用于鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)、引物、試劑盒及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)、引物、試劑盒及應(yīng)用。所述的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)是桃基因組第3染色體的第3473250位核苷酸，該核苷酸為T或G。本發(fā)明以桃基因組第3染色體的第3473250bp作為核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，能夠用于鑒定或輔助鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀，在鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀時(shí)具有較高的準(zhǔn)確率。本發(fā)明對15個雜交群體共221份待測桃單株進(jìn)行SNPs準(zhǔn)確率的驗(yàn)證，結(jié)果表明，本發(fā)明在進(jìn)行雜交群體的表型性狀預(yù)測時(shí)，針對顯性表型準(zhǔn)確率較高，與最近報(bào)道的其他研究相比，從8.06％提升至61.29％。這說明，利用本發(fā)明的單核苷酸標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行檢測具有簡單、快速、成本低的優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)生產(chǎn)中大規(guī)模的應(yīng)用。
【專利說明】
用于鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀的單核昔酸多態(tài)性標(biāo)巧位點(diǎn)、 引物、試劑盒及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及用于鑒定桃果實(shí)表皮著色（紅）性狀的單核巧酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)、引 物、試劑盒及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 選擇是育種中最重要的環(huán)節(jié)之一，它是指在一個群體中選擇符合要求的基因型， 來進(jìn)行后續(xù)的培育。但在傳統(tǒng)育種中，由于很難獲知后代的基因型，因此選擇的依據(jù)通常是 表現(xiàn)型而非基因型，運(yùn)種選擇方法對質(zhì)量性狀而言一般是有效的，但對數(shù)量性狀來說，因?yàn)?其表現(xiàn)型與基因型之間缺乏明確的對應(yīng)關(guān)系，因而效率不高。此外，對于W果實(shí)性狀為目標(biāo) 的果樹來說，運(yùn)些性狀都有其特定的表現(xiàn)時(shí)期，通常需要度過3-5年甚至更長時(shí)間的童期， 因而選擇的時(shí)間較晚。運(yùn)對于那些植株高大、占地多、生長季長的作物，特別是果樹之類的 園藝作物，顯然是非常不利的。
[000引近20年來迅速發(fā)展起來的基于DNA的分子標(biāo)記技術(shù)，即"分子標(biāo)記輔助選擇" (marker-assisted selection,縮寫為MAS)給育種提供了嶄新的途徑。它通過分析與目的 基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的基因型來進(jìn)行育種，從而達(dá)到提高育種效率的目的。Yamamoto (2001)利用AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism,擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）、 RAPD(random amplified polymo;rphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)、SSR(Simple Sequence R邱eats,簡單重復(fù)序列）和RFLP(Res1:;riction Rra卵ent Length Polymor曲ism,限制性內(nèi) 切酶片段長度多態(tài)性)標(biāo)記，將果皮顏色定位第6連鎖群，與之連鎖距離最近(3.7cM)的SSR 標(biāo)記為UDP96-015。由于進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇有兩個重要的前提，首先是必須得到與目標(biāo) 性狀緊密連鎖的標(biāo)記，即建立目標(biāo)基因與分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系。其次是檢測的自動化，由于 分子標(biāo)記輔助選擇要求對育種群體進(jìn)行大規(guī)模檢測，因而要求檢測的方法要簡單、快速、成 本低、比較準(zhǔn)確，W實(shí)現(xiàn)檢測過程(包括DNA的提取、分子標(biāo)記的檢測、數(shù)據(jù)分析等）的自動 化。但是，可W發(fā)現(xiàn)在過去很長一段時(shí)間內(nèi)采用的分子標(biāo)記，如RFLPUestriction Fragment Length Polymorphism,限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性）、RAPD(random amplified polymor曲ic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)、A化P和SSR等通常需要酶切或PCR后用 電泳檢測分型結(jié)果，很難實(shí)現(xiàn)運(yùn)一點(diǎn)。
