一種毛竹木聚糖合成關(guān)鍵基因PeIRX10的克隆及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)參與木聚糖合成的毛竹糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferases，GTs)關(guān)鍵基因PeIRX10，該基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。本發(fā)明為了解次生細(xì)胞壁的形成，闡明毛竹組織快速生長(zhǎng)的分子基礎(chǔ)提供了一個(gè)有力工具；實(shí)現(xiàn)了利用PeIRX10能夠修復(fù)擬南芥突變體中木聚糖合成缺陷和互補(bǔ)擬南芥突變體中次生細(xì)胞壁缺陷。
【專利說明】
-種毛竹木聚糖合成關(guān)鍵基因 Pe IRX10的克隆及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一個(gè)參與木聚糖合成的毛竹糖 基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferases，GTs)關(guān)鍵基因化IRXlO的克隆和功能初探。
【背景技術(shù)】
[0002] 半纖維素木聚糖(Xylan)是植物中含量?jī)H次于纖維素的多糖成分，在維持細(xì)胞壁 的穩(wěn)定性與完整性中發(fā)揮重要作用，是重要的可再生生物質(zhì)資源。木聚糖由位于高爾基體 內(nèi)的GTs合成。GTs是一系列參與催化雙糖、聚糖和糖復(fù)合物中糖鏈合成的一類酶，存在于所 有生物中，不僅參與了細(xì)胞壁主要成分的合成，還催化各種分子的糖基并參與發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)、防御等生物學(xué)過程。
[0003] IRXlO基因是參與半纖維素木聚糖主鏈延伸的關(guān)鍵基因，對(duì)植物次生壁正常的加 厚有重要作用。如果IRXlO基因缺失，則花序和莖中木糖含量下降，細(xì)胞壁表現(xiàn)為不規(guī)則的 木質(zhì)部而導(dǎo)致次生細(xì)胞壁缺陷。目前，已有植物的IRXlO基因功能研究主要集中在擬南芥、 水稻等模式植物上，然而毛竹中參與木聚糖合成的關(guān)鍵基因化IRXlO至今仍未見報(bào)道。 [0004]毛竹(Phyllostachys edulis)是我國(guó)種植面積最大的經(jīng)濟(jì)竹種，被廣泛應(yīng)用于食 品、建材、紡織、生物質(zhì)能源等領(lǐng)域。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)毛竹的快速生長(zhǎng)過程中伴隨著次生細(xì)胞壁生 長(zhǎng)。因此，鑒別出毛竹中合成半纖維素木聚糖的相關(guān)基因化IRX10,對(duì)于了解次生細(xì)胞壁的 形成，闡明毛竹組織快速生長(zhǎng)的分子基礎(chǔ)具有重要的科學(xué)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)目前尚沒有找到引起毛竹次生細(xì)胞生長(zhǎng)的原因，本發(fā)明旨在提供一個(gè)新的來 源于毛竹的參與木聚糖合成的關(guān)鍵基因化IRX10,從而為了解次生細(xì)胞壁的形成，闡明毛竹 組織快速生長(zhǎng)的分子基礎(chǔ)提供了一個(gè)有力工具。本發(fā)明的目的還在于提供基因化IRXlO在 植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，W實(shí)現(xiàn)利用基因PeIRXlO能夠修復(fù)擬南芥突變體中木聚糖合成缺 陷和互補(bǔ)擬南芥突變體中次生細(xì)胞壁缺陷。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，發(fā)明人提供如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明的目的首先是提供一個(gè)新的來源于毛竹的參與木聚糖合成的關(guān)鍵基因 PeIRXlO，該基因具有SEQ ID No: 1所示的核巧酸序列。
[000引如附圖1所示:本發(fā)明提供的毛竹木聚糖合成關(guān)鍵基因化IRXlO在竹算中的表達(dá)水 平最高，莖、根和花序中表達(dá)量的表達(dá)量相對(duì)較低，在葉片中的表達(dá)水平最低。PeIRXlO的運(yùn) 一表達(dá)模式與竹算具有快速生長(zhǎng)的特性有關(guān)。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供PeIRXlO在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，一方面包括毛竹 木聚糖合成關(guān)鍵基因化IRXlO在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，所述的植物為擬南芥;另一方面 包括毛竹木聚糖合成關(guān)鍵基因化IRXlO在修復(fù)擬南芥突變體中木聚糖合成缺陷和互補(bǔ)擬南 芥突變體中次生細(xì)胞壁缺陷上的應(yīng)用。