從生物流體中分離微小rna的制作方法
【專利摘要】本公開提供用于從生物流體中分離miRNA的方法和試劑盒。具體地說，所述方法包括使生物流體與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸，其中所述表面活性劑使生物流體組分解離并且所述抗miRNA結(jié)合蛋白試劑與和miRNA締合的miRNA結(jié)合蛋白相互作用從而形成免疫沉淀miRNA復(fù)合物；并且將miRNA從所述免疫沉淀miRNA復(fù)合物中釋放。進一步提供可與循環(huán)miRNA締合的miRNA結(jié)合蛋白的實例。
【專利說明】
從生物流體中分離微小RNA
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本公開設(shè)及從生物流體中分離微小RNA的方法。
[000^ 背景
[0003] 微小RNA(miRNA)是小的非編碼RNA，其通過經(jīng)由特定堿基配對相互作用來對特定 信使RNA(mRNA)祀標進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控而影響基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNA已被證明W無細胞形式存 在于人生物液體中。運些無細胞miRNA可為非囊泡的、由miRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物中的蛋白質(zhì)來 結(jié)合并保護、封閉于膜結(jié)合囊泡諸如外來體或微泡中，或兩種情況同時存在。鑒于miRNA在 疾病中的重要功能作用，此組核酸分子含有候選物，所述候選物用于診斷和預(yù)后疾病，并且 在各種患者和表現(xiàn)疾病之前的受試者中，在易于得到的生物樣品，諸如血清和血漿、尿液或 唾液中監(jiān)測對于治療的響應(yīng)。當前分離m i R N A的方法針對細胞和組織中的相對豐富的 miRNA,使用不容易自動化或擴大規(guī)模的吸附柱，較復(fù)雜并且設(shè)及毒性化合物，或可能特定 地分離囊泡或非囊泡miRNA。此外，在診斷或預(yù)后方面受到關(guān)注的miRNA經(jīng)常W低豐度存在 于生物流體中，使得使用當前分離方法來對其進行檢測具有挑戰(zhàn)性。因此，需要用于分離生 物流體中的全部或大部分miRNA的簡單、有效、可自動化和可規(guī)模化的方法。
[0004] 發(fā)明概述
[0005] 本公開的一個方面提供從生物流體中分離微小RNA(miRNA)的方法。所述方法包括 使生物流體與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸，其中表面活化劑使生物流體組分 解離并且抗miRNA結(jié)合蛋白試劑與和miRNA締合的miRNA結(jié)合蛋白相互作用從而形成免疫沉 淀miRNA復(fù)合物。所述方法還包括將miRNA從免疫沉淀miRNA復(fù)合物中釋放。
[0006] 本公開的另一個方面包涵用于從生物流體中分離微小RNA的試劑盒。試劑盒包括 表面活性劑、抗miRNA結(jié)合蛋白試劑和miRNA釋放試劑。
[0007] 本公開的其它方面和重復(fù)在W下更詳細描述。
[000引附圖簡述
[0009] 圖1提供將使用化iReagent'K加或RNA免疫沉淀反應(yīng)(RIP)從0.2ml血漿分離miRNA 進行比較的兩個圖表。通過RIP分離的miRNA的量表示為使用Tri反eagenr抓分離的miRNA 的倍數(shù)差異。（A)描繪let-7a-5p、23a-3p和191-5P miRNA的水平，并且（B)示出142-3P和 451a miRNA的水平。
[0010]圖2提供展示使用Ago-RIP或Qiagen柱純化試劑盒(Ql，Q2)從血漿分離的miRNA的 水平的S個圖表。展示let-7a、23a和 142miRNA(A)、191miRNA(B)和451a miRNA(C)的W洗脫 miR拷貝數(shù)AU為單位的分離miRNA的量。
[0011] 圖3提供展示使用利用生物素化(b-Ago2或b-Ago)或非生物素化(Ago2)抗體與鏈 霉抗生物素蛋白或蛋白質(zhì)A珠粒進行的RIP從血漿分離的miRNA的水平的=個圖表。展示了 let-7a(A)、23a(B)和191(C)miRNA的W洗脫miR拷貝數(shù)/山為單位來表示的分離miRNA的量。 所使用的抗體(圓括號中的克隆)在X軸上表示。
[0012] 圖4提供展示使用伴W放熱的Ago-RIP從血漿分離的miRNA的水平的兩個圖表。Q代 表Qiagen柱純化;RIP-Q代表免疫沉淀反應(yīng)隨后Qiagen柱純化;bRIP-Q代表使用生物素化抗 體的免疫沉淀反應(yīng)隨后Qiagen柱純化。（A)描繪使用Qiagen柱純化、與柱純化組合的RIP和 伴W蛋白水解酶K釋放的RIP的合成cel-miR-39-3p跟蹤標定物的水平。跟蹤標定物的水平 表示為在分離期間跟蹤標定的合成cel-miR-39-3p的總百分比。（B)描繪使用Qiagen柱純 化、與柱純化組合的RIP和具有蛋白水解酶K釋放的RIP的從血漿分離的Ie巧a miRNA的水 平。let7a的水平W化1回收樣品中的let7a的拷貝數(shù)來表示。
[0013] 圖5提供展示使用在不同溫度下伴W蛋白水解酶K釋放的Ago-RIP從血漿分離的 miRNA的水平的兩個圖表。（A)描繪由蛋白水解酶K釋放的let7a miRNA的水平(在每個溫度 下的左側(cè)棒），和保持于珠粒上的水平(在每個溫度下的右側(cè)棒Kle巧a miRNA的水平表示 為在使用Qiagen的miRNeasy血清/血漿試劑盒來分離的0.2ml相同血漿中的Ie巧a miRNA的 總百分比。（B)描繪由蛋白水解酶K釋放的miR451a miRNA的水平(在每個溫度下的左側(cè)棒）， 和保持在珠粒上的水平（每個溫度下的右側(cè)棒）nmiR451a miRNA的水平表示為在使用 Qiagen的miRNeasy血清/血漿試劑盒來分離的0.2ml相同血漿中的miR451a miRNA的總百分 比。
[0014] 圖6提供展示使用可購得的miRNA分離方法，或使用在標準試管中伴W蛋白水解酶 K釋放的RIP的分離從血漿中分離的Ie巧a(A)或miR451a(B)miRNA的水平的兩個圖表。El和 E2代表使用來自Exiqon的miR化巧RNA分離試劑盒-生物流體的miRNA分離。Ql和Q2代表使 用來自Qiagen的miRNeasy血清/血漿試劑盒的miRNA分離。RIP-Std-Q代表免疫沉淀反應(yīng)隨 后Qiagen柱純化。miRNA的水平表示為從0.2ml血漿回收的總拷貝數(shù)。
[0015] 圖7提供展示使用可購得的miRNA分離方法，或使用伴W蛋白水解酶K釋放的Ago- RIP的分離(RIP1-4)從血漿中分離的Ie巧a miRNA的水平的兩個圖表。（A)示出試驗1并且 (B)示出試驗2dE1和E2代表使用來自Exiqon的miRCury RNA分離試劑盒-生物流體的miRNA 分離。Ql和Q2代表使用來自Qiagen的miRNeasy血清/血漿試劑盒的miRNA分離。let7a的水平 表示為從0.2ml血漿回收的let7a的總拷貝數(shù)。
[0016] 圖8提供展示在存在或不存在蛋白水解酶和RNA酶抑制劑的情況下，W及在存在或 不存在清潔劑預(yù)處理的情況下，使用Ago-RIP隨后蛋白水解酶K釋放從血漿中分離的miRNA 的水平的兩個圖表。+pre，+inh;將Igepa巧日抑制劑添加至血漿并且解育~30分鐘，然后添 加至Ago2-珠粒。+pre，-inh;在沒有抑制劑的情況下將Igepal添加至血漿并且解育~30分 鐘，然后添加至Ago2-珠粒。-pre，+inh; Igepal和抑制劑與Ago2-珠粒同時添加至血漿。- pre，-inh; Igepal在沒有抑制劑的情況下與Ago2-珠粒同時添加至血漿。（A)描繪回收的 let7a miRNA的拷貝數(shù)，并且(B)描繪回收的miR451a miRNA的拷貝數(shù)。
[0017]圖9提供展示作為總IGEPAL處理miRNA的百分比的自由（每個miRNA的左側(cè)棒)和囊 泡(每個miRNA的右側(cè)棒)指示miRNA的水平的圖表。