[0004] SNPs標(biāo)記（single nucleotide polymo;rphisms，單核巧酸多態(tài)性）主要是指在基 因組水平上由單個核巧酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它在基因組上分布廣泛，數(shù)量眾 多，因此很容易檢測到相對于R化？、34?0、4。1^\55財(cái)示記更連鎖的標(biāo)記，且在檢測時(shí)具有高 通量、簡單、快速、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，是進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種中最具潛力的標(biāo)記。近年來， 化ett等人(2014)利用SNPs忍片構(gòu)建了包含1335個SNPs的連鎖圖譜，在第3染色體鑒定到紅 皮性狀的主效0化（8111311.?9.2〇3.1)，最連鎖的標(biāo)記為5腫_164_341962((：^3: 12836182bp)。化an等人(2015)通過對桃果皮花色素合成關(guān)鍵基因化MYBlO測序，發(fā)現(xiàn)其等 位基因間存在3個SNP，通過比較運(yùn)3個SNPs的分型，發(fā)現(xiàn)化r3(第3染色體）：12877863bp在預(yù) 測果皮顏色時(shí)具有較高的準(zhǔn)確率。
[0005] 然而，現(xiàn)有的與桃果實(shí)表皮著色性狀連鎖的SS財(cái)示記距離目標(biāo)基因定位距離較遠(yuǎn)， 在雜交后代的早期鑒定中準(zhǔn)確率較低;而現(xiàn)有的與目標(biāo)性狀連鎖的SNPs標(biāo)記多來自忍片鑒 定的結(jié)果，由于忍片位點(diǎn)較少（少于9000個），因此不能保證鑒定出的SNPs是與目標(biāo)性狀最 關(guān)聯(lián)或連鎖的位點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供用于鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀的單核巧 酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)、引物、試劑盒及應(yīng)用，該標(biāo)記位點(diǎn)在鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀時(shí)具有較 高的準(zhǔn)確率。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0008] 用于鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀的單核巧酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，所述的單核巧酸多態(tài) 性標(biāo)記位點(diǎn)是桃基因組第3染色體的第3473250位核巧酸，該核巧酸為T或G。
[0009] 用于鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀的PCR擴(kuò)增引物對，所述引物對中的上游引物是根 據(jù)桃基因組第3染色體的第3473250位核巧酸及其上游序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，所述引物對中的下游 引物是根據(jù)第3染色體的第3473250位核巧酸的下游序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。
[0010] 所述引物對由如沈Q ID NO.2和沈Q ID NO.3所示的兩條單鏈DNA分子組成。
[0011] 用于鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀的單堿基延伸引物，所述單堿基延伸引物為如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和沈Q ID NO.6所示的核巧酸序列。
[0012] 用于鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀的試劑盒，所述的試劑盒包括所述的PCR擴(kuò)增引物 對和所述的單堿基延伸引物。
[0013] 桃基因組第3染色體的第3473250位核巧酸的單核巧酸多態(tài)性在鑒定或輔助鑒定 桃果實(shí)表皮著色性狀中的應(yīng)用。
[0014] -種單核巧酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)在桃果實(shí)表皮著色性狀分子標(biāo)記輔助選擇育種方 面的應(yīng)用。
[0015] 所述的單核巧酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)在鑒定或輔助鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀中的應(yīng) 用。
