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      一種紫花苜??果}堿基因MsFLS及其編碼蛋白與應(yīng)用

      文檔序號(hào):10565391閱讀:1228來(lái)源:國(guó)知局
      一種紫花苜蓿抗鹽堿基因MsFLS及其編碼蛋白與應(yīng)用
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種紫花苜??果}堿基因MsFLS及其編碼蛋白與應(yīng)用,屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開的基因開放讀碼框全長(zhǎng)1068bp,編碼355個(gè)氨基酸。具有SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列,利用此序列信息,克隆該基因,構(gòu)建MsFLS基因的克隆載體以及植物表達(dá)載體,并將該基因以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入模式植物煙草中,轉(zhuǎn)基因煙草在含鹽堿成分的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng),結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照相比具有較強(qiáng)的耐鹽堿能力,說(shuō)明MsFLS基因的過(guò)表達(dá)提高了植株對(duì)鹽堿的抗性,進(jìn)一步說(shuō)明該基因能夠參與植物的抗逆過(guò)程。本發(fā)明中的MsFLS基因?yàn)檠芯寇俎?鼓娣肿訖C(jī)理及育種提供了理論依據(jù)。
      【專利說(shuō)明】
      -種紫花首著抗鹽堿基因 MsFLS及其編碼蛋白與應(yīng)用
      技術(shù)領(lǐng)域
      [0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域,具體設(shè)及一種紫花首猜抗鹽堿基因 Ms化S及 其編碼蛋白與應(yīng)用。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 黃酬類物質(zhì)是植物次生代謝產(chǎn)物中的一個(gè)龐大家族。在植物中,黃酬類化合物廣 泛參與各種生物學(xué)過(guò)程,包括對(duì)病原體的響應(yīng)、授粉、光通路、種子發(fā)育等。另外,許多黃酬 類化合物的生物合成受到環(huán)境脅迫的誘導(dǎo),因此,在植物受到生物或非生物脅迫時(shí),黃酬類 物質(zhì)的表達(dá)水平會(huì)顯著增加,例如病原體,營(yíng)養(yǎng)缺乏,鹽堿脅迫等。運(yùn)些環(huán)境脅迫因素的共 同特點(diǎn)是,他們都會(huì)產(chǎn)生和積累次生活性氧,如超氧陰離子(〇2)、過(guò)氧化氨化2〇2)、徑基自 由基(OH)和單線態(tài)氧(1化)等。而活性氧的積累會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)產(chǎn)生氧化脅迫從而造成細(xì)胞組分 的損傷,例如核酸,脂質(zhì),蛋白和多糖等物質(zhì)。植物細(xì)胞有一個(gè)復(fù)雜而完整的活性氧代謝系 統(tǒng),包括酶促和非酶促調(diào)節(jié)機(jī)制。
      [0003] 類黃酬物質(zhì)中包括多種廣為人知的抗氧化物質(zhì)參與植物活性氧代謝,例如抗壞血 酸,O-生育酪等。體外實(shí)驗(yàn)中,黃酬類物質(zhì)作為氨離子和電子供體參與細(xì)胞的抗氧化代謝 中,抵御氧化脅迫的損傷。黃酬醇合成酶(FLS)是類黃酬合成代謝中的關(guān)鍵酶之一,催化3- 徑基黃酬生成黃酬醇,在鹽堿脅迫條件下受誘導(dǎo)大幅上調(diào),進(jìn)而調(diào)控類黃酬物質(zhì)在脅迫下 的響應(yīng)。
      [0004] ±壤鹽堿化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)重要因素之一,研究植物耐受機(jī)理和提高作物耐鹽堿 性已經(jīng)日漸成為廣泛關(guān)注的問(wèn)題。鹽堿脅迫通常會(huì)引起植物細(xì)胞離子和滲透壓的失衡,并 因此引發(fā)次級(jí)的脅迫傷害,例如活性氧積累而形成的氧化脅迫,鹽堿脅迫伴隨的高pH更是 可W直接對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜造成氧化損傷。長(zhǎng)期W來(lái),研究者利用形態(tài)學(xué)和生理學(xué)的研究方法已 經(jīng)初步認(rèn)識(shí)了植物應(yīng)對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)機(jī)制,并W基因克隆和遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)分析上述過(guò) 程中部分關(guān)鍵基因的功能,基因忍片技術(shù)也用于研究鹽堿脅迫下植株的轉(zhuǎn)錄組變化特征, 例如擬南芥,水稻等植物。盡管近年來(lái)已經(jīng)鑒定了一系列逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及相關(guān)基 因,但是目前對(duì)植物耐鹽堿機(jī)制研究的資料仍然十分匿乏,完善的植物鹽堿耐受機(jī)制尚未 建立,值得進(jìn)行更加深入的研究。