[0018] 圖10提供展示使用Ago-RIP隨后蛋白水解酶K釋放(RIP)從0.2或0.4ml血漿中，或 使用來自Exiqon的miR化ry RNA分離試劑盒-生物流體巧)從0.2ml血漿中分離的miRNA的水 平的S個圖表。（A)描繪回收的let7a miRNA的拷貝數(shù)，（B)描繪回收的miR191miRNA的拷貝 數(shù)，并且(C)描繪回收的miR451a miRNA的拷貝數(shù)。
[0019] 圖11提供展示使用Ago-RIP隨后蛋白水解酶K釋放從血漿中分離的let7a的水平的 圖表。RIP解育是在室溫下歷時5、15、30或60分鐘（5'、15'、30'、60'）。5、15或30分鐘的那些 解育全部在蛋白酶K釋放之前洗涂5次。60分鐘的那些解育洗涂5、4、3、2或1次(5w、4w、3w、 2w、lw)。展示從0.2ml血漿中回收的Ie巧a的總產(chǎn)率。
[0020] 圖12A示出使用AgO-RIP或柱基miRNA分離試劑盒從血漿中分離的Ie巧a miRNA的 水平。提供S個不同實驗化XP)。51和S2代表使用Ago-RIP的分離；El和E2代表使用來自 Exiqon的miRCury RNA分離試劑盒-生物流體的分離；并且Ql和Q2代表使用來自Qiagen的 miRNeasy血清/血漿試劑盒的分離。
[0021] 圖提供使用Ago-RIP或柱基miRNA分離試劑盒從血漿中分離的RNU6小核RNA和 SN0RD48小核仁RNA的水平。提供S個不同實驗。Sl和S2代表使用Ago-RIP的分離;El和E2代 表使用來自Exiqon的miRCury RNA分離試劑盒-生物流體的分離;并且Ql和Q2代表使用來自 Qiagen的miRNeasy血清/血漿試劑盒的分離。
[0022] 圖12C示出使用Ago-RIP或柱基miRNA分離試劑盒從血漿中分離的GAPDH信使RNA、 RNl 8S核糖體RNA和RN28S核糖體RNA的水平。提供S個不同實驗。S巧日S2代表使用Ago-RIP的 分離;El和E2代表使用來自Exiqon的miR化ry RNA分離試劑盒-生物流體的分離;并且Ql和 Q2代表使用來自Qiagen的miRNeasy血清/血漿試劑盒的分離。
[0023] 圖13提供展示經(jīng)由Ago-RIP使用抗Agol抗體、抗Ago2抗體或抗Agol和抗Ago2抗體 的組合從血漿中分離的指定miRNA的水平的圖表。
[0024] 發(fā)明詳述
[0025] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)分離循環(huán)miRNA的有效和快速的方法。如實例中示出，本公開的方法可同 時分離囊泡締合和非囊泡締合的循環(huán)miRNA。有利地，本公開的方法和試劑盒允許快速和特 定地分離純miRNA制劑而沒有其它類型RNA的污染。另外，本文公開的方法和試劑盒允許W 高產(chǎn)率從稀的細胞外流體中分離miRNA。此外，本發(fā)明的方法可規(guī)?；试S從增加體積的 細胞外生物流體中分離miRNA。
[0026] miRNA的水平與疾病相關(guān)聯(lián)，包括癌癥、屯、血管疾病，W及在許多其它疾病和發(fā)育 過程中，包括精神分裂癥、阿耳茨海默氏病、免疫細胞發(fā)育和適應(yīng)性和先天性免疫的調(diào)節(jié)、 干細胞維持和多能性、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、內(nèi)分泌病包括糖尿病、膜腺的發(fā)育、脆折X綜合征、皮 膚傷口愈合、細胞周期進程、移植組織排斥、缺氧、骨骼肌分化。另外，miRNA還由病毒表達， 并且已經(jīng)識別出那些miRNA的目標基因。因此，本公開的方法和試劑盒可用于使用易于得到 的生物樣品，諸如血液、血清或血漿來制備miRNAW便用于診斷疾病或疾病狀況的測定。 [0027] I.方法
[00%]本公開涵蓋從生物流體中分離微小RNA(miRNA)的方法。所述方法包括使生物流體 與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸。表面活性劑使生物流體組分解離并且抗miRNA 結(jié)合蛋白試劑與和mi RNA締合的mi RNA結(jié)合蛋白相互作用從而形成免疫扣紅mi RNA夏合物。 所述方法還包括將miRNA從免疫沉淀miRNA復(fù)合物中釋放。
[0029] 本文公開方法特定地分離miRNA。如W下實施例12中詳述，其它類型的小RNA(諸如 小核RNA或小核仁RNA)不通過所公開方法來分離，并且較大RNA分子(諸如信使RNA或核糖體 RNA)不通過所公開方法來分離。
[0030] (a)生物流體
[0031] 本公開的方法包括在從受試者獲得的生物流體樣品中分離細胞外循環(huán)miRNA。如 本文所使用的術(shù)語"受試者"是指人或動物。受試者可為胚胎、幼年或成體。受試者可為雄性 或雌性。合適的動物包括脊椎動物諸如哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物和魚類。適合哺 乳動物的實例可包括但不限于曬齒動物、伴侶動物、家畜和靈長類動物。曬齒動物的非限制 實例包括小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠和豚鼠。合適的伴侶動物包括但不限于貓、犬、兔、刺獵和雪 貂。家畜的非限制實例包括馬、山羊、綿羊、豬、牛、駱駝和羊駝。合適靈長類動物包括但不限 于卷尾猴、黑猩猩、狐猴、雜猴、絨猴、絹毛猴、蜘蛛猴、松鼠猴W及黑長尾猴。鳥類的非限制 實例包括雞、火雞、鴨和碟。示例性受試者是人。
[0032] 術(shù)語"生物流體"可意指從任何給定受試者分離的所有生物流體和排泄物。生物流 體的非限制實例可包括血液和其部分、血清、血漿、尿液、排泄物、精液（semen)、精液 (seminal fluid)、精液漿、前列腺液、射精前的分泌物(考巧液）、胸膜腔積液、眼淚、唾液、 疲、汗、活檢、腹水、腦脊液、羊水、淋己、骨髓、宮頸分泌物、陰道分泌物、子宮內(nèi)膜分泌物、胃 腸分泌物、支氣管分泌物、乳腺分泌物、卵巢囊腫分泌物、組織流體、腫瘤吸出物和組織流體 樣品。在一些實施方案中，生物流體是血清。在其它實施方案中，生物流體是血漿。
[0033] 從受試者獲得血漿或血清樣品的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。例如，在存在或不存 在導(dǎo)管的情況下，靜脈穿刺可用于收集血液樣品W便制備血清。從血液樣品制備血漿和血 清的方法在本領(lǐng)域中為已知的。通常，血液樣品足夠大W便供應(yīng)足夠量的血漿或血清W供 如W下進一步描述來處理。血漿或血清樣品可在收集樣品之后立即處理?；蛘撸獫{或血清 樣品可冷凍W便稍后處理。
[0034] 生物流體樣品可通過新近收集樣品而從受試者獲得?；蛘?，生物流體樣品可從W 前收集并存儲的樣品獲得。例如，在生物流體是血漿或血清時，樣品可從存儲并保存的血液 樣品的集合中獲得。在一些實施方案中，樣品通過新近收集樣品來獲得。在其它實施方案 中，樣品從W前收集并存儲的樣品獲得。
[0035] 在一些實施方案中，生物流體樣品未稀釋。在其它實施方案中，生物流體樣品在分 離miRNA之前稀釋。稀釋度可取決于若干因素包括但不限于miRNA、樣品中的生物流體的類 型、受試者、受試者的疾病狀況、用于測量miRNA的測定的類型，和在用于測量miRNA的測定 中使用的試劑。在一個實施方案中，生物流體樣品通過添加原始樣品體積的約1/2至原始樣 品體積的約50,000倍范圍內(nèi)的體積的稀釋劑來稀釋。稀釋劑可為不干擾miRNA分離或用于 后續(xù)處理步驟的其它方法的任何流體。合適稀釋劑的非限制實例包括脫離子水、蒸饋水、鹽 水溶液、林格氏溶液、憐酸緩沖鹽水溶液、TRIS緩沖鹽水溶液、標準鹽水巧樣酸和肥PES緩沖 鹽水。
[0036] (b)表面活性劑
[0037] 生物流體與表面活性劑（或者被稱為"表面活化劑"或"清潔劑"）接觸。如本文使 用，術(shù)語"表面活性劑"可用于描述能夠使可包括循環(huán)miRNA的生物流體組分解離的任何試 劑?？砂ㄑh(huán)miRNA的生物流體組分的非限制實例包括細胞外囊泡諸如脂蛋白、外來體、 微泡、核外顆粒體、調(diào)亡主體和其它細胞外囊泡。
