fā)酵過程中無任何大量氯化物產(chǎn)生，保證了右旋糖酐的質(zhì)量和品質(zhì)，且后續(xù)無需再次加工，簡(jiǎn)化了制備工藝；
(2)本發(fā)明最終制得的右旋糖酐重均分子量為5000?7000D，分子量分布小于2.0，完全符合藥用標(biāo)準(zhǔn)，可大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0013]首先向500mL培養(yǎng)皿中依次加入10?20g蔗糖、0.2?0.4g蛋白胨、0.2?0.4g磷酸氫二鈉、0.03?0.05g磷酸二氫鉀、0.5?0.7g酵母浸膏、200?300mL去離子水，混合制成I號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)腸膜狀明串珠菌;然后稱取0.1?0.3g腸膜狀明串珠菌接種到上述I號(hào)培養(yǎng)基中，在20?25°C下，用搖床振蕩培養(yǎng)96?120h后，將培養(yǎng)液在5000?7000r/min下離心30?40min，棄去上清液，得到腸膜狀明串珠菌菌體，備用；隨后稱取20?30g去皮土豆，切成塊后放入燒杯中，向燒杯中加入400?500mL去離子水，加熱至沸騰，保溫20?30min，再過濾，得濾液，向?yàn)V液中依次加入2?3g蔗糖、3?5g瓊脂，混合制成2號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)產(chǎn)黃青霉菌;再稱取0.1?0.3g產(chǎn)黃青霉菌接種到上述2號(hào)培養(yǎng)基中，在25?30°C下，用搖床振蕩96?120h后，將培養(yǎng)液在6000?8000r/min下離心40?50min，棄去上清液，得到產(chǎn)黃青霉菌菌體;接下來向燒杯中加入50?60mL質(zhì)量濃度為6?8%海藻酸鈉溶液，再稱取5?7g上述產(chǎn)黃青霉菌菌體和5?7g上述中備用的腸膜狀明串珠菌菌體依次加入到海藻酸鈉溶液中，攪拌20?30min，得到混合液，用5mL—次性注射器將混合液滴入盛有300?400mL0.05mol/L氯化鈣溶液中造粒，在25?27°C下靜置固定化24h，過濾，將濾渣用去離子水洗滌3?5次，在45?55°C烘箱中干燥5?6h，得到固定化顆粒;最后將上述固定化顆粒加入到盛有200?300mL質(zhì)量濃度為12?14%蔗糖溶液的發(fā)酵罐中，在30?50°C下，發(fā)酵24?26h，待發(fā)酵結(jié)束，將溫度升至70?100 °C，持續(xù)攪拌直至腸膜狀明串珠菌、產(chǎn)黃青霉菌以及產(chǎn)生的內(nèi)切右旋糖酐酶滅活，過濾，將濾液進(jìn)行減壓蒸餾，從而得到一種右旋糖酐。
[0014]實(shí)例I
首先向500mL培養(yǎng)皿中依次加入1g蔗糖、0.2g蛋白胨、0.2g磷酸氫二鈉、0.03g磷酸二氫鉀、0.5g酵母浸膏、200mL去離子水，混合制成I號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)腸膜狀明串珠菌;然后稱取
0.1g腸膜狀明串珠菌接種到上述I號(hào)培養(yǎng)基中，在20°C下，用搖床振蕩培養(yǎng)96h后，將培養(yǎng)液在5000r/min下離心30min，棄去上清液，得到腸膜狀明串珠菌菌體，備用；隨后稱取20g去皮土豆，切成塊后放入燒杯中，向燒杯中加入400mL去離子水，加熱至沸騰，保溫20min，再過濾，得濾液，向?yàn)V液中依次加入2g蔗糖、3g瓊脂，混合制成2號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)產(chǎn)黃青霉菌;再稱取0.1g產(chǎn)黃青霉菌接種到上述2號(hào)培養(yǎng)基中，在25°C下，用搖床振蕩96h后，將培養(yǎng)液在6000r/min下離心40min，棄去上清液，得到產(chǎn)黃青霉菌菌體;接下來向燒杯中加入50mL質(zhì)量濃度為6%海藻酸鈉溶液，再稱取5g上述產(chǎn)黃青霉菌菌體和5g上述中備用的腸膜狀明串珠菌菌體依次加入到海藻酸鈉溶液中，攪拌20min，得到混合液，用5mL—次性注射器將混合液滴入盛有300mL0.05mol/L氯化鈣溶液中造粒，在25°C下靜置固定化24h，過濾，將濾渣用去離子水洗滌3次，在45°C烘箱中干燥5h，得到固定化顆粒;最后將上述固定化顆粒加入到盛有200mL質(zhì)量濃度為12%蔗糖溶液的發(fā)酵罐中，在30°C下，發(fā)酵24h，待發(fā)酵結(jié)束，將溫度升至700C，持續(xù)攪拌直至腸膜狀明串珠菌、產(chǎn)黃青霉菌以及產(chǎn)生的內(nèi)切右旋糖酐酶滅活，過濾，將濾液進(jìn)行減壓蒸餾，從而得到一種右旋糖酐。