      [0005] 紫花首猜作為種植廣泛的牧草,有"牧草之王"的美稱,在世界范圍內(nèi)廣泛種植,是 美國(guó)第=大作物,在我國(guó)也有大面積種植,是一種極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的豆科牧草。紫花首猜屬于 中等耐鹽堿植物,對(duì)鹽堿脅迫具有一定的耐受能力,但鹽堿脅迫仍是影響中國(guó)東北地區(qū)紫 花首猜產(chǎn)量的主要環(huán)境因素之一,嚴(yán)重限制了該地區(qū)紫花首猜的產(chǎn)量。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種紫花首猜抗鹽堿基因 MsFLS及其編碼蛋白與應(yīng)用。
      [0007] 本發(fā)明是通過(guò)W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
      [000引本發(fā)明公開了一種紫花首猜抗鹽堿基因 Ms化S,該抗鹽堿基因 Ms化S的核巧酸序列 如沈Q. ID.NO. I所示。
      [0009] 該抗鹽堿基因 MsFLS全長(zhǎng)為1068bp,編碼355個(gè)氨基酸。
      [0010] 本發(fā)明公開了由上述紫花首猜抗鹽堿基因 Ms化S編碼的蛋白,該蛋白的氨基酸序 列如沈Q. ID.NO. 2所示。
      [0011] 本發(fā)明公開了含有上述的紫花首猜抗鹽堿基因 Ms化S的表達(dá)載體,該表達(dá)載體為 植物表達(dá)載體pCBM-FLS。
      [0012] 本發(fā)明還公開了上述的紫花首猜抗鹽堿基因 Ms化S在提高紫花首猜對(duì)環(huán)境鹽堿脅 迫抗性中的應(yīng)用。
      [0013] 構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述紫花首猜抗鹽堿基因 Ms化S的植物表達(dá)載體,再將所構(gòu)建 的植物表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到煙草組織中,篩選獲得鹽堿抗性增強(qiáng)的植物。
      [0014] 本發(fā)明還公開了上述紫花首猜抗鹽堿基因 Ms化S編碼的蛋白在提高紫花首猜對(duì)環(huán) 境鹽堿脅迫抗性中的應(yīng)用。
      [0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有W下有益的技術(shù)效果:
      [0016] 本發(fā)明從紫花首猜中獲得Ms化S基因的全長(zhǎng)cDNA,該基因的核巧酸序列如序列表 SEQ ID NO: 1所示,其編碼的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。本發(fā)明克隆了紫 花首猜MsFLS基因,并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草,獲得過(guò)表達(dá)MsFLS基因煙草,轉(zhuǎn)基因煙草 在含鹽堿成分的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng),結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照相比具有較強(qiáng)的鹽堿耐受能 力,說(shuō)明Ms化S基因的過(guò)表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽堿的抗性,說(shuō)明該基因能夠參與植物的 抗逆過(guò)程。本發(fā)明中的Ms化S基因?yàn)檠芯渴撞驴鼓娣肿訖C(jī)理及育種提供理論依據(jù)。
      【附圖說(shuō)明】
      [0017]圖1為Ms化S的核巧酸和氨基酸序列信息;
      [0018] 圖2為MsFLS與其他物種同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系;
      [0019] 圖3為植物表達(dá)載體pCBM-FLS構(gòu)建示意圖
      [0020] 圖4為過(guò)表達(dá)MsFLS轉(zhuǎn)基因煙草幼苗葉片PCR檢測(cè)圖;