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)將PeIRXlO基因重組轉(zhuǎn)入 具有irxlOirxlOl雙突背景的擬南芥植株中，獲得過表達(dá)化IRXlO基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植 株，PeIRXlO基因過表達(dá)得到的互補(bǔ)的植株表型與野生型幾乎一致(如表2和圖3所示）。通過 單克隆抗體LMlO進(jìn)行標(biāo)記，對(duì)互補(bǔ)植株做免疫巧光檢測(cè)，顯示互補(bǔ)型擬南芥莖的橫切面切 片中木質(zhì)部木聚糖具有強(qiáng)烈的免疫信號(hào)(如圖5所示），說明化IRXlO基因能夠修復(fù)擬南芥突 變體中木聚糖合成缺陷，在毛竹木聚糖合成中起重要作用。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0011] 1、本發(fā)明找到了一個(gè)新的來源于毛竹的參與木聚糖合成的關(guān)鍵基因化IRX10,從 而為了解次生細(xì)胞壁的形成，闡明毛竹組織快速生長(zhǎng)的分子基礎(chǔ)提供了具有重要的科學(xué)意 義。
[0012] 2、本發(fā)明利用基因化IRXlO能夠修復(fù)擬南芥突變體中木聚糖合成缺陷和互補(bǔ)擬南 芥突變體中次生細(xì)胞壁缺陷，在毛竹木聚糖合成中起著重要作用。
【附圖說明】
[0013] 附圖1是毛竹化IRXlO基因在不同組織器官中的表達(dá)模式分析柱形圖。
[0014] 附圖2是轉(zhuǎn)化IRXlO基因擬南芥植株RT-PCR檢測(cè)，
[0015] 其中1代表野生型擬南芥;2代表irxlOirxlOl雙突純合植株;3-6則為轉(zhuǎn)化IRXlO基 因植株。
[0016] 附圖3是野生型、雙突植株和互補(bǔ)型擬南芥植株的表型變化。
[0017] 附圖4是野生型、irxlOirxlOl雙突和互補(bǔ)植株莖的次生細(xì)胞壁變化。
[0018] 附圖5是過表達(dá)化IRXlO基因的擬南芥莖部切片的LMlO化學(xué)免疫觀察，
[0019] 其中a代表野生型擬南芥；b代表irxlOirxlOl雙突純合植株；C則為轉(zhuǎn)化IRXlO基因 植株。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例和說明書附圖，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的 實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本 發(fā)明保護(hù)范圍。
[0021] 在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均 可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本行業(yè)常用的。若無特別指明，實(shí)施例采用的方法為本領(lǐng)域通用技術(shù)。
[0022] 實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，是按照常規(guī)條件，Sambrook等作者的分子 克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor LaboratoiT Press,1989)中所述的條件 進(jìn)行。
[0023] 實(shí)施例1毛竹化IRXlO基因表達(dá) [0024](-)實(shí)驗(yàn)方法
[00巧]1.毛竹材料
[0026] 不同組織的毛竹材料取自1年實(shí)生苗的根、莖、葉、花序和幼算，液氮速凍后保存- 80°C，用于總RNA的提取。
[0027] (I)RNA的提取和CDNA的合成
[0028] 通過毛竹中已完成的測(cè)序的基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)和其相應(yīng)的蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 BLAST檢索及比對(duì)分析，得到化IRXlO基因（P冊(cè)1004923G0080;SEQ ID No: 1)的核巧酸序列， 設(shè)計(jì)引物，如下：
[0029] PeIRX10-Fl:5^CCTGAACCACATGTTTGCCG-3^沈Q ID No:2)
[0030] PeIRXlO-Rl:5'-AATCGCACTGCGCATCATTC-3' (SEQ ID No:3)
[0031] 用RM提取試劑盒（OMEGA )提取毛竹各樣品的總RM。采用PrimeScript IIlstStrand cDNA Synthesis Kit(Takara)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為：總 RNA 2iig，Ol igo(dT)化L，酶0.5化，RNA酶抑制劑0.5化，dNTP 2化，加d地2〇至總體系為20化； 反應(yīng)條件為:37°C15min;85°C5s;引物合成在中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)行。
[0032] (2)RT-PCR 分析
[0033] 內(nèi)參選用0-actin基因，引物如下：
[0034] ACTIN-F：TGAGCTTCCTGATGGGCAAG(SEQ ID No：4)；
[0035] ACTIN-R:CCTGATATCCACGTCGCACTT(沈Q ID No:5)。