[0016] -種試劑盒在桃果實(shí)表皮著色性狀分子標(biāo)記輔助選擇育種方面的應(yīng)用。
[0017] -種利用單核巧酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀的方法，包括W下步 驟：
[001引（I)PCR擴(kuò)增：W待測桃的基因組DNA為模板，用PCR擴(kuò)增引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0019] (2)SAP反應(yīng):配制SAP反應(yīng)體系，加入步驟（1 )PCR擴(kuò)增反應(yīng)后的反應(yīng)體系中，除去 PCR擴(kuò)增反應(yīng)中未反應(yīng)的dNTP;
[0020] (3)單堿基延伸反應(yīng):配制單堿基延伸反應(yīng)體系，加入步驟(2)SAP反應(yīng)后的反應(yīng)體 系中；
[0021 ] (4)基因分型：將完成單堿基延伸反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行樹脂脫鹽處理，點(diǎn)在忍片上，由 忍片掃描儀掃描，檢測分析，根據(jù)不同產(chǎn)物的分子量大小進(jìn)行基因分型。
[0022]本發(fā)明篩選得到桃基因組第3染色體的第3473250位核巧酸位核巧酸多態(tài)性標(biāo)記 位點(diǎn)，能夠用于鑒定或輔助鑒定桃果實(shí)表皮著色(紅)性狀，在鑒定桃果實(shí)表皮著色(紅)性 狀時(shí)具有較高的準(zhǔn)確率。
[0023] 本發(fā)明針對桃基因組第3染色體的第3473250位核巧酸多態(tài)性的特性，設(shè)計(jì)了特定 的PCR引物擴(kuò)增對和單堿基延伸引物，將完成單堿基延伸反應(yīng)的的產(chǎn)物進(jìn)行樹脂脫鹽處理， 點(diǎn)在忍片上，由忍片掃描儀掃描，進(jìn)行MLDI-TOF質(zhì)譜檢測，Typer4.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，根 據(jù)不同產(chǎn)物的分子量大小獲得其基因分型結(jié)果。
[0024] 本發(fā)明對15個雜交群體共221份待測桃單株進(jìn)行SNPs準(zhǔn)確率的驗(yàn)證，結(jié)果表明，本 發(fā)明對顯性表型(果皮50% W下著紅色）中具有較高的準(zhǔn)確率，可達(dá)61% W上。運(yùn)說明，利用 本發(fā)明的單核巧酸標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行檢測具有簡單、快速、成本低的優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)生產(chǎn)中大規(guī) 模的應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0025] W下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0026] 實(shí)施例1 SNPs標(biāo)記位點(diǎn)的獲得
[0027] 本發(fā)明W從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所桃種質(zhì)資源圃隨機(jī)獲得的129份桃種 質(zhì)為樣品，采用常規(guī)CTAB法提取樣品DNA，并通過Illumina HiSeq 2000測序儀對129份桃種 質(zhì)進(jìn)行重測序，得到121加數(shù)據(jù)，平均覆蓋桃基因組89.28%，平均測序深度為4.21 X左右。 根據(jù)測序得到的50-150bp的reads，與桃參考基因組V. 1. (Khttp : //ww.rosaceae . org/ node/355)進(jìn)行比對，鑒定出4063377個SNPs，利用運(yùn)些SNPs對129份種質(zhì)的表型性狀進(jìn)行全 基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定出與桃果皮著色的有顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位于第3染色體的第347325化P 處。
[0028] 實(shí)施例2利用SNP標(biāo)記鑒定桃果實(shí)表皮著色(紅)性狀的方法 [00巧]UDNA提取
[0030] 采用常規(guī)CTAB法提取待測桃樣品組織的DNA，去除RNA，DNA樣品總體積不低于15ii 1。用紫外光光度計(jì)測定DNA樣品在26化m、280皿處的OD值，計(jì)算DNA含量和OD260/28日的比值。 DNA樣品純度0〇26日/28日值應(yīng)在1.8-2.0之間，濃度稀釋至1 Ong/山。
[0031] 2、設(shè)計(jì)引物
[0032] 根據(jù)桃基因組第3染色體的第3473250位處左右各20化P序列（具體的核巧酸序列 見表1)，設(shè)計(jì)引物。
[0033] 表1SNPs旁側(cè)序列信息 「m：Ml
[0035] 其中，K表示T或G。
[0036] 引物由生物技術(shù)公司合成后，稀釋PCR擴(kuò)增上下游引物至終濃度均為0.5咖。稀釋 單堿基延伸引物至延伸引物1、2、3終濃度分別為祉M、10咖、15咖，備用。引物序列見表2。
