與辣椒花藥黃色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記gssr114及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種與辣椒花藥黃色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記GSSR114及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒是否具有“花藥黃色”這一性狀的引物對(duì)，為能夠擴(kuò)增得到如下DNA片段的引物對(duì)：是以辣椒基因組DNA為模板，采用序列1和序列2所示引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的DNA片段，具體為由序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)。本發(fā)明選取市場(chǎng)現(xiàn)有的優(yōu)良品種的辣椒材料，進(jìn)行雜交、單倍體培育并加倍，之后進(jìn)行花藥顏色篩選鑒定，獲知花藥黃色由單隱性基因控制，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該單隱性基因與SSR標(biāo)記GSSR114緊密連鎖，GSSR114于辣椒開(kāi)花前就預(yù)測(cè)出花藥是否為黃色，可用于辣椒育種。CGMCC No. 1254820160601
【專(zhuān)利說(shuō)明】
與辣楓花藥黃色基因緊密連鎖的分子標(biāo)巧GSSR114及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，設(shè)及一種與辣椒花藥黃色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記 GSSRl 14及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 辣椒(Capicum annuum L.)是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的重要蔬菜作物。辣椒雜種優(yōu) 勢(shì)明顯，利用雜種優(yōu)勢(shì)可有效解決辣椒市場(chǎng)需求。目前辣椒市場(chǎng)上主要應(yīng)用的是Fi代雜交 種。而種子純度的高低直接影響一代雜交種的產(chǎn)量及產(chǎn)品質(zhì)量。在辣椒雜交制種過(guò)程中，母 本自交種子的產(chǎn)生會(huì)顯著降低雜交種的純度。在利用辣椒雄性不育兩用系制種過(guò)程中，若 不能完全拔出50%的可育株，同樣會(huì)大大降低雜交種子的質(zhì)量。而且不育系本身育性易受 環(huán)境條件影響而使不育性不穩(wěn)定，導(dǎo)致自交結(jié)實(shí)而影響制種純度。
[0003] 隱性標(biāo)記性狀的利用可有效解決上述問(wèn)題。將易于識(shí)別的隱性標(biāo)記性狀轉(zhuǎn)育給辣 椒母本和辣椒雄性不育系，通過(guò)目測(cè)及標(biāo)記性狀連鎖標(biāo)記分析進(jìn)行選擇，可有效解決常規(guī) 辣椒雜種鑒定方法繁瑣、耗時(shí)、費(fèi)財(cái)，及辣椒雄性不育系、保持系的選育周期較長(zhǎng)、費(fèi)力等問(wèn) 題。
[0004] 辣椒花藥的顏色有多種，有黃色、綠色、紫色和粉色等等。然而至今還沒(méi)有辣椒花 藥顏色遺傳分析和基因定位的相關(guān)研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種與辣椒花藥黃色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記GSSR114及其 應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供了用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒是否具有"花藥黃色"運(yùn)一性狀的引 物對(duì)。
[0007] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒是否具有"花藥黃色"運(yùn)一性狀的 引物對(duì)可為能擴(kuò)增得到如下DNA片段的引物對(duì):所述DNA片段是W辣椒基因組DNA為模板，采 用序列表中序列1和序列2所示引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的DNA片段。
[000引進(jìn)一步，所述引物對(duì)具體可為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成 的引物對(duì)。
[0009] 所述引物對(duì)的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。制備所述引物對(duì)的方法，具體 可包括將所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。