[0036] W步驟（I)得到的cDNA為模板，用步驟（I)中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序顯示，得到 PeIRXlO基因（核巧酸序列如沈Q ID No: 1所示KRT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:cDNA化L，10X buffer 扣L，LA hq 0.扣L，dNTP 祉L，PeIRX10-Fl 1 化，PeIRXlO-Rl 1化，32.5化 d地2〇， 共50化;反應(yīng)程序?yàn)?95 °C 30s; 95 °C 5s，60°C 30s，40個(gè)循環(huán);烙點(diǎn)曲線檢測(cè)程序?yàn)椋瑥?0°C按 照0.6°C/s速率上升至95°C，連續(xù)讀取巧光信號(hào)值。所用儀器為CFX96實(shí)時(shí)巧光定量PCR儀 (Bio-Rad,美國(guó)），每次檢測(cè)都包括W此0作反應(yīng)模板的陰性對(duì)照，檢測(cè)數(shù)據(jù)采用相對(duì)定量A Ct方法，用內(nèi)參基因0-act in的Ct值進(jìn)行歸一化。
[0037] (二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0038] 在毛竹不同的組織器官中化IRXlO基因的表達(dá)量存在差異(參見附圖1)，其中在竹 算中的表達(dá)水平最高，莖、根和花序中表達(dá)量的表達(dá)量相對(duì)較低，在葉片中的表達(dá)水平最 低。
[0039] 實(shí)施例2擬南芥中毛竹化IRXlO基因的過表達(dá)
[0040] ( - )實(shí)驗(yàn)方法
[0041] 1.表達(dá)載體的構(gòu)建
[0042] 基于Gateway系統(tǒng)用于PCR擴(kuò)增毛竹化IRXlO全長(zhǎng)cDNA序列，擴(kuò)增引物為：
[0043] PeIRXlO-F:
[0044] 5'-
[0045] GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGAGGAGGTGGGTCTTGGCC-3^沈Q ID No:6);
[0046] PeIRXlO-R:
[0047] 5'-
[0048] GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCAAGGCTTCAGGTCGCCCACCG-3' (SEQ ID No： 7)。
[0049] PCR反應(yīng)體系為20化：2XPrimeSTAR Max Premix 10化，上下游引物（10皿ol [I) 各0.扣L，模板化L，dd 出0 化L。反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min;94°C30s，55°Clmin 30s，72°C 30s，35個(gè)循環(huán);72°C延伸lOmin。將擴(kuò)增產(chǎn)物與PD0NR207連接，轉(zhuǎn)化DH5a，得到陽性克隆，提 取質(zhì)粒后進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定，反應(yīng)體系：回收的PCR目的片段化L，pD0NR207載體IiiUBP Clonase Enzyme Mix化L，然后測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒與祀arIyGate 101進(jìn)行LR重組 反應(yīng)，LR反應(yīng)體系：pD0NR207-化IRXlO ：3化，祀arlyGatelOl 化L，LR Clonase E；nz;yme Mix 化L，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌， 獲得的陽性菌落用薩花法轉(zhuǎn)化到擬南芥irxl01(-/-)irxl0(+/-)雜合植株中。
[0050] 2.轉(zhuǎn)基因植株鑒定
[0051 ]經(jīng)基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)化irxl01(-/-)irxl0(-/-)雙突擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株后，通 過PCR和RT-PCR手段進(jìn)行驗(yàn)證，引物為：
[0化2] IRX10-F:5^CCACTCGGAGGACTTGGA-3^沈Q ID No:8),
[0化3] IRX10-R:5^GGAAAAAGCCATTGAAAG GG-3^沈Q ID No:9),
[0化4] T-DNA插入引物：
[0055] LBal: 5' -TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3'(沈Q ID No: 10)，
[0056] 提取四周大的S種基因型的擬南芥植株的RNA，反轉(zhuǎn)錄成CDNA，方法如實(shí)施例1所 述，內(nèi)參基因同實(shí)施例1 ,RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同實(shí)施例1。