[0037] 表2引物序列 [mwl
[0039] 3、PCR反應(yīng)體系及Mass ARRAY分析
[0040] 按照SEQUEN0M-巧LEX標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行PCR、SAP、單堿基延伸反應(yīng)，主要步驟如 下：
[0041 ] (I)PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0042] 首先，配制PCR擴(kuò)增體系，具體見表3。
[0043] 表3Sequenom MassArray系統(tǒng)基因分型擴(kuò)增PCR反應(yīng)組分
[0044]
[0045] 其中，Primer Mix為PCR擴(kuò)增上游引物和下游引物各加入0.化1。
[0046] 將上述試劑轉(zhuǎn)移到PCR管或板中，
[0047] PCR擴(kuò)增程序如下：94°C 15min; 94°C 20s，56 °C30s，72°C Imin，共45個循環(huán)；72°C 3min;4°C 保存。
[004引配置1%瓊脂糖凝膠，對PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，如果條帶明亮且單一，則進(jìn)行 后續(xù)試驗(yàn)。
[0049] (2)SAP(郵堿性憐酸酶)反應(yīng)
[0050] 利用該反應(yīng)除去未用盡的dNTP，首先配制反應(yīng)體系，見表4:
[0051] 表4SAP酶促反應(yīng)相關(guān)試劑配制組分
[0化2]
[0053] 將配好的上述溶液化1加入到完成PCR反應(yīng)的PCR管或板中。按如下程序進(jìn)行SAP反 應(yīng)。
[0054] SAP 反應(yīng)程序：37 °C 40min; 85 °C 5min; 4°C 保存。
[0055] (3)單堿基延伸反應(yīng)
[0056] 首先配制單堿基延伸反應(yīng)體系，見表5:
[0057] 表5延伸反應(yīng)相關(guān)試劑組分
[0化引
[0059] 其中，iPLEX Extend Primer Mix為單堿基延伸引物1、2、3的混合引物，引物1、2、3 的加入濃度分別為祉M、1 OiiM、15咖，單堿基延伸引物1、2、3的加入量相同，共0.9化1。
[0060] 然后將配好的溶液化1加入到SAP反應(yīng)后的PCR管或板中，進(jìn)行延伸反應(yīng)，程序如 下：94°C 30s; 94°C 5s，（ 52 °C 5s，80 °C 5s，5個循環(huán)），共40個循環(huán)；72 °C 3min; 4°C保存。
[0061 ]將完成延伸反應(yīng)的的產(chǎn)物進(jìn)行樹脂脫鹽處理，點(diǎn)在忍片上，由忍片掃描儀掃描，進(jìn) 行MALDI-TOF質(zhì)譜檢測，Typer4.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)不同產(chǎn)物的分子量大小獲得其基 因分型結(jié)果。當(dāng)完成延伸反應(yīng)的產(chǎn)物分子量為6021左右時(shí)，Chr3:3，473，250bp處為純合位 點(diǎn)，分型為G/G，對應(yīng)種質(zhì)的表型為50% W上果皮著紅色。分子量為6060.9左右時(shí)，Chr3:3， 473，250bp處為純合位點(diǎn)，分型為T/T;分子量約為6040.卵寸，C虹3:3，473，250bp處為雜合位 點(diǎn)，分型為G/T; T/T和G/T運(yùn)兩種分型對應(yīng)的種質(zhì)表型為果皮50 % W下著紅色。
[0062] 實(shí)施例3 15個雜交群體利用果皮著色關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記進(jìn)行表型性狀的盲測驗(yàn)證
[0063] 1、實(shí)驗(yàn)材料的選擇
[0064] W鄭州果樹研究所資源圃中種植的常規(guī)桃品種為實(shí)驗(yàn)材料，從中選取調(diào)查過表型 性狀的15個雜交群體共221份單株，具體見表6。
[0065] 表6供試雜交群體的名稱及群體大小信息
[0066]
[0067]
[0068] 2、利用果皮著色關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記的鑒定方法
[0069] W本發(fā)明桃基因組第3染色體的第3473250位作為核巧酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，對15個 雜交群體共221份桃單株果皮著色進(jìn)行盲測鑒定，具體的鑒定方法參照實(shí)施例2的方法。同 時(shí)，W現(xiàn)有的國外報(bào)道的桃基因SNPs位點(diǎn)作為對照，與本發(fā)明的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行比較分析。
[0070] 3、雜交群體中分型結(jié)果對表型的預(yù)測能力比較
[0071] 從鑒定結(jié)果可W看出，與目前國外報(bào)道的利用約9千個SNPs進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析得到的 最連鎖SNPs(化r3:1283618化P)和現(xiàn)有對果皮著色性狀的候選基因測序鑒定到的1個SNPs (化r3:12877863bp)相比，本發(fā)明SNPs位點(diǎn)的卡方測驗(yàn)P值最低，即顯著性最高(表7)。