[0010] 含有所述引物對(duì)和如下中的至少一種的用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒是否具有 "花藥黃色"運(yùn)一性狀的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：dNTP、DNA聚合酶和PCR擴(kuò)增緩沖 液。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒是否具有"花藥黃色"運(yùn)一性狀的 方法。
[0012] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒是否具有"花藥黃色"運(yùn)一性狀的方法， 具體可包括如下步驟：
[OOK] (a似待測(cè)辣椒的基因組DNA為模板，采用所述引物對(duì)(如序列1和序列2)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；
[0014] (b)將步驟(a)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果按照如下確定所述待測(cè) 辣椒是否具有"花藥黃色"運(yùn)一性狀:若將步驟(a)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳所得帶型與標(biāo) 準(zhǔn)帶型一致，則所述待測(cè)辣椒具有或者候選具有"花藥黃色"運(yùn)一性狀;若將步驟(a)所得 PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳所得帶型與所述標(biāo)準(zhǔn)帶型不一致，則所述待測(cè)辣椒不具有或者候選 不具有"花藥黃色"運(yùn)一性狀;所述標(biāo)準(zhǔn)帶型為W具有"花藥黃色"運(yùn)一性狀的辣椒(如辣椒 材料DHl21)的基因組DNA為模板，W所述引物對(duì)(如序列1和序列2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳所得的帶型。
[0015] 將步驟(a)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳時(shí)采用的凝膠電泳條件與獲得所述標(biāo)準(zhǔn)帶 型時(shí)采用的凝膠電泳條件應(yīng)該保持一致。
[0016] 在所述方法中，所述待測(cè)辣椒可為任意品種的辣椒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所 述待測(cè)辣椒具體選自辣椒材料DH12U花藥黃色）、辣椒自交系12-Z65(花藥紫色），W及運(yùn)兩 者的雜交或回交后代。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種培育具有"花藥黃色"運(yùn)一性狀的辣椒品種的方法。
[0018] 本發(fā)明所提供的培育具有"花藥黃色"運(yùn)一性狀的辣椒品種的方法，具體可包括選 取符合如下條件的辣椒品種作為親本進(jìn)行育種的步驟：W基因組DNA為模板，采用所述引物 對(duì)(如序列1和序列2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳條帶的帶型與標(biāo)準(zhǔn)帶型 相同；所述標(biāo)準(zhǔn)帶型為W具有"花藥黃色"運(yùn)一性狀的辣椒(如辣椒材料DH121)的基因組DNA 為模板，W所述引物對(duì)(如序列1和序列2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳所得的 帶型。
[0019] 將所述親本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳時(shí)采用的凝膠電泳條件與獲得所述標(biāo)準(zhǔn)帶型 時(shí)采用的凝膠電泳條件應(yīng)該保持一致。
[0020] 在上述兩種方法中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的退火溫度可為55°C。
[00別]進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件具體為：94°C預(yù)變性4min;94°C變性15s，55°C退 火 15s，72°C 延伸 30s，：34 個(gè)循環(huán)；72°C 保溫 5min。
[0022] 在上述兩種方法中，所述電泳具體可為非變性聚丙締酷胺凝膠電泳，所述非變性 聚丙締酷胺凝膠中，所述聚丙締酷胺凝膠的濃度為6.0%(質(zhì)量百分含量）。
[0023] 在本發(fā)明中，所述辣椒材料M1121具體是按照包括如下步驟的方法選育獲得的：
[0024] (1)將四份用于雜交的辣椒品種兩兩進(jìn)行雜交，得到兩個(gè)單交雜種;再將兩個(gè)所述 單交雜種進(jìn)行雜交，得到雙交雜種；