[0038] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到，能夠使生物流體組分解離的任何表面活性劑可用于本 公開的方法中，只要表面活性劑不干擾本公開的免疫沉淀miRNA復(fù)合物的形成。例如，表面 活性劑可為陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑、非離子表面活性 劑或其組合。本發(fā)明的表面活性劑的特性可能并且將會變化，取決于生物流體中的可包括 循環(huán)m i RNA、抗m i RNA結(jié)合蛋白試劑和分離m i RNA的生物流體組分的特性。
[0039] 在一些實施方案中，表面活性劑是陰離子表面活性劑。合適陰離子表面活性劑包 括但不限于十二燒苯橫酸胺；辛醇聚酸硫酸錠;枯締橫酸錠;二徑硬脂酸錠;十二燒苯橫酸 錠；月桂醇聚酸硫酸錠；月桂醇聚酸-12硫酸錠；月桂醇聚酸-30硫酸錠；月桂基肌氨酸錠；月 桂基硫酸錠；月桂基橫基班巧酸錠;木質(zhì)素橫酸錠；肉豆違醇聚酸硫酸錠;糞橫酸錠;壬苯醇 酸-20硫酸錠；壬苯醇酸-30硫酸錠；壬苯醇酸-4硫酸錠；壬苯醇酸-6硫酸錠；壬苯醇酸-9硫 酸錠;油硫酸錠;全氣辛酸錠;硬醋酸錠;二甲苯橫酸錠;下基糞橫酸醋;下基憐酸醋;十二燒 苯橫酸巧;硬脂酷乳酸巧；四丙締基苯橫酸巧；辛醇聚酸-9簇酸;嫁蠟基憐酸醋;枯締橫酸； DEA-嫁蠟基憐酸醋;DEA-十二燒苯橫酸醋;DEA-月桂基硫酸醋;癸醇聚酸-4憐酸醋；月桂基 橫基班巧酸二錠;硬脂基橫基班巧酷胺酸二錠;橫基班巧酸二戊基鋼;橫基班巧酸雙環(huán)己基 鋼;橫基班巧酸二己基鋼;橫基班巧酸二異下基鋼;二月桂醇聚酸-7巧樣酸醋;聚二甲基娃 氧燒醇;二壬苯醇酸-4憐酸;橫基班巧酸二辛基錠;橫基班巧酸二辛基鋼;嫁蠟硬脂橫基班 巧酷胺酸二鋼;挪油酷胺基MEA-橫基班巧酸二鋼;挪油酷胺基PEG-3橫基班巧酸二鋼;癸醇 聚酸-6橫基班巧酸二鋼;癸基二苯酸二橫酸二鋼;十二烷氧基丙基橫基班巧酷胺酸二鋼;異 癸基橫基班巧酸二鋼;羊毛脂醇聚酸-5橫基班巧酸二鋼；月桂酷胺DEA-橫基班巧酸二鋼；月 桂酷胺MEA-橫基班巧酸二鋼；月桂醇聚酸橫基班巧酸二鋼；月桂基橫基班巧酸二鋼；肉豆違 酷胺MEA-橫基班巧酸二鋼；油酷胺基MEA-橫基班巧酸二鋼；油酷胺基PEG-2橫基班巧酸二 鋼；油醇聚酸-3橫基班巧酸二鋼;PEG-4挪油酷胺基MIPA橫基班巧酸二鋼；藍麻油酷胺基 MEA-橫基班巧酸二鋼;硬脂基橫基班巧酷胺酸二鋼;十一碳締酷胺基MEA-橫基班巧酸二鋼； 橫基班巧酸雙十=基鋼;十二碳締基班巧酸酢;十二烷基二苯酸二橫酸;十二烷基二苯酸二 橫酸;十二烷基苯橫酸;甘油基二油酸醋SE;甘油基二硬脂酸醋SE;甘油基藍麻酸醋SE;甘油 基硬脂酸巧樣酸醋;甘油基硬脂酸醋SE;硬脂酸乙二醇醋SE;憐酸己基醋;憐酸異丙基醋；異 丙胺十二烷基苯橫酸醋;異硬脂醇聚酸-2憐酸醋;異十=燒醇聚酸-3憐酸醋;異十=燒醇聚 酸-6憐酸醋；月桂醇聚酸-1憐酸醋；月桂醇聚酸-12簇酸；月桂醇聚酸-3憐酸醋；月桂醇聚 酸-4憐酸醋；月桂醇聚酸-6憐酸醋；月桂醇聚酸-7巧樣酸醋；月桂醇聚酸-9憐酸醋；月桂基 憐酸醋；月桂基硫酸裡；月桂醇聚酸硫酸儀;PEG-3挪油酷胺硫酸儀;MEA-月桂醇聚酸憐酸 醋;MEA-月桂基硫酸醋;MIPA-月桂醇聚酸硫酸醋;MIPA-月桂基硫酸醋；肉豆違酷基肌氨酸； 糞-甲醒橫酸醋；壬苯醇酸-10憐酸醋；壬苯醇酸-12憐酸醋；壬苯醇酸-3憐酸醋；壬苯醇酸-4 憐酸醋；壬苯醇酸-4硫酸醋；壬苯醇酸-6憐酸醋；壬苯醇酸-7憐酸醋；壬苯醇酸-如溝酸醋；壬 苯醇酸-9憐酸醋；壬基壬苯醇酸-10憐酸醋；壬基壬苯醇酸-15憐酸醋；壬基壬苯醇酸-7憐酸 醋；油醇聚酸-10簇酸；油醇聚酸-10憐酸醋；油醇聚酸-3簇酸；油醇聚酸-4憐酸醋；油醇聚 酸-5憐酸醋；油醇聚酸-6簇酸；油醇聚酸-7憐酸醋;PEG-2二月桂酸醋SE;PEG-2二油酸醋SE; PEG-2二硬脂酸醋沈;PEG-2月桂酸醋沈;PEG-2油酸醋沈;PEG-2硬脂酸醋沈;PEG-9硬脂酷胺 簇酸;嫁蠟基憐酸鐘;癸醇聚酸-4憐酸鐘;十二燒苯橫酸鐘;異硬脂醇聚酸-2憐酸鐘；月桂酷 肌氨酸鐘；月桂基硫酸鐘；油酸鐘；油硫酸鐘;全氣辛酸鐘；藍麻油硫酸鐘;PPG-2月桂酸醋 SE; PPG-2油酸醋SE; PPG-2硬脂酸醋SE; PPG-5-嫁蠟醇-10憐酸醋；丙二醇月桂酸醋SE;丙二 醇油酸醋SE;丙二醇藍麻酸醋SE;丙二醇硬脂酸醋SE; PVM/MA共聚物;2-乙基己基憐酸鋼;2- 乙基己基硫酸鋼;石蠟橫酸鋼;締丙氧基徑基丙基橫酸鋼；山齋酷乳酸鋼;下氧基乙氧基乙 酸鋼;下基糞橫酸鋼;油酸下醋硫酸鋼；油酸下醋橫酸鋼;下基憐酸鋼；己酷基乳酸鋼；辛酷 基橫酸鋼;嫁蠟基硫酸鋼;膽酸鋼;枯締橫酸鋼;癸醇聚酸硫酸鋼;癸基二苯酸橫酸鋼;癸基 硫酸鋼;脫氧膽酸鋼;二下基糞橫酸鋼;二十二烷基苯橫酸鋼;二異辛基橫基班巧酸鋼;二異 丙基糞橫酸鋼；二月桂醇聚酸-7巧樣酸鋼;二壬基橫基班巧酸鋼;十二烷基二苯酸二橫酸 鋼;十二烷基二苯酸二橫酸鋼;十二烷基苯橫酸鋼;甘油基=油酸醋硫酸鋼;十六基聯(lián)苯二 橫酸鋼;十六基二苯酸二橫酸鋼;己基二苯酸二橫酸鋼;異硫代硫酸鋼;異癸基硫酸鋼;異辛 基硫酸鋼;硬脂酷基乳酸鋼;異十S燒醇聚酸-15硫酸鋼;乳酸鋼；月桂酷胺DEA-橫基班巧酸 鋼；月桂醇聚酸憐酸鋼；月桂醇聚酸硫酸鋼；月桂醇聚酸橫基班巧酸鋼；月桂醇聚酸-10憐酸 鋼；月桂醇聚酸-11簇酸鋼；月桂醇聚酸-12硫酸鋼；月桂醇聚酸-13乙酸鋼；月桂醇聚酸-13 簇酸鋼；月桂醇聚酸-3簇酸鋼；月桂醇聚酸-4簇酸鋼；月桂醇聚酸-4憐酸鋼；月桂醇聚酸-6 簇酸鋼；月桂醇聚酸-7簇酸鋼；月桂醇聚酸-7硫酸鋼；月桂醇聚酸-8硫酸鋼；月桂酷谷氨酸 鋼；月桂酷乳酸鋼；月桂酷乳酸鋼；月桂酷甲基氨基丙酸鋼；月桂酷肌氨酸鋼；月桂基憐酸 鋼；月桂基硫酸鋼；月桂基橫基乙酸鋼;木質(zhì)素酸鋼;木質(zhì)素橫酸鋼；甲基締丙基橫酸鋼；甲 基月桂酷牛橫酸鋼；甲基肉豆違酷基牛橫酸鋼；甲基油酷基牛橫酸鋼；甲基棟桐酷牛橫酸 鋼；甲基硬脂酷牛橫酸鋼；甲基糞橫酸鋼;m-硝基苯橫酸鋼；肉豆違醇聚酸硫酸鋼；肉豆違酷 基谷氨酸鋼；肉豆違酷基肌氨酸鋼；肉豆違硫酸鋼;壬苯醇酸硫酸鋼；壬苯醇酸-10硫酸鋼； 壬苯醇酸-10橫基班巧酸鋼;壬苯醇酸-15硫酸鋼;壬苯醇酸-4硫酸鋼;壬苯醇酸-5硫酸鋼； 壬苯醇酸-6憐酸鋼;壬苯醇酸-6硫酸鋼;壬苯醇酸-8硫酸鋼;壬苯醇酸-9憐酸鋼;壬苯醇酸- 9硫酸鋼;辛苯聚醇-2乙燒橫酸鋼;辛苯聚醇-3硫酸鋼;辛基硫酸鋼;辛基苯氧基乙氧基乙基 橫酸鋼；油硫酸鋼；油醇聚酸-7憐酸鋼;油醇憐酸鋼；油醇硫酸鋼；油醇橫基班巧酷胺酸鋼； 棟桐酷肌氨酸鋼;苯基橫酸鋼;丙基油酸醋硫酸鋼;硬脂酷乳酸鋼;硬脂基橫基班巧酷胺酸 鋼;十=燒醇聚酸硫酸鋼;十=燒醇聚酸-3簇酸鋼;十=燒醇聚酸-6簇酸鋼;十=燒醇聚酸- 7簇酸鋼;十S烷基硫酸鋼;十S烷基苯橫酸鋼;二甲苯橫酸鋼;硬脂酷肌氨酸;TEA-月桂酷 谷氨酸醋;TEA-月桂基硫酸醋;二簇乙基硬脂基橫基班巧酷胺酸四鋼;TIPA-月桂醇聚酸硫 酸醋;=嫁蠟硬脂醇聚酸-4憐酸醋；=嫁蠟醇聚酸-5憐酸醋；十=燒醇聚酸-2憐酸醋；十= 燒醇聚酸-3憐酸醋；十S燒醇聚酸-5憐酸醋;十S烷基憐酸醋;和S月桂醇聚酸-4憐酸醋； 和憐酸S辛醋。
[0040] 在其它實施方案中，表面活性劑是陽離子表面活性劑。合適陽離子表面活性劑的 實例包括但不限于，烷基=甲基漠化錠;苯扎氯錠;苯扎氯錠;芐基二甲基十六烷基氯化錠； 芐基二甲基十四烷基氯化錠;芐基十二烷基二甲基漠化錠;芐基=甲基四氯艦酸錠;嫁蠟基 S甲基漠化錠(CTAB);二甲基二十八烷基漠化錠;十二烷基乙基二甲基漠化錠;十二烷基S 甲基漠化錠；十二烷基=甲基漠化錠；十二烷基=甲基氯化錠；乙基十六烷基二甲基漠化 錠；吉拉德試劑T;十六烷基=甲基漠化錠；十六烷基=甲基漠化錠；N，N'，N'-聚氧乙締 (IO)-N-牛脂-1,3-二氨基丙烷;通佐漠錠;和=甲基(十四基)漠化錠。