      [0021] 其中,V'為陽(yáng)性對(duì)照,為陰性對(duì)照,0為空白對(duì)照,1-12為PCR獲的目的條帶,與 陽(yáng)性一致,為轉(zhuǎn)基因植株;
      [0022] 圖5為Ms化S轉(zhuǎn)基因煙草L6與野生型煙草WT在30mmol L-I碳酸氨鋼脅迫處理0天和7 天后的葉片表型;
      [0023] 圖6為Ms化S轉(zhuǎn)基因煙草L6與野生型煙草WT在30mmol L-I碳酸氨鋼脅迫處理0天和7 天后煙草葉片的葉綠素含量;
      [0024] 圖7為Ms化S轉(zhuǎn)基因煙草L6與野生型煙草WT在30mmol L-I碳酸氨鋼脅迫處理0天和7 天后煙草葉片MDA的含量;
      [0025] 圖8為Ms化S轉(zhuǎn)基因煙草L16與野生型煙草WT在SOmmol L-I碳酸氨鋼脅迫處理0天和 7天后進(jìn)行的NBT染色。
      【具體實(shí)施方式】
      [0026] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明,所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而 不是限定。
      [0027] I、紫花首猜MsFLS基因的克隆
      [00巧]從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中化ttp://www.ncbi.nlm.n化.gov/)捜索紫花首猜近源物種裝襲 首猜的核巧酸序列并保存,通過(guò)對(duì)紫花首猜鹽堿脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得紫花首猜中受鹽 堿脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的化S基因,通過(guò)BLAST比對(duì)和進(jìn)化樹分析確定化S基因的核巧酸序列。利用 該序列設(shè)計(jì)克隆引物,引物為:
      [00 巧]MsFLS-F:5'-ATGGCTCTGGAGGCATCCTC-3';
      [0030] MsFLS-R:5'-TTATTTATCCATCTCCTTTT-3 \
      [0031 ] 具體流程如下:
      [0032] 1)RNA的提?。豪肨RIZOL試劑盒提取紫花首猜(Medicago sativa)全株RNA,經(jīng) RT-PCR反轉(zhuǎn)錄為CDNA,W該CDNA為模板進(jìn)行Ms化S基因的克??;
      [0033] 2)RT-PCR反應(yīng):用反轉(zhuǎn)錄試劑盒化irst Strand cDNA Synthesis Kit,Toyobo)進(jìn) 行RT-PCR反應(yīng),反應(yīng)程序:37°C延伸15min;98°C變性5min。反轉(zhuǎn)錄植物全株RNA,獲得單鏈 CDNA,W內(nèi)參引物Act in為引物,W該CDNA為模板進(jìn)行PCR評(píng)估CDNA質(zhì)量無(wú)誤,用W進(jìn)行后續(xù) 實(shí)驗(yàn);
      [0034] 3)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHSa(Toyobo)中,將插入的核巧酸序列利用CEQ8000 DNA Sequence;r(Beckman Coulter,California,USA)進(jìn)行測(cè)序;
      [0035] 4)最終拼接獲取MsFLS基因 ORF的CDS全長(zhǎng)序列。MsFLS基因 CDS全長(zhǎng)為1068bp,編碼 355個(gè)氨基酸。將其氨基酸序列在NCBI中Blast分析,發(fā)現(xiàn)與MtFLS (Medicago truncatula丄)相比,氨基酸同源性為97%,具備2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,包括一個(gè)氨基端的鐵離子 依賴的DIOX結(jié)構(gòu)域和一個(gè)20G-FeII_0xy結(jié)構(gòu)域,結(jié)果如圖1所示。通過(guò)對(duì)其它物種中近源基 因的比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建可見,紫花首猜化S基因與裝襲首猜,大豆,鷹嘴豆等植物中的同源 基因進(jìn)化關(guān)系較近,與小麥等植物進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn),結(jié)果參見圖2。
      [0036] 2、紫花首猜MsFLS基因植物表達(dá)載體構(gòu)建
      [0037] 1) W本發(fā)明中MsFLS的CDNA序列,設(shè)計(jì)引物如下:
      [0038] MsFLS-F:5'-ATGGCTCTGGAGGCATCCTC-3';
      [0039] MsFLS-R:5'-TTATTTATCCATCTCCTTTT-3 \