[0025] 所述四份用于雜交的辣椒品種為"己歐"、"瑪麗蓮"、"博收一號(hào)"和"博收二號(hào)"；
[0026] (2)將所述雙交雜種進(jìn)行單倍體培育，加倍后得到系列DH株系；
[0027] (3)從系列所述DH株系中選擇花藥為黃色的株系，即為所述辣椒材料DH121。
[0028] 在所述方法的步驟（1)中，所述"將四份用于雜交的辣椒品種兩兩進(jìn)行雜交"為將 "己歐"與"博收一號(hào)"進(jìn)行雜交，"瑪麗蓮"與"博收二號(hào)"進(jìn)行雜交。
[0029] 在所述方法的步驟(2)中，所述系列DH株系可為:將所述雙交雜種進(jìn)行單倍體培育 所得的若干自然加倍的雙單倍體，和/或?qū)⑺鲭p交雜種進(jìn)行單倍體培育所得的若干單倍 體進(jìn)行人工染色體加倍后得到的若干人工加倍的雙單倍體。
[0030] 在所述方法的步驟(2)中，所述進(jìn)行的單倍體培育為花藥培養(yǎng)。
[0031] 進(jìn)一步，進(jìn)行所述花藥培養(yǎng)時(shí)的花藥為取自于4°C低溫預(yù)處理1-3天(如2天）的花 蕾中的花藥，其中的所述花蕾可為小抱子發(fā)育處于單核靠邊期一雙核早期的花蕾。
[0032] 進(jìn)一步，進(jìn)行所述花藥培養(yǎng)時(shí)采用的培養(yǎng)基為N4-3培養(yǎng)基;所述N4-3培養(yǎng)基為固 液雙層培養(yǎng)基（固體層在下，液體層在上）；固體層為在NTH基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加薦糖至 在所述固體層的質(zhì)量百分比為3-6% (如3%)，添加活性炭至在所述固體層的質(zhì)量百分比為 0.5%，添加瓊脂粉至在所述固體層的質(zhì)量百分比為0.8%，pH值調(diào)為5.8;液體層為在NTH基 本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加薦糖至在所述液體層的質(zhì)量百分比為3-6% (如6% )，添加IAA至在 所述液體層的濃度為0.5-1.5mg/L(如1. Omg/L)，添加6-BA至在所述液體層的濃度為0.1- 0.6mg/L(如0.6mg/L)，添加戊烘草胺至在所述液體層的濃度為0.1-0.5mg/L(如0.5mg/L)， pH值調(diào)為5.8。其中，所述NTH基本培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：硝酸氨825mg/L，硝 酸鐘950mg/L，二水氯化巧166mg/L，屯水硫酸儀185mg/L，憐酸二氨鐘680mg/L，棚酸6.20mg/ L，四水硫酸儘25mg/L，屯水硫酸鋒lOmg/L，二水鋼酸鋼0.25mg/L，五水硫酸銅0.025mg/L，六 水氯化鉆0.03mg/L，肌醇lOOmg/L，煙酸5mg/L，鹽酸化唉醇0.5mg/L，鹽酸硫胺素0.5mg/L，甘 氨酸2mg/L，葉酸5mg/L，生物素0.5mg/L。另外，培養(yǎng)時(shí)的接種密度為每60mm直徑培養(yǎng)皿12- 18枚(如嫩)花藥。
[0033] 進(jìn)一步，進(jìn)行所述花藥培養(yǎng)時(shí)，所述花藥先在28-35°C(如28°C)條件下黑暗培養(yǎng)1- 10天(如8天），再轉(zhuǎn)移到25-28°C(如25°C)條件下黑暗培養(yǎng)4-8周（如8周），得到胚狀體;將所 述胚狀體轉(zhuǎn)移到不加激素的MS基本培養(yǎng)基上，培育壯苗，得到再生株。
[0034] 在所述方法的步驟(3)中，從系列所述DH株系中選擇花藥為黃色的株系，是通過(guò)在 辣椒口椒始花期采用目測(cè)法觀察已盛開(kāi)花朵花藥的顏色來(lái)完成選擇的。
[0035] 在所述方法的步驟(3)中，所選的株系除了具有"花藥黃色"運(yùn)一性狀外，最好同時(shí) 其他綜合性狀優(yōu)良（如植株生長(zhǎng)健壯、座果連續(xù)性好、抗病性好）。
[0036] 所述辣椒材料畑121所具有的"花藥黃色"運(yùn)一性狀由單隱性基因控制。
[0037] 本發(fā)明還提供了一種與辣椒"花藥黃色"運(yùn)一性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。
[0038] 本發(fā)明所提供的與辣椒"花藥黃色"運(yùn)一性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，具體為W辣椒基因 組DNA為模板，采用所述引物對(duì)(如序列1和序列2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的DNA片段。
[0039] 所述引物對(duì)(如序列1和序列2)或所述試劑盒或所述分子標(biāo)記在如下任一中的應(yīng) 用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0040] (1)鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒是否具有"花藥黃色"運(yùn)一性狀；