[0041] 在其它實施方案中，表面活性劑是兩性離子表面活性劑。合適兩性離子表面活性 劑包括但不限于3-[(3-膽酷胺丙基)二甲基錠基]-2-徑基-1-丙烷橫酸(CHAPS0);3-[(3-膽 酷胺丙基)二甲基錠基]-1-丙烷橫酸(CHAPS) ;3-(4-庚基)苯基-3-徑基丙基)二甲基錠基丙 燒橫酸(C7Bz0);3-(N，N-二甲基辛基錠基）丙烷橫酸內(nèi)鹽(SB3-8);3-(癸基二甲基錠基）丙 燒橫酸內(nèi)鹽（SB3-10;辛酷基橫基甜菜堿）；3-(十二烷基二甲基錠基）丙烷橫酸內(nèi)鹽（583- 12);3-(N，N-二甲基十四烷基錠基)丙烷橫酸(SB3-14);3-(N，N-二甲基棟桐基錠基)丙烷橫 酸（SB3-16);3-(N，N-二甲基十八烷基錠基）丙烷橫酸（SB3-18);3-[N，N-二甲基（3-肉豆違 酷基氨基丙基)錠基]丙烷橫酸(ASB-14)。取決于實施方案，其它合適兩性離子清潔劑包括： 乙酷化卵憐脂；杏酷胺丙基甜菜堿；己己蘇油酷胺丙基甜菜堿；山齋基甜菜堿;雙2-?乙基 牛脂甘氨酸;C12-14烷基二甲基甜菜堿;低芥酸菜子油酷胺丙基甜菜堿;辛酸/辛酷基酷胺 丙基甜菜堿;辛酷胺丙基甜菜堿;嫁蠟基甜菜堿;挪油酷胺丙基甜菜堿;挪油酷胺丙基二甲 基氨基徑基丙基水解膠原蛋白；N-[3-挪油酷胺基)-丙基]-N，N-二甲基甜菜堿，鐘鹽;挪油 酷胺丙基徑基橫基甜菜堿;挪油酷胺丙基橫基甜菜堿;挪油氨基下酸;挪油氨基丙酸;挪油 酷兩性基二丙酸;挪油甜菜堿;挪油基二甲基錠-3-橫丙基甜菜堿;挪油亞氨基二甘氨酸;挪 油亞氨基二丙酸;挪油/油酷胺基丙基甜菜堿;挪油酷基肌氨酷胺DEA; DEA-挪油酷兩性基二 丙酸;二徑乙基牛脂甘氨酸；聚二甲基硅氧烷丙基PG-甜菜堿;N，N-二甲基-N-月桂酸-酷胺 丙基-N-(3-橫丙基)-錠甜菜堿;N，N-二甲基-N-肉豆違基-N-(3-橫丙基)-錠甜菜堿;N，N-二 甲基-N-棟桐基-N-(3-橫丙基)-錠甜菜堿;N，N-二甲基-N-硬脂酷胺基丙基-N-(3-橫丙基)- 錠甜菜堿;N，N-二甲基-N-硬脂基-N-(3-橫丙基)-錠甜菜堿;N，N-二甲基-N-牛脂-N-(3-橫 丙基）-錠甜菜堿;癸酷兩性基二乙酸二鋼;癸酷兩性基二丙酸二鋼；辛酷兩性基二乙酸二 鋼；辛酷兩性基二丙酸二鋼;挪油兩性基二乙酸二鋼;挪油兩性基二丙酸二鋼;異硬脂兩性 基二丙酸二鋼；月桂醇聚酸-5簇基兩性基二乙酸二鋼；月桂亞氨基二丙酸二鋼；月桂酷兩性 基二乙酸二鋼；月桂酷兩性基二丙酸二鋼;辛基b-亞氨基二丙酸二鋼；油酷兩性基二乙酸二 鋼;油酷兩性基二丙酸二鋼;PPG-2-異癸醇聚酸-7簇基兩性基二乙酸二鋼;大豆油酷兩性基 二乙酸二鋼;硬脂酷兩性基二乙酸二鋼;妥爾油酷兩性基二丙酸二鋼;牛脂酷兩性基二乙酸 二鋼;牛脂酷亞氨基二丙酸二鋼;麥胚油酷兩性基二乙酸二鋼;N，N-二硬脂酷基-N-甲基-N- (3-橫丙基)-錠甜菜堿;芥酸酷胺丙基徑基橫基甜菜堿；乙基己基二丙酸；乙基徑甲基油醇 惡挫嘟；乙基PEG-15可可胺硫酸醋;氨化卵憐脂;水解蛋白質(zhì)；異硬脂酷胺丙基甜菜堿；月桂 酷胺丙基甜菜堿；月桂酷胺丙基二甲基甜菜堿；月桂酷胺丙酸；月桂兩性基二丙酸；月桂酷 賴氨酸；月桂基甜菜堿；月桂基徑基橫基甜菜堿；月桂基橫基甜菜堿;亞油酷胺丙基甜菜堿； 溶血卵憐脂;乳脂質(zhì)酷胺丙基甜菜堿；肉豆違酷胺丙基甜菜堿;辛基二丙酸；辛基亞氨基二 丙酸；油酷胺基丙基甜菜堿;油醇甜菜堿;4,4(5H)-惡挫二甲醇，2-(十屯締基)-;棟桐酷胺 丙基甜菜堿;棟桐胺氧化物;藍麻醇酸酷胺丙基甜菜堿;藍麻醇酸酷胺丙基甜菜堿/IPDI共 聚物;芝麻酷胺丙基甜菜堿;C12-15烷氧基丙基亞氨基二丙酸鋼;癸酷兩性基乙酸鋼;辛酷 兩性基乙酸鋼;辛酷兩性基徑丙基橫酸鋼；辛酷兩性基丙酸鋼;簇甲基牛脂聚丙胺鋼;挪油 基氨基丙酸鋼;挪油基兩性基乙酸鋼;挪油基兩性基徑丙基橫酸鋼;挪油基兩性基丙基鋼； 二簇乙基挪油基憐酸乙基咪挫嘟鋼;氨化牛脂二甲基甘氨酸鋼;異硬脂兩性基丙酸鋼；月桂 亞氨基二丙酸鋼；月桂酷兩性基乙酸鋼；油酷兩性基徑丙基橫酸鋼;油酷兩性基丙酸鋼;硬 脂兩性基乙酸鋼;妥爾油酷兩性基丙酸鋼;大豆油酷胺丙基甜菜堿;硬脂基甜菜堿;牛脂酷 胺基丙基徑基橫基甜菜堿；牛脂兩性基聚簇基丙酸；月桂酷兩性基PG-乙酸S鋼憐酸氯化 物;十一碳締酷胺丙基甜菜堿;和小麥胚茅油酷胺丙基甜菜堿。
[0042]在其它實施方案中，表面活性劑優(yōu)選地是非離子表面活性劑。合適非離子表面活 性劑的實例包括但不限于聚氧乙締（10)嫁蠟基酸(BRD?56);聚氧乙締（20)嫁蠟基酸（ 技民IJ敏58);聚氧乙締二醇十二烷基酸(B民U較35);聚氧乙締(9)p-t-辛基苯酪(N0NIDET? P-40);聚氧乙締（4-5)p-t-辛基苯酪（TRITON? X-45);聚氧乙締（7-8)p-t-辛基苯酪 (TRITON? X-114);聚氧乙締(9-10)p-t-辛基苯酪(TRITON? X-100);聚氧乙締(9-10)壬基 酪(TRITON? N-IOl);聚氧乙締(20)山梨糖醇單月桂酸醋(T驚EEN?20);聚氧乙締(20)山 梨糖醇單棟桐酸醋(TWEEN?40);聚氧乙締(20)山梨糖醇單油酸醋(TWEEN麼80);二 甲基癸基麟氧化物(APO-IO);二甲基十二基麟氧化物(APO-12);環(huán)己基-n-乙基-P-D-麥芽 糖巧；環(huán)己基-n-己基-P-D-麥芽糖巧;環(huán)己基-n-甲基-0-麥芽糖巧;n-癸酷基薦糖;n-癸基- e-D-化喃葡萄糖巧;n-癸基-0-化喃麥芽糖巧；n-癸基-P-D-硫代麥牙糖巧；n-十二燒酷薦 糖;十乙二醇單十二烷基酸;N-癸酷-N-甲基葡萄糖胺;n-癸基a-D-化喃葡萄糖巧;癸基P-D- 化喃麥芽糖巧;n-十二燒酷-N-甲基葡糖酷胺;n-十二烷基a-D-麥芽糖巧;n-十二烷基P-D- 麥芽糖巧;庚燒-1，2,3-=醇;屯乙二醇單癸酸;屯乙二醇單十二烷基酸;屯乙二醇單十四燒 基酸;n-十六基P-D-麥芽糖巧;六乙二醇單十二烷基酸;六乙二醇單十六烷基酸;六乙二醇 單十八烷基酸;六乙二醇單十四烷基酸；甲基-6-0-(N-庚基氨甲酯基)-a-D-化喃葡萄糖巧； 九乙二醇單十二烷基酸;N-壬酷-N-甲基葡萄糖胺;N-壬酷-N-甲基葡萄糖胺;八乙二醇單癸 酸;八乙二醇單十二烷基酸;八乙二醇單十六烷基酸;八乙二醇單十八烷基酸;八乙二醇單 十四烷基酸;辛基-e-葡萄糖巧；辛基-e-硫代葡萄糖巧；辛基-e-D-化喃葡萄糖巧；辛基-0- D-I-硫代化喃葡萄糖巧；五乙二醇單癸酸；五乙二醇單十二烷基酸；五乙二醇單十六烷基 酸;五乙二醇單己酸;五乙二醇單十八烷基酸;五乙二醇單辛酸;聚乙二醇二環(huán)氧甘油酸;聚 乙二醇酸;聚氧乙締10十=烷基酸;聚氧乙締（100)硬脂酸鹽;聚氧乙締(20)異十六烷基酸； 聚氧乙締（20)油醇酸;聚氧乙締(40)硬脂酸鹽;聚氧乙締（50)硬脂酸鹽；聚氧乙締(8)硬脂 酸鹽;聚氧乙締雙(咪挫基幾基）；聚氧乙締(25)丙二醇硬脂酸鹽;來自皂樹樹皮的皂角巧； 十四基-0-D-麥芽糖巧；四乙二醇單癸酸；四乙二醇單十二烷基酸；四乙二醇單十四烷基酸； =乙二醇單癸酸;=乙二醇單十二烷基酸;=乙二醇單十六烷基酸;=乙二醇單辛酸;=乙 二醇單十四烷基酸；泰洛沙泊；11-^^一基P-D-化喃葡萄糖巧，（辛基苯氧）聚乙氧基乙醇（ IGEPAL?CA-630);聚氧乙締(5巧基苯酸(IGEPAU?C0-520);和聚氧乙締（150)二壬基苯 離（IGEPAL?DM-970)。在一個實施方案中，表面活性劑是聚氧乙締（5)壬基苯酸（ IGEPAL'kcO-520)。在另一個實施方案中，表面活性劑是聚氧乙締（150)二壬基苯酸（ 1GEPAL'k|)M-970)。在一個實施方案中，表面活性劑優(yōu)選地是（辛基苯氧）聚乙氧基乙醇（ IGEPAL "CA-630) O
[0043] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到，添加至生物流體的表面活性劑的量可能并且將會變 化，取決于生物流體中的可包括循環(huán)miRNA的生物流體組分的特性。在一些實施方案中，生 物流體中的表面活性劑的最終濃度可在約0.001至約10 %范圍內(nèi)。在一個實施方案中，表面 活性劑的濃度可在約0.001至約0.01 %范圍內(nèi)。在另一個實施方案中，表面活性劑的濃度可 在約0.Ol %至約0.1 %范圍內(nèi)。在另一個實施方案中，表面活性劑的濃度可在約0.1 %至約 1%范圍內(nèi)。在另一個實施方案中，表面活性劑的濃度可在約1至約5%范圍內(nèi)。在另外的實 施方案中，表面活性劑的濃度可在約5 %至約10 %范圍內(nèi)。
[0044] (C)抗miRNA結(jié)合蛋白試劑