[0015]本實(shí)例操作簡(jiǎn)單易行，將本發(fā)明制得的右旋糖酐放入消毒后的醫(yī)用吊瓶中，其中每瓶醫(yī)用吊瓶規(guī)格含量為250mL，密封醫(yī)用吊瓶口，于干燥處保存即可，使用時(shí)，對(duì)患者采用靜滴形式注射，根據(jù)病情，每次靜滴250mL，連續(xù)靜滴2天，可以增加患者血漿容量和維持血壓，而且能夠阻止紅細(xì)胞及血小板聚集，降低血液粘滯行，效果顯著，可安全使用。
[0016]實(shí)例2
首先向500mL培養(yǎng)皿中依次加入15g蔗糖、0.3g蛋白胨、0.3g磷酸氫二鈉、0.04g磷酸二氫鉀、0.6g酵母浸膏、250mL去離子水，混合制成I號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)腸膜狀明串珠菌;然后稱取
0.2g腸膜狀明串珠菌接種到上述I號(hào)培養(yǎng)基中，在23°C下，用搖床振蕩培養(yǎng)IlOh后，將培養(yǎng)液在6000r/min下離心35min，棄去上清液，得到腸膜狀明串珠菌菌體，備用；隨后稱取25g去皮土豆，切成塊后放入燒杯中，向燒杯中加入450mL去離子水，加熱至沸騰，保溫25min，再過濾，得濾液，向?yàn)V液中依次加入2.5g蔗糖、4g瓊脂，混合制成2號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)產(chǎn)黃青霉菌;再稱取0.2g產(chǎn)黃青霉菌接種到上述2號(hào)培養(yǎng)基中，在28 °C下，用搖床振蕩10h后，將培養(yǎng)液在7000r/min下離心45min，棄去上清液，得到產(chǎn)黃青霉菌菌體;接下來向燒杯中加入55mL質(zhì)量濃度為7%海藻酸鈉溶液，再稱取6g上述產(chǎn)黃青霉菌菌體和6g上述中備用的腸膜狀明串珠菌菌體依次加入到海藻酸鈉溶液中，攪拌25min，得到混合液，用5mL—次性注射器將混合液滴入盛有350mL0.05mol/L氯化鈣溶液中造粒，在26°C下靜置固定化24h，過濾，將濾渣用去離子水洗滌4次，在50°C烘箱中干燥5.5h，得到固定化顆粒;最后將上述固定化顆粒加入到盛有250mL質(zhì)量濃度為13%蔗糖溶液的發(fā)酵罐中，在40°C下，發(fā)酵25h，待發(fā)酵結(jié)束，將溫度升至85°C，持續(xù)攪拌直至腸膜狀明串珠菌、產(chǎn)黃青霉菌以及產(chǎn)生的內(nèi)切右旋糖酐酶滅活，過濾，將濾液進(jìn)行減壓蒸餾，從而得到一種右旋糖酐。
[0017]本實(shí)例操作簡(jiǎn)單易行，將本發(fā)明制得的右旋糖酐放入消毒后的醫(yī)用吊瓶中，其中每瓶醫(yī)用吊瓶規(guī)格含量為250mL，密封醫(yī)用吊瓶口，于干燥處保存即可，使用時(shí)，對(duì)患者采用靜滴形式注射，根據(jù)病情，每次靜滴380mL，連續(xù)靜滴3天，可以增加患者血漿容量和維持血壓，而且能夠阻止紅細(xì)胞及血小板聚集，降低血液粘滯行，效果顯著，可安全使用。
[0018]實(shí)例3
首先向500mL培養(yǎng)皿中依次加入20g蔗糖、0.4g蛋白胨、0.4g磷酸氫二鈉、0.05g磷酸二氫鉀、0.7g酵母浸膏、300mL去離子水，混合制成I號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)腸膜狀明串珠菌;然后稱取