[0041] (2)辣椒育種。
[0042] 本發(fā)明選取市場(chǎng)現(xiàn)有的優(yōu)良品種的辣椒材料，進(jìn)行雜交、單倍體培育并加倍，之后 進(jìn)行花藥顏色篩選鑒定，獲知花藥黃色由單隱性基因控制，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該單隱性基 因與SS財(cái)示記GSSR114緊密連鎖，GSSR114于辣椒開(kāi)花前就預(yù)測(cè)出花藥是否為黃色，可用于辣 椒育種。
[0043] 保藏說(shuō)明
[0044] 建議分類(lèi)命名:辣椒
[0045] 拉下名：Kapsi州m annuum)
[0046] 參據(jù)的生物材料：12-Z65
[0047] 保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、
[004引保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱(chēng):CGMCC
[0049] 地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)
[0050] 保藏日期:2016年6月舊
[0化1] 保藏中屯、登記入冊(cè)編號(hào)：CGMCC No. 12548
【附圖說(shuō)明】
[0052] 圖1為具有由單隱性基因控制的"花藥黃色"運(yùn)一性狀的辣椒材料DH121的選育流 程圖。
[0053] 圖2為實(shí)施例1中花藥培養(yǎng)步驟中得到的胚狀體的照片。
[0054] 圖3為實(shí)施例1中再生植株培養(yǎng)步驟中得到的再生株的照片。
[0055] 圖4為實(shí)施例1中馴化移栽步驟中得到的植株的照片。
[0056] 圖5為辣椒材料M1121的黃色花藥(右)和12-Z65的紫色花藥(左）圖片。
[0057] 圖6為實(shí)施例2中辣椒材料M1121花藥黃色連鎖分析示意圖。
[005引圖7為實(shí)施例3中與辣椒ayw基因緊密連鎖的GSSR114分子標(biāo)記的驗(yàn)證結(jié)果。泳道1- 8和10-64為96份WDH121與12-Z65為親本構(gòu)建的BCi株系中部分株系的驗(yàn)證結(jié)果。B所示的 是與父本12-Z65-致的帶型，A所示的是與母本DH121-致的帶型，H所示的是A和B的雜合帶 型。
【具體實(shí)施方式】
[0059] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0060] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0061] 辣椒品種"己歐"為上海種都種業(yè)科技有限公司產(chǎn)品。辣椒品種"瑪麗蓮"為先正達(dá) 生物科技中國(guó)有限公司產(chǎn)品。辣椒品種"博收一號(hào)"和"博收二號(hào)"為北京博收種子有限公司 產(chǎn)品。
[0062] 實(shí)施例1、具有由單隱性基因控制的"花藥黃色"運(yùn)一性狀的辣椒材料DH121的選育 及鑒定
[0063] -、具有由單隱性基因控制的"花藥黃色"運(yùn)一性狀的辣椒材料M1121的選育
[0064] 選育具有由單隱性基因控制的"花藥黃色"運(yùn)一性狀的辣椒材料DH121的方法，如 圖1所示。
[0065] (1)選取雜交材料：四份用于雜交的優(yōu)良辣椒品種"己歐"、"瑪麗蓮"、"博收一號(hào)" 和"博收二號(hào)"。
[0066] (2)雜交:將吧歐"與"博收一號(hào)'進(jìn)行雜交，得到單交雜種1;將"瑪麗蓮"與"博收 二號(hào)"進(jìn)行雜交，得到單交雜種2。再將單交雜種1和單交雜種2雜交，得到雙交雜種。
[0067] (3)單倍體培育并加倍:將所述雙交雜種進(jìn)行單倍體培育，得到若干自然加倍的雙 單倍體(DH株系）和若干單倍體;從若干所述DH株系中選擇花藥為黃色(最好同時(shí)其他綜合 農(nóng)藝性狀優(yōu)良）的株系，即為具有由單隱性基因控制的"花藥黃色"運(yùn)一性狀的辣椒材料 DH121。其中，所述DH株系除了為若干自然加倍的雙單倍體外，也可W為對(duì)所述若干單倍體 進(jìn)行人工染色體加倍后得到若干人工加倍的雙單倍體。
[0068] ①選取花蕾:在上述雙交雜種中，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲(chóng)害的植株作為供體植株， 嚴(yán)格按鏡檢結(jié)果選取小抱子發(fā)育處于單核靠邊期一雙核早期的花蕾。
[0069] ②花蕾預(yù)處理:4°C低溫預(yù)處理花蕾2天。
[0070] ③花蕾消毒：取合適大小的預(yù)處理后的花蕾，剝?nèi)セ▽?zhuān)后，先用75%的酒精浸泡 30s，再用8%的次氯酸鋼振蕩消毒15min，最后用無(wú)菌水清洗3次，每次5min，得到消毒后的 花蕾。
[0071] ④接種:取消毒后的花蕾，于超凈工作臺(tái)上將花藥完好無(wú)損的剝離，W每60mm直徑 培養(yǎng)皿12枚花藥的密度接種于M-3培養(yǎng)基上。