[0045] 生物流體與抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸?？筸iRNA結(jié)合蛋白試劑可為能夠結(jié)合與循 環(huán)mi RNA締合的mi RNA結(jié)合蛋白的任何試劑。與循環(huán)mi RNA締合的mi RNA結(jié)合蛋白可直接結(jié)合 miRNA,或可間接地與包括miRNA的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物締合。可與循環(huán)miRNA締合的miRNA結(jié) 合蛋白質(zhì)的非限制實例可包括Argonaut、Dice;r、人免疫缺陷病毒化IV)反式激活響應(yīng)RNA結(jié) 合蛋白（TRBP)、干擾素誘導(dǎo)蛋白激酶的蛋白質(zhì)活化劑(PACTKSMN復(fù)合物、脆折X智力低下蛋 白質(zhì)（FMRP)、含有Tudor葡萄球菌核酸酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)（Tudor-SN)、假定DNA解旋酶 MOVlO，和含有RNA識別基元的蛋白質(zhì)TNRC6B，或RISC復(fù)合物的其它組分或可與RISC復(fù)合物 瞬時或永久締合的物質(zhì)。
[0046] 在一些實施方案中，生物流體優(yōu)選地與抗Argonaut試劑接觸。Argonaut蛋白質(zhì)的 非限制實例可包括Agol、Ago2、Ago3和Ago4。在一個實施方案中，生物流體與抗Agol試劑接 觸。在另一個實施方案中，生物流體與抗Ago2試劑接觸。在另一個實施方案中，生物流體與 抗Ago3試劑接觸。在另一個實施方案中，生物流體與抗Ago4試劑接觸。在另一個實施方案 中，生物流體優(yōu)選地與能夠結(jié)合一種W上Argonaut蛋白質(zhì)的試劑接觸。舉例來說，生物流體 可與抗Agol和抗Ago2試劑接觸。在仍然另一個實施方案中，生物流體優(yōu)選地與能夠結(jié)合 Agol、Ago2、AgoS 和 Ago4 的試劑接觸。
[0047] 抗miRNA結(jié)合蛋白試劑可為表位結(jié)合劑。取決于目標分子，合適表位結(jié)合劑的非限 制實例包括選自由W下組成的組的劑:適體、抗體、抗體片段、雙鏈DNA序列、修飾核酸、核酸 模擬物、配體、配體片段、受體、受體片段、多膚、膚、輔酶、輔助調(diào)節(jié)因子、變構(gòu)分子和離子。
[0048] 在一些實施方案中，表位結(jié)合劑是抗體。可使用的抗體的非限制實例包括多克隆 抗體、腹水、Fab片段、Fab^片段、單克隆抗體、單鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、人源化抗體和含有 抗體的表位結(jié)合位點的其它片段。
[0049] 在一些實施方案中，生物流體與抗Argonaut抗體接觸。在一個實施方案中，生物流 體與抗Agol抗體接觸。在另一個實施方案中，生物流體與抗Ago2抗體接觸。在另一個實施方 案中，生物流體與抗Ago3抗體接觸。在另一個實施方案中，生物流體與抗Ago4抗體接觸。在 另一個實施方案中，生物流體與選自抗AgoU抗Ago2、抗Ago3或抗Ago4抗體的兩種抗Ago抗 體接觸。舉例來說，生物流體與抗Agol和抗Ago2抗體接觸。在另一個實施方案中，生物流體 與選自抗Ago 1、抗Ago2、抗Ago3或抗Ago4的S種抗Ago抗體接觸。在另一個實施方案中，生物 流體與所有四種抗Ago抗體接觸。在另一個實施方案中，生物流體與能夠識別一種W上 Argonaut蛋白質(zhì)的抗體接觸。運類抗體可識別一種、兩種、S種或四種Argonaut蛋白質(zhì)。在 一個實施方案中，生物流體與能夠識別所有四種人Argonaut蛋白質(zhì)的抗Argonaut抗體接 觸。
[0050] 生物流體與本公開的抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸形成免疫沉淀miRNA復(fù)合物。因 此，在生物流體與固定抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸時，抗miRNA結(jié)合蛋白試劑通常附接至固 體載體W形成免疫沉淀miRNA復(fù)合物。固體載體可為可加W改性W含有適合于抗miRNA結(jié)合 蛋白試劑附接或締合的離散個別位點的材料。固體載體材料的非限制實例包括玻璃、改性 或功能化玻璃、塑料包括丙締酸樹脂、聚苯乙締和苯乙締與其它材料的共聚物、聚丙締、聚 乙締、聚下締、聚氯基甲酸醋，或TeflonJ、尼龍、硝化纖維素、多糖、樹脂、二氧化娃或基于二 氧化娃的材料包括娃和改性娃、碳、金屬、無機玻璃和塑料。固體載體的大小和形狀可變化 而不背離本發(fā)明范圍。固體載體可為平面，固體載體可為孔，即，364孔板，或替代地，固體載 體可為珠?；蚧Ｔ谝恍嵤┓桨钢?，固體載體是多層板的孔。在其它實施方案中，固體 載體是吸移管尖端的內(nèi)表面。在其它實施方案中，固體載體優(yōu)選地是珠粒。在一些實施方案 中，固體載體優(yōu)選地是磁性珠粒。
[0051] 抗miRNA結(jié)合蛋白試劑可W多種方式附接至固體載體，如本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到。 抗miRNA結(jié)合蛋白試劑和固體載體可用化學(xué)官能團衍生化W便隨后將兩者附接。舉例來說， 固體載體可用包括但不限于氨基、簇基、氧代基團或硫醇基團的化學(xué)官能團來衍生化。使用 運些官能團，抗miRNA結(jié)合蛋白試劑可使用官能團直接附接，或間接地使用接頭來附接?；?者，抗miRNA結(jié)合蛋白試劑也可非共價附接至固體載體。舉例來說，可制備生物素化抗miRNA 結(jié)合蛋白試劑，其可結(jié)合至用鏈霉抗生物素蛋白共價涂布的固體載體，導(dǎo)致附接。將抗 miRNA結(jié)合蛋白試劑附接至固體載體的其它方法在本領(lǐng)域中是熟知的，并且可如公布實驗 室手冊諸如?；痳rent Protocols in Mole州Iar Biology"Ausubel等人John Wiley&Sons， New York，2003或"Molecular Cloning：A Laboratory Manual"Sambrook&Russell,Cold 5口1'；[]1旨化1'13〇'?'日33，〔〇1(1891'；[叫化1'1301'，附，第3版，2001中所描述。在一些實施方案 中，制備生物素化抗miRNA結(jié)合蛋白試劑，其可結(jié)合至用鏈霉抗生物素蛋白共價涂布的珠粒 固體載體，導(dǎo)致附接。如在W下部分1(d)中所描述，在本公開的方法中，抗miRNA結(jié)合蛋白試 劑可附接至固體載體，然后接觸生物流體?；蛘撸竟_的生物流體可同時與抗miRNA結(jié)合 蛋白試劑和固體載體接觸，其中抗miRNA結(jié)合蛋白試劑附接至固體載體。本公開的生物流體 也可在使生物流體與固體載體接觸之前與抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸，其中抗miRNA結(jié)合蛋 白試劑附接至固體載體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到，抗miRNA結(jié)合蛋白試劑的量和濃度可能 并且將會變化，取決于抗miRNA結(jié)合蛋白試劑的特性、所使用生物流體的體積、生物流體中 的miRNA的濃度和miRNA結(jié)合蛋白W及其它因素，并且可在實驗上確定。當抗miRNA結(jié)合蛋白 試劑是純化抗體時，每0.2ml血漿或血清樣品可使用約0.5至約IOiig抗體。
[0052] (d)接觸生物流體并分離miRNA
[0053] 在本公開的方法中，生物流體與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸。如本領(lǐng) 域技術(shù)人員認識到，生物流體可與各種其它試劑接觸而不背離本發(fā)明范圍。例如，生物流體 可與硫醇-還原劑接觸W阻斷二硫鍵的形成并且在miRNA分離期間抑制核糖核酸酶活性。合 適硫醇-還原劑包括二硫蘇糖醇(DTT)、2-琉基乙醇、2-琉基乙胺和=(簇乙基)麟(TCEP)。生 物流體也可與消泡劑接觸。消泡劑的實例包括消泡劑204和消泡劑0-30、消泡劑A、消泡劑B、 消泡劑C、消泡劑Y-30和Sag 471。生物流體也可與RNA和蛋白質(zhì)降級抑制劑接觸來保存 miRNA和miRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。