      [0040] W紫花首猜CDNA為模板,擴(kuò)增MsFLS基因序列。
      [0041] 反應(yīng)條件:
      [0042]
      [0043] PCR產(chǎn)物低溫保藏備用;
      [0044] 2)用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN),回收PCR產(chǎn)物,獲得的PCR產(chǎn)物與T載體 pMD-lST進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞D冊(cè)a,挑取轉(zhuǎn)化陽(yáng)性的克隆提取質(zhì)粒 送交上海生工公司進(jìn)行測(cè)序,經(jīng)過(guò)測(cè)序獲得正確序列的克隆用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);
      [0045] 3)將pCBM質(zhì)粒用PstI進(jìn)行酶切,去憐酸化,并用瓊脂糖凝膠試劑盒回收目的片段, 同時(shí)用PstI進(jìn)行酶切連接在T載體的FLS片段,并回收,將回收的FLS片段與pCBM載體片段連 接,然后后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞,獲得重組克隆,結(jié)果酶切和PCR檢測(cè)后將正確的克隆命名 為pCBM-FLS,載體圖如圖3所示。
      [0046] 3、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草
      [0047] 1)煙草的培養(yǎng)
      [004引野生性煙草SR-I種子40粒W75%的乙醇浸沒3min后用滅菌蒸饋水反復(fù)沖洗6次, 然后W10%的次氯酸鋼原液浸泡15min,再用滅菌蒸饋水清洗6次,將種子置于MS固體培養(yǎng) 基中。待種子萌發(fā)后,移至含有MS固體培養(yǎng)基的大瓶中繼續(xù)培養(yǎng),待其葉片足夠大時(shí)進(jìn)行侵 染。
      [0049] 2)農(nóng)桿菌菌液制備
      [0化0] 挑取-80°C凍存的帶有Ms化S重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌甘油菌在YEB+50mg/L Rif+ 50mg/L Km巧Omg/L Str的固體培養(yǎng)基上活化菌株,并在28°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)36-4化,將 活化得到的農(nóng)桿菌單菌落接種于相同成分的YEB液體培養(yǎng)基中,28°C振蕩培養(yǎng)約16-24h, 0D600 = 0.4-0.6。取出培養(yǎng)液按照1:10接種相同成分的YEB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行二次活化,當(dāng) 00600 = 0.4-0.6時(shí),將菌液倒入無(wú)菌的50ml的離屯、管,于4°C條件下,5000巧m離屯、IOmin,去 掉上清液,用MS培養(yǎng)液重懸菌體至0D600為0.4左右,用于轉(zhuǎn)化。
      [0051] 3)煙草的侵染
      [0052] 在超凈工作臺(tái)內(nèi),將重懸的農(nóng)桿菌菌液倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中,將培養(yǎng)的煙草SR-I葉 片切至0.8mm的方形,作于外植體置于菌液中浸泡8min,其間不斷震蕩。取出外植體置于無(wú) 菌濾紙上吸去附著菌液,葉背面朝上接種于誘導(dǎo)愈傷組織形成的培養(yǎng)基MSl (MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA),在25±2°C條件下暗培養(yǎng)48-7化。然后接種到MS2(MS+2.0mg/L 6-BA+ 0.2mg/L NAA+l.lmg/L PPT巧OOmg/L Cef)培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng),每20d更換一次誘導(dǎo)培 養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)侵染的葉片長(zhǎng)出新的幼芽時(shí),放入到MS3(MS+1.3mg/L PPT+500mg/L Cef)培養(yǎng)基 中進(jìn)行生根,W待后續(xù)分子鑒定。
      [0053] 4)轉(zhuǎn)基因煙草小量DNA的提取