[0072] 該M-3培養(yǎng)基為固液雙層培養(yǎng)基（固體層在下，液體層在上），固體層為在NTH基本 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加薦糖至在所述固體層的質(zhì)量百分比為3%，添加活性炭至在所述固體 層的質(zhì)量百分比為0.5%，添加瓊脂粉至在所述固體層的質(zhì)量百分比為0.8%，pH值調(diào)為 5.8;液體層為在NTH基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加薦糖至在所述液體層的質(zhì)量百分比為6%，添 加 IAA至在所述液體層的濃度為1. Omg/L，添加 6-BA至在所述液體層的濃度為0.6mg/L，添加 戊烘草胺至在所述液體層的濃度為0.5mg/L，pH值調(diào)為5.8。
[0073] 其中，NTH基本培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：硝酸氨825mg/L，硝酸鐘 950mg/L，二水氯化巧166mg/L，屯水硫酸儀185mg/L，憐酸二氨鐘680mg/L，棚酸6.20mg/L，四 水硫酸儘25mg/L，屯水硫酸鋒lOmg/L，二水鋼酸鋼0.25mg/L，五水硫酸銅0.025mg/L，六水氯 化鉆0.03mg/L，肌醇lOOmg/L，煙酸5mg/L，鹽酸化唉醇0.5mg/L，鹽酸硫胺素0.5mg/L，甘氨酸 2mg/L，葉酸5mg/L，生物素 0.5mg/L。
[0074] ⑤花藥培養(yǎng):花藥先在28°C條件下黑暗培養(yǎng)8天，再轉(zhuǎn)移到25°C條件下繼續(xù)黑暗培 養(yǎng);培養(yǎng)8周時(shí)間，即可看到大量胚狀體發(fā)生，如圖2所示。
[0075] ⑥再生株培養(yǎng):選取子葉型胚狀體，轉(zhuǎn)移到不加激素的MS基本培養(yǎng)基上，培育壯 苗，得到再生株，如圖3所示。
[0076] ⑦鑒定倍性:待再生株長(zhǎng)至3-4片真葉，切取葉片，通過(guò)保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法，從 細(xì)胞染色體的水平鑒定再生株的倍性。
[0077] ⑧馴化移栽:將鑒定為二倍體的上述再生株移栽至培養(yǎng)±中，進(jìn)行馴化培養(yǎng)；其 中，該培養(yǎng)±由賠石和草炭按質(zhì)量比1:1混合制成，并經(jīng)過(guò)高壓滅菌;培養(yǎng)條件為:光照時(shí)間 為16小時(shí)/天，強(qiáng)度為20001X光照，溫度為22-25°C;培養(yǎng)得到馴化后的二倍體再生株，即DH 株系(如圖4所示）。
[0078] ⑨性狀調(diào)查:在辣椒口椒始花期，采用目測(cè)法觀察已盛開(kāi)花朵花藥的顏色，根據(jù)觀 測(cè)結(jié)果，與Royal ^dicultural Society比色卡（北京東方諾貝科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品） 上相應(yīng)代碼(如下1-6)的顏色進(jìn)行比對(duì)，按照最大相似度原則，確定所觀察的辣椒材料的花 藥顏色。1:白（FAN4 155C);2:淺黃(FANl 6C);3:黃(FANl 12A);4:淺藍(lán)(FAN2 110A);5:藍(lán) (FAN2 110A);6:紫(FAN2N89CD)。從系列所述DH株系中選擇花藥為黃色（對(duì)應(yīng)比色卡上的 "3:黃(FANl 12Ar)、植株生長(zhǎng)健壯、座果連續(xù)性好、抗病性好的優(yōu)良株系），即為具有由單 隱性基因控制的"花藥黃色"運(yùn)一性狀的辣椒材料M1121。
[0079] 二、具有由單隱性基因控制的"花藥黃色"運(yùn)一性狀的辣椒材料M1121的鑒定
[0080] W經(jīng)步驟一四親雜交、單倍體培育選育出的其它綜合性狀優(yōu)良、花藥為黃色的辣 椒雙單倍體材料D化21與花藥為紫色的辣椒12-Z65CGMCC No. 12548為親本（圖5)，構(gòu)建Pi、 P2、Fi、BCi、BC2、F2 六聯(lián)合世代。
[0081 ] 2013年春季，于北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中屯、農(nóng)場(chǎng)將畑121(Pi)與12-Z65(P2)雜 交，得到Fi代種子，2013年冬季，于中屯、海南立亞農(nóng)場(chǎng)，F(xiàn)i代自交、并分別與DHm、12-Z65回 交，分別獲得F2、BCi和BC2代的種子。
[0082] 2014年春季和秋季，將六個(gè)世代的種子播種，溫室內(nèi)育苗。2014年春季Pi、P2、Fi、 BCi、BC2、F2六個(gè)世代的樣本容量分別為：25、26、30、126、130、253。2014年秋季口1、口2、尸1、8。、 BC2、F2六個(gè)世代的樣本容量分別為:21、25、24、84、86、243(表1)。