[0072] 主V不巧巧出圭:件斗去走幽。~TD。九1 [乂V化丸井1|么主巧7^上七、、,而ITTA
[0073]
[0074]
[0075] 綜合比較，其準(zhǔn)確率如表8所示，可W看出本發(fā)明在進(jìn)行雜交群體的表型性狀預(yù)測 時(shí)，針對顯性表型準(zhǔn)確率較高，與最近報(bào)道的其他研究相比，從8.06%提升至61.29%。
[0076] 表8本發(fā)明設(shè)及的SNPs在對15個雜交群體鑒定后的表型預(yù)測能力(準(zhǔn)確率)比較
[0078] 綜上所述，本發(fā)明的SNPs位點(diǎn)能夠幫助實(shí)現(xiàn)利用桃幼苗DNA早期預(yù)測桃成齡后果 皮著色性狀的目的，該方法是利用重測序得到的400萬W上SNPs中全基因組關(guān)聯(lián)分析得到 最關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)從而實(shí)現(xiàn)的，由于原始SNPs數(shù)量龐大，從而保證了得到的關(guān)聯(lián)標(biāo)記關(guān)聯(lián)性高。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，其特征在于，所述的單 核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)是桃基因組第3染色體的第3473250位核苷酸，該核苷酸為T或G。2. 用于鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀的PCR擴(kuò)增引物對，其特征在于，所述引物對中的上游 引物是根據(jù)桃基因組第3染色體的第3473250位核苷酸及其上游序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，所述引物對 中的下游引物是根據(jù)第3染色體的第3473250位核苷酸的下游序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀的PCR擴(kuò)增引物對，其特征在 于，所述引物對由如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的兩條單鏈DNA分子組成。4. 用于鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀的單堿基延伸引物，其特征在于，所述單堿基延伸引 物為如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。5. 用于鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括權(quán)利要求2 或3所述的PCR擴(kuò)增引物對和權(quán)利要求4所述的單堿基延伸引物。6. 桃基因組第3染色體的第3473250位核苷酸的單核苷酸多態(tài)性在鑒定或輔助鑒定桃 果實(shí)表皮著色性狀中的應(yīng)用。7. -種權(quán)利要求1所述的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)在桃果實(shí)表皮著色性狀分子標(biāo)記輔 助選擇育種方面的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)在桃果實(shí)表皮著色性狀分子標(biāo)記輔 助選擇育種方面的應(yīng)用，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)在鑒定或輔助鑒定 桃果實(shí)表皮著色性狀中的應(yīng)用。9. 一種權(quán)利要求5所述的試劑盒在桃果實(shí)表皮著色性狀分子標(biāo)記輔助選擇育種方面的 應(yīng)用。10. -種利用權(quán)利要求1所述的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)鑒定桃果實(shí)表皮著色性狀的 方法，其特征在于，包括以下步驟： (I )PCR擴(kuò)增：以待測桃的基因組DNA為模板，用PCR擴(kuò)增引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物； (2) SAP反應(yīng):配制SAP反應(yīng)體系，加入步驟(I )PCR擴(kuò)增反應(yīng)后的反應(yīng)體系中； (3) 單堿基延伸反應(yīng)：配制單堿基延伸反應(yīng)體系，加入步驟（2)SAP反應(yīng)后的反應(yīng)體系 中； (4) 基因分型：將完成單堿基延伸反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行樹脂脫鹽處理，點(diǎn)在芯片上，由芯片 掃描儀掃描，檢測分析，根據(jù)不同產(chǎn)物的分子量大小進(jìn)行基因分型。
【文檔編號】C12Q1/68GK105925721SQ201610536612
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月9日
【發(fā)明人】曹珂, 王力榮, 朱更瑞, 方偉超, 陳昌文, 王新衛(wèi), 王琪
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所