      [0化4] 稱取植物樣品0.1 g,液氮研磨,向管中加入70化1預(yù)熱到65。(:的2 XCTAB Buffer緩 沖液,混勻,65°C水浴45min,每5min輕輕的顛倒混勻,之后將離屯、管取出置于冰上,冷卻至 室溫,加入等體積的酪:氯仿:異戊醇搖勻,12000rpm離屯、IOmin,取上清,向管中加入與上清 等體積的氯仿-異戊醇(24:1)輕輕混勻,4°C,12000rpm離屯、IOmin,取上清,加 1/10體積 3mol/L醋酸鋼和2倍體積預(yù)冷乙醇(或等體積異丙醇),輕輕搖勻至出現(xiàn)絮狀沉淀,置-20°C 醇沉30min,之后離屯、15min,棄上清,加入50化1預(yù)冷的70 %乙醇沖洗,離屯、IOmin,棄上清, 空氣干燥,加入去離子水溶解。
      [0055] 4、轉(zhuǎn)MsFLS基因的煙草轉(zhuǎn)化體的獲得W及轉(zhuǎn)化體的PCR檢測(cè)
      [0化6] PCR鑒定:FLS內(nèi)部基因引物如下 [0057 ] Pr imer 1:5 '-TCTTGATCAATCCTTCCATC-3 '
      [0化引 Primer 2:5'-GAATTTGTTCGATCTCTTGG-3'
      [0化9]反應(yīng)條件:
      [006
      [0061] 參見圖4, W提取的陽(yáng)性植株的DNA為模板,用Ms化S內(nèi)部基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊 脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示編號(hào)16為PCR獲得的目的條帶,與陽(yáng)性一致(即能擴(kuò)增出大約500bp 的目標(biāo)DNA條帶),為轉(zhuǎn)基因植株。其中,V'為陽(yáng)性對(duì)照,為陰性對(duì)照(即W野生型植株基 因組DNA為模板的PCR檢測(cè)結(jié)果),0為空白對(duì)照,M為Marker DL2000。
      [0062] 5、轉(zhuǎn)基因煙草植株功能的初步驗(yàn)證
      [0063] 1)配制30mmol L-In址C〇3溶液。
      [0064] 2)煙草葉綠素含量測(cè)定
      [0065] 取野生型和轉(zhuǎn)基因煙草相同狀態(tài)的葉片,用7mm直徑的打孔器打孔,用化肥化培養(yǎng) 液脅迫處理7天,觀察葉片變化,記錄并拍照。參見圖5,在30mM鹽堿脅迫處理下,野生型煙草 明顯變黃,轉(zhuǎn)基因株系維持綠色,表明轉(zhuǎn)基因株系對(duì)鹽脅迫的耐受性顯著高于野生型,30mM 鹽堿脅迫條件下轉(zhuǎn)基因株系葉片丙二醒含量,NBT染色結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因型植株的葉片在脅 迫條件下生成的超氧陰離子顯著低于野生型,W上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ms化S基因在煙草中的過(guò) 表達(dá)提升了煙草對(duì)鹽的耐受能力。
      [0066] 取上述脅迫處理7天的葉片,提取葉綠素,測(cè)定葉綠素含量,計(jì)算鹽脅迫處理7天后 植株葉綠素含量的變化量。測(cè)葉綠素含量方法如下:
      [0067] ① 0.1 g葉片放入預(yù)冷的研鉢中,加 Iml預(yù)冷80%丙酬,加入少量石英砂研磨
      [0068] ②轉(zhuǎn)移液體到大離屯、管中,用80%丙酬洗研鉢直至無(wú)色。
      [0069] ③ 10000巧m,離屯、5min,4°C。
      [0070] ④取上清(記取上清量)。
      [0071 ] ⑤像沉淀中加入80 %丙酬,洗沉淀,再離屯、,直至沉淀無(wú)色(記取上清量)。
      [0072] 注:取上清的離屯、管暗處理。
      [0073] @樣品測(cè)定:取31111上清液在645]11]1和663]11]1處測(cè)吸光值。80%丙酬調(diào)零。
      [0074] ⑦結(jié)果計(jì)算:Ca= 12.72A663- 2.59A64 已
      [0075] Cb = 22.88A645-4.67A663
      [0076] Ca+b = 20.21A645+8.02A663
      [0077] 葉綠素含量(mg ? g-I或mg ? dm-2) =CXV/AX 1000
      [0078] 式中:C為葉綠素濃度(mg ? kl) ;V為提取液總體積(ml) ;A為取樣鮮重(g)。
      [0079] 轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在30mM Na肥化脅迫下,葉綠素含量因脅迫下降,轉(zhuǎn)基因 植株在脅迫7天條件下,葉綠素含量明顯高于相同脅迫條件下野生型植株,如圖6所示。
      [0080] 3)轉(zhuǎn)基因葉片MDA含量測(cè)定
      [0081 ] 取上述脅迫處理7天的葉片,測(cè)定MDA含量。
      [0082] ①植物葉片置于預(yù)冷研鉢中,加入=氯乙酸研磨,離屯、取上清。
      [0083] ②4 °C 1000巧m離屯、IOmin,取上清,上清即酶液。