[0083] 在辣椒口椒始花期，采用目測(cè)法觀察已盛開(kāi)花朵花藥的顏色。根據(jù)觀測(cè)結(jié)果，與標(biāo) 準(zhǔn)卡上相應(yīng)代碼的顏色進(jìn)行比對(duì)，按照最大相似度原則，確定種質(zhì)的顏色。
[0084] 1:白（FAN4 155C);
[00化]2:淺黃(FANl 6C);
[0086] 3:黃(FANl 12A);
[0087] 4:淺藍(lán)(FAN2 110A);
[008引 5:藍(lán)(FAN2 110A);
[0089] 6:紫(FAN2N89CD)。
[0090] 2人同時(shí)調(diào)查W確保結(jié)果的準(zhǔn)確性?；ㄋ帪辄S色的單株（即符合比色卡上"3:黃 (FANl 12A)"的單株），鑒定為花藥黃色，其它盡管紫色深淺有差異，均統(tǒng)計(jì)為花藥非黃色。 計(jì)算分離比，采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，SAS8.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行卡方 測(cè)驗(yàn)。
[0091] 綜合兩個(gè)季節(jié)的花藥顏色鑒定結(jié)果，2014年春季，在Fi群體和BC2群體中，全部為非 黃色花藥植株;在F2群體中，花藥為非黃色的單株有184株，花藥為黃色的單株有69株，非黃 色花藥與黃色花藥植株數(shù)量的分離比例經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合3:1;在BCi群體中，花藥為非黃色 的單株有65株，花藥為黃色的單株有61株，非黃色花藥與黃色花藥植株數(shù)量的分離比例經(jīng) 卡方檢驗(yàn)符合1:1 (表1)。2014年秋季，在Fi群體和BC2群體中，全部為非黃色花藥植株;在F2 群體中，花藥為非黃色的單株有186株，花藥為黃色的單株有57株，非黃色花藥與黃色花藥 植株數(shù)量的分離比例經(jīng)卡方檢驗(yàn)也符合3:1;在BCi群體中，花藥為非黃色的單株有43株，花 藥為黃色的單株有41株，非黃色花藥與黃色花藥植株數(shù)量的分離比例經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合1:1 (表1)。由此可知，辣椒"花藥黃色"運(yùn)一性狀由1對(duì)單隱性基因控制。
[0092] 表1 M1121X12-Z65后代群體CMV抗性分離情況統(tǒng)計(jì)
[0093]
[0094]
[00巧]實(shí)施例2、與ayw基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記GSSR114的獲得
[0096] -、實(shí)驗(yàn)方法
[0097] 采用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取實(shí)施例1中雙親、F2群體各單株基因組 DNA。首先，應(yīng)用平均分布于辣椒12條染色體的1200對(duì)SSR引物(標(biāo)為genSSR、GSSR、ZS、PSWP 2400對(duì)InDel引物(標(biāo)為GI、CIDH)對(duì)辣椒雙親進(jìn)行多態(tài)性篩選。然后，在F2群體中各選7個(gè)黃 色花藥、紫色花藥單株的DNA，構(gòu)建黃色花藥和非黃色花藥基因池，利用上一步篩選出的多 態(tài)性引物對(duì)辣椒花藥黃色與非黃色基因池DNA進(jìn)行BSA分析，進(jìn)一步篩選多態(tài)性引物。最后 利用上一步篩選出的多態(tài)性引物對(duì)F2群體各單株基因型進(jìn)行分析，并利用化inMap 4.0軟 件繪制連鎖圖。
[009引 SSR和InDel PCR標(biāo)記反應(yīng)體系10化:3化DNA(2.SngAiU，正向、反向引物巧OngAi L)各化L，扣L GoTaq泉.Green Master 111；[又。1'01116邑日，胖13。0]13；[]1,1]54)?？凇??反應(yīng)程序：94°[預(yù) 變性4min;94°C變性15s，55°C退火15s，72°C延伸303,34個(gè)循環(huán);72°(：保溫5111111。擴(kuò)增產(chǎn)物用 6.0 %非變性聚丙締酷胺凝膠，150V恒功率電泳分離Ih，銀染顯色后在膠片觀察燈下進(jìn)行帶 型統(tǒng)計(jì)分析。
[0099] 共顯性標(biāo)記的統(tǒng)計(jì)方法:按照化inmap 4.0的要求母本DH121-致的帶型記為A(花 藥應(yīng)為黃色），與父本12-Z65-致的帶型記為B(花藥應(yīng)為紫色），雜合帶型記為H(花藥應(yīng)為 紫色）。
[0100] 連鎖圖構(gòu)建：先用Calculate命令計(jì)算相關(guān)參數(shù)，在Gro叫ings(tree)命令下，在 L0D>3.0的狀態(tài)下進(jìn)行連鎖群分組，然后用Create Groups for Mapping命令作圖，用Map 命令構(gòu)建框架圖，并進(jìn)行圖距的計(jì)算。