[0054] 在一些實施方案中，緩沖劑可用于保持適合于分離miRNA的抑。作為非限制實例， 緩沖劑可包括但不限于S徑甲基氨基甲燒乙酸醋、邸TA、S(^甲基)氨基甲燒、甘氨酸和巧 樣酸。
[0055] 在一些實施方案中，本公開的方法包括使生物流體與表面活性劑接觸W解離生物 流體組分，然后使生物流體與抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸W形成免疫沉淀miRNA復(fù)合物。在 其它實施方案中，生物流體同時與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸。
[0056] 在一些實施方案中，生物流體的未稀釋樣品與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試 劑接觸。在其它實施方案中，生物流體在與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸之前稀 釋。生物流體的稀釋可如W上部分1(a)所描述。
[0057] 生物流體、表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑之間的接觸總體上包括解育期W 允許形成免疫沉淀miRNA復(fù)合物。生物流體可與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸并 且解育約1、5、10、15、30、45、60、90、120、240或480分鐘或更長。在一些實施方案中，生物流 體與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸并且解育約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14或約15分鐘。在其它實施方案中，生物流體與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接 觸并且解育約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或約 30 分鐘。在其它實施方案中，生物流體與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸并且解育約 20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或約90分鐘。在其它實施方案中，生物流體 與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸并且解育約90、120、240或480分鐘或更長。在一 個實施方案中，生物流體優(yōu)選地與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸并且解育約20、 25、30、35、40、45、50、55或約60分鐘。
[005引 生物流體可在約0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、 22、23、24、25、26、27、28、29或約30°(：或更高的溫度下與表面活性劑和抗11111?^4結(jié)合蛋白 試劑接觸。在一些實施方案中，生物流體在約0、1、2、3、4、5或約6°C的溫度下與表面活性劑 和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸。在其它實施方案中，生物流體在約5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14或約15°C的溫度下與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸。在其它實施方案中，生物 流體在約11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或約25°(：的溫度下與表面活性劑 和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸。在其它實施方案中，生物流體在約20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29或約30°C的溫度下與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸。
[0059] 典型地，生物流體在攬拌下與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸。另外，在 形成復(fù)合物之后，生物流體可總體上移除W分離免疫沉淀miRNA復(fù)合物，并且將免疫沉淀 miRNA復(fù)合物洗涂。
[0060] (e)釋放 miRNA
[0061] 根據(jù)本公開的方法，使miRNA從免疫沉淀miRNA復(fù)合物中釋放。從蛋白質(zhì)復(fù)合物釋 放核酸諸如miRNA的方法在本領(lǐng)域中是熟知的并且可包括蛋白水解酶消化，和使核酸-蛋白 質(zhì)復(fù)合物中的蛋白質(zhì)變性。在一些實施方案中，miRNA通過蛋白質(zhì)變性從免疫沉淀miRNA復(fù) 合物釋放。例如，miRNA可通過使免疫沉淀miRNA復(fù)合物與硫氯酸脈-苯酪-氯仿溶液組合來 從免疫沉淀miRNA復(fù)合物釋放。然后，釋放miRNA可通過沉淀或使用吸附柱色譜來純化。
[0062] 在其它實施方案中，miRNA優(yōu)選地通過蛋白水解酶消化從免疫沉淀miRNA復(fù)合物釋 放。術(shù)語"蛋白水解酶(protease)"、"蛋白酶(proteinase)"和"膚酶"在本文中可互換使用 并且是指催化共價膚鍵的水解的酶群組。蛋白水解酶在本領(lǐng)域中是熟知的并且可包括酸性 蛋白水解酶和絲氨酸蛋白水解酶。在一些實施方案中，在本公開的方法中可用于釋放miRNA 的蛋白水解酶是酸性蛋白水解酶。在一個實施方案中，在本公開的方法中可用于釋放miRNA 的酸性蛋白水解酶是胃蛋白酶。
[0063] 在其它實施方案中，在本公開的方法中可用于釋放miRNA的蛋白水解酶是酸性蛋 白水解酶。已經(jīng)識別絲氨酸蛋白水解酶的六個集群，其中兩個最大集群是膜凝乳蛋白酶樣 和枯草桿菌蛋白酶樣集群。很多枯草桿菌酶是已知的。廣泛研究的一些枯草桿菌酶包括從 各種芽抱桿菌屬獲得的枯草桿菌酶，包括枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶化r Isberg、 枯草桿菌蛋白酶BPN^ (還稱為枯草菌蛋白酶）、堿性桿狀菌蛋白酶W及從林伯氏白色念球菌 獲得的蛋白酶K，和從普通嗜熱放線菌獲得的嗜熱蛋白酶。在本發(fā)明的某些實施方案中，蛋 白酶K優(yōu)選是蛋白水解酶。然而，在某些實施方案中也可使用其它蛋白水解酶，例如像枯草 菌蛋白酶。因此，蛋白水解酶可為導(dǎo)致免疫沉淀miRNA復(fù)合物中的蛋白質(zhì)的至少部分分解W 使得釋放miRNA的許多蛋白水解酶中的任何一種。在一些實施方案中，在本公開的方法中可 用于釋放miRNA的蛋白水解酶優(yōu)選是蛋白水解酶K。
[0064] 在本質(zhì)上，通過使復(fù)合物與蛋白水解酶接觸使miRNA從免疫沉淀miRNA復(fù)合物釋 放。如本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到，用于釋放miRNA的蛋白水解酶的量可能并且將會變化，取決 于蛋白水解酶、免疫沉淀miRNA復(fù)合物的豐度、蛋白水解酶消化期間的溫度、用于消化的緩 沖液條件和消化持續(xù)時間W及其它因素。通常，免疫沉淀miRNA復(fù)合物可與約0.3單位的酶 活性至約30單位的酶活性接觸。在某些實施方案中，與免疫沉淀miRNA復(fù)合物接觸的蛋白水 解酶的量可在約0.3至約1單位、約1至約3單位、約3單位至約10單位，或約10單位至約30單 位范圍內(nèi)。
[0065] 在一些實施方案中，如實施例1所描述，在室溫下使用蛋白水解酶消化。如本文使 用，術(shù)語"室溫"用于描述約1 (TC至約30°C的溫度。