[0057] (二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[005引通過RT-PCR檢測(cè)，說明化IRXlO基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入擬南芥并表達(dá)(參見附圖2 )，在附圖2 中，其中1代表野生型擬南芥;2代表irxlOirxlOl雙突純合植株;3-6則為轉(zhuǎn)PeIRXlO基因植 株。在irxlOirxlOl雙突植株背景下，在化IRXlO基因過表達(dá)得到互補(bǔ)的擬南芥植株的表型 大小與野生型幾乎一致(參見附圖3)，同時(shí)具有正常的株高、莖粗W及葉片大小和數(shù)量(參 見表1)。
[0059] 表1野生型，雙突植株和互補(bǔ)型擬南芥植株的表型分析
[0060]
1234 實(shí)施例始B胞壁木聚糖免疫定位 2 (一)實(shí)驗(yàn)方法 3 分別取生長(zhǎng)八周的野生型、雙突植株和互補(bǔ)型擬南芥植株基部的莖，切成Imm厚的 切片，用0.1 M憐酸鹽緩沖液(pH 7.2)洗涂切片5~IOmin;用新鮮的3%脫脂牛乳浸泡切片化 并不斷吹打脫脂牛乳;去除脫脂牛乳，并用PBS緩沖液洗涂切片5min;用大鼠抗木聚糖抗體 LMlO(Plantprobes)解育切片化，然后用PBS緩沖液洗涂切片，W洗凈未結(jié)合的一抗;用稀釋 50倍的FITC-羊抗大鼠抗體(Zomanbio ,Cat. Z1319)解育化，然后用PBS緩沖液洗涂切片10 次，W洗凈未結(jié)合的二抗;最后將切片固定于載玻片上，置于激光共聚焦電子顯微鏡(Zeiss LSM710，495nm)下觀察拍照，結(jié)果如附圖4和附圖5所示。 4 (二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[00化]1 .PeIRXlO基因能互補(bǔ)擬南芥irxlOirxlOl雙突植株次生細(xì)胞壁缺陷
[0066] irxlOirxlOl雙突植株純合植株次生細(xì)胞壁生長(zhǎng)基本缺失，在維管束間纖維和木 質(zhì)部導(dǎo)管細(xì)胞的細(xì)胞壁明顯變薄(參見附圖4的B和E)"PeIRX10基因的互補(bǔ)植株中維管束間 纖維和木質(zhì)部導(dǎo)管細(xì)胞的細(xì)胞壁厚度已經(jīng)與野生型擬南芥近乎相近(參見附圖4的A和D)。 表明化IRXlO基因能夠互補(bǔ)擬南芥irxlOirxlOl植株細(xì)胞壁的次生加厚缺陷。
[0067] 2.?611?10基因可^修復(fù)擬南芥^^0山別01雙突植株細(xì)胞壁木聚糖合成缺失
[0068] 表2野生型、雙突和互補(bǔ)型擬南芥植株莖部細(xì)胞壁單糖組分含量比較 「nnAol
LUU/U」 從巧;看出，巧野生型和此，irxlUirxlUi^乂關(guān)擔(dān)稱甲木糖宵重減少生8%正 右，而細(xì)胞壁中其他單糖(例如阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖等）的含量與野生型相比則有明 顯增加。而在互補(bǔ)植株中，木糖含量W及其他單糖的含量與野生型相近，運(yùn)說明在 irxlOirxlOl突變體中，PeIRXlO基因的過表達(dá)可W使其細(xì)胞壁中的單糖含量恢復(fù)到與野生 型相似。
[0071] 在野生型和互補(bǔ)型擬南芥莖的橫切切片中木質(zhì)部具有強(qiáng)烈的免疫信號(hào)，而在 irxlOirxlOl雙突植株中沒有檢測(cè)到免疫信號(hào)(參見附圖5)，說明具有雙突背景的互補(bǔ)植株 中化IRXlO基因的過表達(dá)使irxlOirxlOl雙突植株中木聚糖缺乏得到恢復(fù)。
[0072] 盡管發(fā)明人已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做了較為詳細(xì)的闡述和列舉，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì) 于本領(lǐng)域一個(gè)熟練的技術(shù)人員來說，對(duì)上述實(shí)施例作出修改和/或變通或者采用等同的替 代方案是顯然的，都不能脫離本發(fā)明精神的實(shí)質(zhì)，本發(fā)明中出現(xiàn)的術(shù)語用于對(duì)本發(fā)明技術(shù) 方案的闡述和理解，并不能構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種毛竹木聚糖合成關(guān)鍵基因 PeIRXlO，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所2. 權(quán)利要求1所述的毛竹木聚糖合成關(guān)鍵基因 PeIRXlO在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，所 述的植物為擬南芥。3. 權(quán)利要求1所述的毛竹木聚糖合成關(guān)鍵基因 PeIRXlO在修復(fù)擬南芥突變體中木聚糖 合成缺陷和互補(bǔ)擬南芥突變體中次生細(xì)胞壁缺陷上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK105925591SQ201610261714
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月22日
【發(fā)明人】宋麗麗, 王杰, 吳藹民, 應(yīng)葉青, 郭小勤
【申請(qǐng)人】浙江農(nóng)林大學(xué)