[0101] 二、結(jié)果
[0102] 應(yīng)用平均分布于辣椒12條染色體的1200對(duì)SSR引物(標(biāo)為genSSR、GSSR、ZS、PSWP 2400對(duì)InDel引物(標(biāo)為GI、CIDH)對(duì)辣椒雙親進(jìn)行多態(tài)性篩選，其中592對(duì)表現(xiàn)為多態(tài)，多態(tài) 率為16.44%。利用592對(duì)引物對(duì)辣椒花藥黃色與非黃色基因池DNA進(jìn)行BSA分析，篩選獲得 46對(duì)多態(tài)性引物。用篩選出的46對(duì)多態(tài)性引物對(duì)秋季F2群體的243個(gè)單株進(jìn)行分離分析。利 用JoinMap 4.0軟件將其中的28個(gè)分子標(biāo)記和ayw基因定位到了第11條染色體上化OD = 10)，距離ayw基因最近的分子標(biāo)記為GSSR114,遺傳距離為0.1 cM(圖6)。
[0103] 用于擴(kuò)增SSR標(biāo)記GSSRl 14的引物對(duì)：
[0104] 上游引物:5'-TCTTAGCAAGAATGCCCCAG-3'（序列1);
[0105] 下游引物:5 ' -CGGTAACCCATGTCACGATT-3 '（序列2)。
[0106] 實(shí)施例3、與ayw基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記GSSR114在鑒定辣椒花藥顏色上的應(yīng)用
[0107] -、實(shí)驗(yàn)材料
[0108] 從實(shí)施例1中W辣椒材料DH121與辣椒自交系12-Z65為親本構(gòu)建的BCi群體中隨機(jī) 選取96個(gè)單株（表3)作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)實(shí)施例2獲得的與ayw基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記 GSSRl 14進(jìn)行驗(yàn)證，確定利用該標(biāo)記篩選具有"花藥黃色"運(yùn)一性狀的辣椒品種，用于分子標(biāo) 記輔助育種(Marker assisted selection,MAS)的準(zhǔn)確性。
[0109] 二、實(shí)驗(yàn)方法
[0110] 針對(duì)從實(shí)施例1中W辣椒材料DHl21與辣椒自交系12-Z65為親本構(gòu)建的BCi群體中 隨機(jī)選取的96個(gè)單株(表3)，苗期單株掛牌標(biāo)記取樣后，提取其基因組DNA并W其為模板，用 實(shí)施例2獲得的與ayw基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記GSSR114的擴(kuò)增引物(序列巧日序列2)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)各單株的基因型。同時(shí)，在辣椒口椒始花期，采用目測(cè)法觀察運(yùn)96個(gè)單株 已盛開(kāi)花朵花藥的顏色并做記錄(參見(jiàn)實(shí)施例1相關(guān)步驟進(jìn)行）。
[0111] PCR反應(yīng)體系（10化）：3化DNA( 2. SngAiL)，正向、反向引物（SOngAiL)各化L，化L GoTaq巧Green Master mix(Promega，Wisconsin,USA)。
[0112] PCR反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性4min;94°C變性15s，55°C退火15s，72°C延伸30s，34個(gè)循 環(huán)；72°C 保溫 5min。
[0113] 擴(kuò)增產(chǎn)物用6.0%非變性聚丙締酷胺凝膠，150V恒功率電泳分離化，銀染顯色后在 膠片觀察燈下進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)分析。與母本D化21-致的帶型記為A，與父本12-Z65-致的帶 型記為B，雜合帶型記為H。
[0114] 結(jié)果發(fā)現(xiàn):針對(duì)分子標(biāo)記GSSRl 14，96份BCi群體材料中僅有4份材料(QB31、QB60、 地81和QB82)帶型與表型結(jié)果不相符，正確率高達(dá)95.8% (表3,圖7)。該結(jié)果表明，采用分子 標(biāo)記GSSR114可W在苗期就鑒定出待測(cè)辣椒是否為黃色花藥，且鑒定結(jié)果準(zhǔn)確率較高。