[0066] 免疫沉淀miRNA復(fù)合物可與蛋白水解酶一起解育約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、1920、25或約30分鐘或更長。在一些實施方案中，免疫沉淀 miRNA復(fù)合物與蛋白水解酶一起解育約0.5、1、2、3、4或約5分鐘。在其它實施方案中，免疫沉 淀miRNA復(fù)合物與蛋白水解酶一起解育約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或約15分鐘。在其它 實施方案中，免疫沉淀miRNA復(fù)合物與蛋白水解酶一起解育約15、16、17、18、1920、25或約30 分鐘或更長。
[0067] 釋放miRNA可適合于在沒有進一步純化的情況下供下游使用。或者，釋放miRNA可 進一步純化供下游使用。核酸純化方法，諸如吸附柱色譜或過濾技術(shù)，在本領(lǐng)域中是熟知 的，例如，根據(jù)公布實驗室手冊諸如"Current Protocols in Molecular Biology"Ausubel 等人John Wiley&Sons，化W York,2003或"Molecular Cloning:A LaboratoiT Manual" Sambrook&RusselliCold Spring 化rbor Press，Cold Spring 化rboriNY，第3版，2001所 描述的方法。
[006引釋放miRNA的下游使用可變化。釋放miRNA的非限制性使用包括定量實時PCR、微陣 列分析、測序、限制片段長度多態(tài)性(R化P)分析、單一核巧酸多態(tài)性(SNP)分析、小隨體分 析、短串聯(lián)重復(fù)(STR)分析和比較基因組雜交(CGH)。
[00例 II.試劑盒
[0070]本發(fā)明進一步提供試劑盒，其包括表面活性劑、抗miRNA結(jié)合蛋白試劑，和可用于 本公開的方法的其它試劑。在一些實施方案中，提供用于從生物流體分離miRNA的試劑盒， 所述試劑盒包括抗miRNA結(jié)合蛋白試劑和表面作用試劑。抗miRNA結(jié)合蛋白試劑和表面活性 劑可如上述部分（I)所描述。在一些實施方案中，試劑盒中的抗miRNA結(jié)合蛋白試劑是附接 至固體載體的抗Ago抗體。在某些實施方案中，固體載體可為珠粒、磁性珠粒或多層板的孔。 在其它實施方案中，固體載體可為吸移管尖端的內(nèi)表面。在一些實施方案中，試劑盒中的表 面作用劑是IGEPAL。試劑盒可還包括從免疫沉淀miRNA復(fù)合物釋放miRNA的構(gòu)件。在一些實 施方案中，試劑盒包括用于從免疫沉淀miRNA復(fù)合物釋放miRNA的蛋白水解酶，例如，蛋白水 解酶K。
[OOW 定義
[0072]除非另外定義，否則本文所使用的所有技術(shù)性和科學(xué)性術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域 中的普通技術(shù)人員通常所理解的含義。W下參考文獻為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供用于本發(fā)明中 的許多術(shù)語的一般定義：Singleton等人DictionaiT of Microbiology and Molecular Biology(第2版.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.，1988) ;The Glossary of Genetics,第5版，R.Rieger等人（eds.) ,Springer Verlag (1991);和化le&Marham'The 化;rper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文所 用，除非另外指明，W下術(shù)語具有賦予其的含義。
[0073] 當介紹本公開或其一個或多個優(yōu)選方面的要素時，冠詞"一個/種(a)"、" 一個/種 (an)"、"所述(the)" W及"所述(said)"意圖意指存在一個或多個要素。術(shù)語"包括"、"包含" 和"具有"意在是包括性的，并且意指除所列出的要素之外可存在另外的要素。
[0074] 如本文使用，"微小RNA"或"miRNA"是指可在生物標本中檢測到的5至40個核巧酸 長度的小的非編碼RNA序列。一些miRNA從發(fā)夾前體得到，所述前體例如通過酶DICER來處理 成成熟物質(zhì)，例如，約18-25個核巧酸，優(yōu)選地21-23個核巧酸。微小RNA變體例如在不同動物 物種之間是常見的。另外，miRNA的5/和y末端處的變化是常見的，并且可由在成熟期間通 過酶諸如DICER的不精確裂解所導(dǎo)致。運些變體展現(xiàn)miRNA序列中的不削弱功能或檢測 miRNA的能力的一系列可接受變化。另一種類型變體是Dicer處理后添加非模板核巧酸至 miRNA的y末端(運些核巧酸是非模板的，因為其不匹配人基因組）。最常見變體是具有添加 至y末端的額外A或U的miRNA序列。
[0075] 如本文使用，術(shù)語"生物流體"或"體液"可互換使用并且是指從受試者分離的流 體。
[0076] 術(shù)語"生物流體"、"生物流體樣品"或"生物樣品"可互換使用并且意指從任何給定 受試者分離的所有生物流體和排泄物。在本發(fā)明的情形中，運類樣品包括但不限于血液和 其部分、血清、血漿、尿液、排泄物、精液(semen)、精液(seminal fluid)、精液漿、前列腺液、 射精前的分泌物(考巧液）、胸膜腔積液、眼淚、唾液、疲、汗、活檢、腹水、腦脊液、羊水、淋己、 骨髓、宮頸分泌物、陰道分泌物、子宮內(nèi)膜分泌物、胃腸分泌物、支氣管分泌物、乳腺分泌物、 卵巢囊腫分泌物和組織流體樣品。
[0077] "分離"多核巧酸是經(jīng)過識別并且與在其天然來源中通常與其締合的至少一種污 染物分離的核酸分子。分離的核酸分子處于其在自然界中被發(fā)現(xiàn)時W外的形式或環(huán)境。因 此，分離的核酸分子不同于當它存在于天然細胞中時的特定核酸分子。
[0078] 因為可在不脫離本發(fā)明的范圍下對上述動物、細胞和方法做出各種改變，所W在 W上描述中和在W下給出的實施例中含有的所有事項都應(yīng)解釋為說明性的而非具有限制 性意義。 實施例
[0079] 包含W下實施例W說明本公開。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當了解在下面的實施例中公開 的技術(shù)代表本
【發(fā)明人】發(fā)現(xiàn)的在實踐中本公開中起較好作用的技術(shù)。但是，鑒于本公開，本領(lǐng) 域技術(shù)人員了解到可W在本公開中進行許多變化，并且仍然獲得同樣或類似的結(jié)果，而不 背離本發(fā)明的精神和范圍，因此，示出的所有事項應(yīng)理解為例示性的，而不具有限制意義。
[0080] 實施例1: 一般miRNA分離方案。
[0081] 用于分離循環(huán)miRNA的代表性方案包括在清潔劑存在下執(zhí)行RNA免疫沉淀(RIP) W 釋放囊泡締合miRNA。在此方案中，在不使用苯酪、離液劑或柱純化的情況下，miRNA與其它 細胞組分諸如其它RNA、血漿蛋白質(zhì)等分離，并且可在40-70分鐘內(nèi)完成。
[0082] 方案由S個步驟組成：
[0083] 1)血漿組分用清潔劑處理，
[0084] 2)將miRNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物免疫沉淀，和
[0085] 3)miRNA從免疫沉淀miRNA復(fù)合物釋放。
[00化]蛋白質(zhì)A(Sigma-Al化ich GE28-9670-56)、蛋白質(zhì)G(Sigma-Al化ic h GE28-9670- 66)或鏈霉抗生物素蛋白（Sigma-Al化ich GE28-9857-38)珠粒用抗Ago抗體涂布，方法是將 20iU磁性珠粒（10%漿液)轉(zhuǎn)移至0.1ml RIP洗涂緩沖液(50mM Tris-HCUpH 7.4、0.05% IGEPAL?CA-630)，用RIP洗涂緩沖液洗涂珠粒一次，并且使用磁性立柱來從溶液中分離 珠粒。然后，洗涂磁性珠粒重新懸浮于0.1 ml RIP洗涂緩沖液，然后添加2.5-lOiig非生物素 化或生物素化抗Ago(Sigma-A Idrich SAB4800048)、抗Ago2(Sigma-Al化ich SAB4200085) 或抗Ago 1(Sigma-Aldrich SAB4200084)抗體。珠粒和抗體伴W旋轉(zhuǎn)在室溫下解育約30分 鐘。然后，珠粒使用磁性立柱從溶液中分離。然后，抗體珠粒用0.5ml RIP洗涂緩沖液洗涂兩 次。