0.3g腸膜狀明串珠菌接種到上述I號(hào)培養(yǎng)基中，在25°C下，用搖床振蕩培養(yǎng)120h后，將培養(yǎng)液在7000r/min下離心40min，棄去上清液，得到腸膜狀明串珠菌菌體，備用；隨后稱取30g去皮土豆，切成塊后放入燒杯中，向燒杯中加入500mL去離子水，加熱至沸騰，保溫30min，再過濾，得濾液，向?yàn)V液中依次加入3g蔗糖、5g瓊脂，混合制成2號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)產(chǎn)黃青霉菌;再稱取0.3g產(chǎn)黃青霉菌接種到上述2號(hào)培養(yǎng)基中，在30 0C下，用搖床振蕩120h后，將培養(yǎng)液在8000r/min下離心50min，棄去上清液，得到產(chǎn)黃青霉菌菌體;接下來向燒杯中加入60mL質(zhì)量濃度為8%海藻酸鈉溶液，再稱取7g上述產(chǎn)黃青霉菌菌體和7g上述中備用的腸膜狀明串珠菌菌體依次加入到海藻酸鈉溶液中，攪拌30min，得到混合液，用5mL—次性注射器將混合液滴入盛有400mL0.05mol/L氯化鈣溶液中造粒，在27°C下靜置固定化24h，過濾，將濾渣用去離子水洗滌5次，在55°C烘箱中干燥6h，得到固定化顆粒;最后將上述固定化顆粒加入到盛有300mL質(zhì)量濃度為14%蔗糖溶液的發(fā)酵罐中，在50°C下，發(fā)酵26h，待發(fā)酵結(jié)束，將溫度升至100C,持續(xù)攪拌直至腸膜狀明串珠菌、產(chǎn)黃青霉菌以及產(chǎn)生的內(nèi)切右旋糖酐酶滅活，過濾，將濾液進(jìn)行減壓蒸餾，從而得到一種右旋糖酐。
[0019]本實(shí)例操作簡(jiǎn)單易行，將本發(fā)明制得的右旋糖酐放入消毒后的醫(yī)用吊瓶中，其中每瓶醫(yī)用吊瓶規(guī)格含量為250mL，密封醫(yī)用吊瓶口，于干燥處保存即可，使用時(shí)，對(duì)患者采用靜滴形式注射，根據(jù)病情，每次靜滴500mL，連續(xù)靜滴4天，可以增加患者血漿容量和維持血壓，而且能夠阻止紅細(xì)胞及血小板聚集，降低血液粘滯行，效果顯著，可安全使用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種右旋糖酐的制備方法，其特征在于具體制備步驟為: (1)向500mL培養(yǎng)皿中依次加入10?20g蔗糖、0.2?0.4g蛋白胨、0.2?0.4g磷酸氫二鈉、0.03?0.05g磷酸二氫鉀、0.5?0.7g酵母浸膏、200?300mL去離子水，混合制成I號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)腸膜狀明串珠菌； (2)稱取0.1?0.3g腸膜狀明串珠菌接種到上述I號(hào)培養(yǎng)基中，在20?25°C下，用搖床振蕩培養(yǎng)96?120h后，將培養(yǎng)液在5000?7000r/min下離心30?40min，棄去上清液，得到腸膜狀明串珠菌菌體，備用； (3)稱取20?30g去皮土豆，切成塊后放入燒杯中，向燒杯中加入400?500mL去離子水，加熱至沸騰，保溫20?30min，再過濾，得濾液，向?yàn)V液中依次加入2?3g鹿糖、3?5g瓊脂，混合制成2號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)產(chǎn)黃青霉菌； (4)稱取0.1?0.3g產(chǎn)黃青霉菌接種到上述2號(hào)培養(yǎng)基中，在25?30°C下，用搖床振蕩96?120h后，將培養(yǎng)液在6000?8000r/min下離心40?50min，棄去上清液，得到產(chǎn)黃青霉菌菌體； (5)向燒杯中加入50?60mL質(zhì)量濃度為6?8%海藻酸鈉溶液，再稱取5?7g上述產(chǎn)黃青霉菌菌體和5?7g上述步驟(2)中備用的腸膜狀明串珠菌菌體依次加入到海藻酸鈉溶液中，攪拌20?30min，得到混合液，用5mL—次性注射器將混合液滴入盛有300?400mL0.05mol/L氯化鈣溶液中造粒，在25?27 °C下靜置固定化24h，過濾，將濾渣用去離子水洗滌3?5次，在45?55 °C烘箱中干燥5?6h，得到固定化顆粒； (6)將上述固定化顆粒加入到盛有200?300mL質(zhì)量濃度為12?14%蔗糖溶液的發(fā)酵罐中，在30?50°C下，發(fā)酵24?26h，待發(fā)酵結(jié)束，將溫度升至70?100 V，持續(xù)攪拌直至腸膜狀明串珠菌、產(chǎn)黃青霉菌以及產(chǎn)生的內(nèi)切右旋糖酐酶滅活，過濾，將濾液進(jìn)行減壓蒸餾，從而得到一種右旋糖酐。
【文檔編號(hào)】C12N11/10GK105907830SQ201610477136
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月27日
【發(fā)明人】高大元, 張明, 孟浩影
【申請(qǐng)人】高大元