[0115] 表3利用96份WDH121與12-Z65為親本構(gòu)建的BCi株系對(duì)標(biāo)記GSSR114進(jìn)行準(zhǔn)確性 驗(yàn)證(地群體為(畑121 X 12-Z65) XDH121)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒是否具有"花藥黃色"這一性狀的引物對(duì)，為能夠擴(kuò)增 得到如下DNA片段的引物對(duì):所述DNA片段是以辣椒基因組DNA為模板，采用序列表中序列1 和序列2所示引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的DNA片段。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，其特征在于:所述引物對(duì)為由序列表中序列1和序列2 所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)。3. 制備權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)的方法，包括將權(quán)利要求1或2所述兩條單鏈DNA分 別單獨(dú)包裝的步驟。4. 用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒是否具有"花藥黃色"這一性狀的試劑盒，含有權(quán)利要 求1或2所述的引物對(duì)和如下中的至少一種:dNTP、DNA聚合酶和PCR擴(kuò)增緩沖液。5. -種鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒是否具有"花藥黃色"這一性狀的方法，包括如下步 驟： (a) 以待測(cè)辣椒的基因組DNA為模板，采用權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 至IjPCR產(chǎn)物； (b) 將步驟(a)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果按照如下確定所述待測(cè)辣椒 是否具有"花藥黃色"這一性狀:若將步驟( a)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳所得帶型與標(biāo)準(zhǔn)帶 型一致，則所述待測(cè)辣椒具有或者候選具有"花藥黃色"這一性狀;若將步驟(a)所得PCR產(chǎn) 物進(jìn)行凝膠電泳所得帶型與所述標(biāo)準(zhǔn)帶型不一致，則所述待測(cè)辣椒不具有或者候選不具有 "花藥黃色"這一性狀； 所述標(biāo)準(zhǔn)帶型為以具有"花藥黃色"這一性狀的辣椒的基因組DNA為模板，以所述引物 對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳所得的帶型。6. -種培育具有"花藥黃色"這一性狀的辣椒品種的方法，包括選取符合如下條件的辣 椒品種作為親本進(jìn)行育種的步驟:以基因組DNA為模板，采用權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳條帶的帶型與標(biāo)準(zhǔn)帶型相同； 所述標(biāo)準(zhǔn)帶型為以具有"花藥黃色"這一性狀的辣椒的基因組DNA為模板，以所述引物 對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳所得的帶型。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的退火溫度為55 cC。8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于:獲得所述標(biāo)準(zhǔn)帶型時(shí)采用的所述 具有"花藥黃色"這一性狀的辣椒為辣椒材料DH121; 所述辣椒材料DH121是按照包括如下步驟的方法選育獲得的： (1) 將四份用于雜交的辣椒品種兩兩進(jìn)行雜交，得到兩個(gè)單交雜種;再將兩個(gè)所述單交 雜種進(jìn)行雜交，得到雙交雜種； 所述四份用于雜交的辣椒品種為"巴歐"、"瑪麗蓮"、"博收一號(hào)"和"博收二號(hào)"； (2) 將所述雙交雜種進(jìn)行單倍體培育，加倍后得到系列DH株系； (3) 從系列所述DH株系中選擇花藥為黃色的株系，即為所述辣椒材料DH121。9. 與辣椒"花藥黃色"這一性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，為以辣椒基因組DNA為模板，采用權(quán)利 要求1所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的DNA片段。10. 權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)或權(quán)利要求4所述的試劑盒或權(quán)利要求9所述的分子標(biāo) 記在如下任一中的應(yīng)用： (1) 鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒是否具有"花藥黃色"這一性狀； (2) 辣椒育種。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105925725SQ201610556981
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年7月14日
【發(fā)明人】張曉芬, 耿三省, 陳斌, 杜和山
【申請(qǐng)人】北京市農(nóng)林科學(xué)院