      [0084] ③測(cè)定液:2ml酶液+2ml TBA;對(duì)照調(diào)零:2ml蒸饋水+2ml TBA。
      [0085] ④10(TC20分鐘,降至常溫。
      [0086] ⑤4°C 5000巧m離屯、15min,取上清。現(xiàn)化32nm和450nm處OD值。
      [0087] 計(jì)算公式如下:
      [008引丙二醒含量(皿ol/g) = (6.45 XA532 -0.56 XA450) X ViAWX V2)
      [0089] Vi:樣品液體總體積(ml)
      [0090] V2:測(cè)定時(shí)樣品體積(ml)
      [0091] W:樣品鮮重(g)
      [0092] 將生長(zhǎng)狀態(tài)相同的野生型煙草和Ms化S轉(zhuǎn)基因煙草用含30mM化肥化的MS培養(yǎng)基 脅迫處理7天,巧憶丙二醒(MDA)的含量。結(jié)果如圖7所示,轉(zhuǎn)基因株系在脅迫下的MDA積累量 顯著低于野生型煙草。
      [0093] 4)脅迫下煙草葉片NBT染色
      [0094] 取脅迫處理的轉(zhuǎn)基因和野生型煙草葉片于小瓶中,加入NBT染液(Img/mL)直至浸 沒樣品,將處理過(guò)的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片浸泡在染色液中,在室溫黑暗培養(yǎng)過(guò)夜。吸去 染色液,加入乙醇:甘油:乳酸(3:1:1)漂洗液,沸水浴10分鐘,迅速冷卻,換漂洗液,至去除 全部葉綠素。染色結(jié)果如圖8所示。在30mM鹽堿脅迫處理下,轉(zhuǎn)基因植株的著色范圍顯著小 于野生型煙草。
      [00M]綜上所述,本發(fā)明公開了紫花首猜的Ms化S基因及其克隆方法和應(yīng)用,該基因開放 讀碼框全長(zhǎng)l〇68bp,編碼355個(gè)氨基酸。利用此序列信息,克隆該基因,構(gòu)建Ms化S基因的克 隆載體W及植物表達(dá)載體,并將該基因W農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入模式植物煙草中,轉(zhuǎn)基因煙草 在含鹽堿成分的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng),結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照相比具有較強(qiáng)的耐鹽堿能 力,說(shuō)明Ms化S基因的過(guò)表達(dá)提高了植株對(duì)鹽堿的抗性,進(jìn)一步說(shuō)明該基因能夠參與植物的 抗逆過(guò)程。本發(fā)明中的Ms化S基因?yàn)檫M(jìn)行植物抗逆分子育種提供了新的基因資源,為研究植 物抗逆分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
      【主權(quán)項(xiàng)】
      1. 一種紫花苜??果}堿基因 MsFLS,其特征在于,該抗鹽堿基因 MsFLS的核苷酸序列如 SEQ.ID.N0.1 所示。2. 如權(quán)利要求1所述的紫花苜蓿抗鹽堿基因 MsFLS,其特征在于,該抗鹽堿基因 MsFLS全 長(zhǎng)為1068bp,編碼355個(gè)氨基酸。3. 由權(quán)利要求1所述的紫花苜??果}堿基因 MsFLS編碼的蛋白,其特征在于,該蛋白的 氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。4. 含有權(quán)利要求1所述的紫花苜蓿抗鹽堿基因 MsFLS的表達(dá)載體,其特征在于,該表達(dá) 載體為植物表達(dá)載體PCBM-FLS。5. 權(quán)利要求1所述的紫花苜蓿抗鹽堿基因 MsFLS在提高紫花苜蓿對(duì)環(huán)境鹽堿脅迫抗性 中的應(yīng)用。6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于,構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述紫花苜蓿抗鹽堿基 因 MsFLS的植物表達(dá)載體,再將所構(gòu)建的植物表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到煙草組織 中,篩選獲得鹽堿抗性增強(qiáng)的植物。7. 權(quán)利要求2所述的蛋白在提高紫花苜蓿對(duì)環(huán)境鹽堿脅迫抗性中的應(yīng)用。
      【文檔編號(hào)】C12N15/53GK105925589SQ201610414881
      【公開日】2016年9月7日
      【申請(qǐng)日】2016年6月14日
      【發(fā)明人】郭長(zhǎng)虹, 安逸民, 杜秉昊, 張軍, 張雪
      【申請(qǐng)人】哈爾濱師范大學(xué)
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