[0087] 在miRNA分離過程的第一步驟中，將0.2ml血漿、祉1 25%IGEPAL CA-630(Sigma- Al化ichI8896;產(chǎn)生l%最終濃度的40i^l25%IGEPAL/ml血漿）、化l蛋白水解酶抑制劑混 合物（PIC; Sigma-Al化ich P8340; lOiil/ml血漿），和0.祉I RNA酶抑制劑（Sigma-Al化ich R1158;化1/ml血漿)添加至制備的Ago抗體珠粒。或者，在制備珠粒時，血漿可用清潔劑和抑 制劑處理，并且預(yù)處理血漿隨后添加至抗體珠粒。
[0088] 在第二步驟中，miRNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物通過將樣品伴W旋轉(zhuǎn)在室溫下解育化r或在4 °(：下解育過夜來免疫沉淀。珠粒用Iml洗涂RIP緩沖液洗涂5X，并且使用磁性立柱收集W從 上清液中分離珠粒。珠?？啥虝旱仉x屯、并且送回到磁性立柱W移除殘留上清液。
[0089] 在第S步驟中，使與抗體珠粒締合的沉淀miRNA從蛋白質(zhì)復(fù)合物中釋放并且珠粒 用T民I Reagent?BD或QIAzol溶解試劑萃取，隨后用乙酸錠和線性丙締酷胺來進行異丙醇 沉淀，如Sigma-Al化ich Imprint RNA免疫沉淀試劑盒(RIP)技術(shù)公報所描述，或用Qiagen 的miRNeasy血清/血漿試劑盒來純化。替代地，并且優(yōu)選地，miRNA通過蛋白酶K消化來釋放。 將蛋白酶K混合物（1化1水、IOX蛋白酶K釋放緩沖液和鈕1 P4850蛋白酶K)添加至 來自步驟二的珠粒，并且在室溫下在VOdex genie 2,設(shè)定4上解育10分鐘。IOX蛋白酶K釋 放緩沖液包括IOOmM lYis、pH 8.0、15mM MgCl2、500mM KCUlOOmM DTT和 1%IGEPAL。解育 之后，珠粒立即通過安置于磁性立柱上并且將包括自由miRNA的上清液轉(zhuǎn)移至新鮮試管來 移除。上清液中的蛋白酶K然后通過將樣品在95 °C下解育5分鐘來滅活。具體miRNA W Sigma- Al化ich的MystiCq RT-qPCR測定使用每次IOiil聚腺巧酸加尾反應(yīng)扣1每一種miRNA制劑來 檢測。合成miRNA，即，具有與miRBase列出的成熟miRNA相同序列的單鏈RNA，在0.02mg/ml線 性丙締酷胺中基于260nm下的儲備溶液的吸光度來稀釋至已知拷貝數(shù)，與從血漿制備的 miRNA并行地測定，并且用作絕對定量的標準。
[0090] 實施例2:來自血漿的miRNA的免疫沉淀比單獨Tri Reagent更有效。
[0091] 將使用RNA免疫沉淀反應(yīng)(RIP)從血漿分離的miRNA的效率與使用TRI民eagent'K'抓 (Sigma-Al化ich)的miRNA分離相比。TR I Reagent"抓是用于從血液衍生物諸如血清、血漿 或全血同時分離RNA、DNA和蛋白質(zhì)的試劑。
[0092] 使用TRI Reagent?抓來分離m i RNA是根據(jù)制造商說明書?？傊?，0.2m 1血漿與TRI 反姑gent?BD混合，并且miRNA使用氯仿萃取W用于相分離，然后在乙酸錠和線性丙締酷胺 存在下進行異丙醇沉淀，并且洗涂RNAW供分析。使用RIP來分離miRNA用結(jié)合至20iU蛋白質(zhì) A磁性珠粒的2.5iig抗Ago2抗體來執(zhí)行。miRNA通過用TRI民eagent?抓萃取并且在乙酸錠和 線性丙締酷胺存在下的異丙醇沉淀來從珠?；厥眨鐚τ谥苯友獫{萃取一樣。
[0093] 所制備樣品中的 161-7曰-5口、11111?23曰-3口、11111?191-5口、11111?142-3口和11111?45131111尺酷 的水平通過定量、實時RT-PCR來確定。來自血漿的miRNA的RIP的效率比TRlReagent"加高 約5至約600倍(圖1)。
[0094] 實施例3. RIP產(chǎn)率類似于商用試劑盒的產(chǎn)率。
[0095] 將使用RNA免疫沉淀(RIP)從血漿中分離miRNA的效率與使用Qiagen的miRNeasy血 清/血漿試劑盒(Qiagen)的miRNA分離相比較。Qiagen miRNeasy使用包括選擇性結(jié)合DNA或 RNA的二氧化娃樹脂的吸附柱，并且推薦用于從《0.2ml血清或血漿中分離miRNA。
[0096] 使用QiagenmiRNeasy血清/血漿試劑盒分離miRNA是根據(jù)制造商的說明書?？傊?0.2ml血漿與QIAzol試劑混合，并且miRNA使用所提供的吸附柱從水層純化。使用RIP來分離 miRNA使用2.扣g抗Ago2抗體結(jié)合的20山蛋白質(zhì)A磁性珠粒來執(zhí)行。miRNA通過QIAzol試劑從 珠粒中釋放并且用Qiagen試劑盒純化，與直接血漿萃取一樣。
[0097] 所制備樣品中的161-7日、11111?23日、11111?191、11111?142和11111?4513 11111?酷的水平通過定 量、實時RT-PCR來確定。使用RIP的miRNA的產(chǎn)率類似于使用單獨Qiagen試劑盒的miRNA產(chǎn)率 (圖 2)。
[0098] 實施例4.將使用生物素化和非生物素化抗Ago抗體和鏈霉抗生物素蛋白珠粒為 RIP進行比較。
[0099] 蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G珠粒均結(jié)合人IgG,其在血漿中極端豐富。為了避免共分離IgG, 抗Ago(克隆2A8)和抗Ago2(克隆 11A9)抗體用Pierce EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Thermo Scientific)來生物素化W便使用鏈霉抗生物素蛋白珠粒進行RIPeAgo-RIP使用 2.5iig生物素化抗Ago2 (b-Ago2)或抗Ago (b-Ago)抗體和20iU鏈霉抗生物素蛋白磁性珠粒， 或使用2.扣g非生物素化抗Ago2抗體和20iU蛋白質(zhì)A珠粒來執(zhí)行。使用生物素化抗Ago2(b- Ago2)抗體和鏈霉抗生物素蛋白珠粒的RIP給出與使用抗Ago2抗體與蛋白質(zhì)A珠粒的RIP相 同的miRNA產(chǎn)率(參見圖3)。使用生物素化抗Ago的RIP給出顯著較低miRNA產(chǎn)率，與非生物素 化抗Ago和蛋白質(zhì)A珠粒的產(chǎn)率一樣。
[0100] 實施例5.使用RIP分離的miRNA的放熱負面地影響產(chǎn)率。
[0101] 無核酸酶水中的加熱作為RIP之后釋放miRNA的手段來測試。Ago-RIP使用0.2ml血 漿和2.扣g的在蛋白質(zhì)A磁性珠粒上的非生物素化抗Ago或抗Ago2抗體或在鏈霉抗生物素蛋 白磁性珠粒上的生物素化抗Ago或抗Ago2抗體來執(zhí)行。將14山無核酸酶水添加至珠粒，并且 運些混合物在移除珠粒之前在40°、50°或60°C下加熱2分鐘。將RIP隨后放熱與RIP隨后使用 Qiagen miRNeasy血清/血漿試劑盒的miRNA純化，和使用Qiagen試劑盒直接從血漿純化 miRNA進行比較。合成cel-miR-39-：3p( 1.4e8拷貝）在Qiagen制備物添加 QIAzol之后或在添 加至RIP后珠粒的水中予W跟蹤標定。
[0102] 合成cel-miR-39-化跟蹤標定物在2分鐘之后在60°C下用珠粒上的RIP產(chǎn)物未檢測 至Ij(圖4)。在2分鐘之后在40°、50°或60°C下也未檢測到內(nèi)源性miRNA。對于miR23a、miR142、 miR191和miR451a觀察到類似結(jié)果。Let7a miRNA也在樣品加熱至50°或60°C時損失。miRNA 的損失可能歸因于RNA酶在RIP中的遺留污染，因為血液已知含有極高水平的RNA酶。
[0103] 實施例6.使用蛋白酶K消化來釋放miRNA。
[0104] 蛋白酶K消化作為在Ago-RIP之后釋放miRNA的手段來測試。RIP使用0.2ml血漿和 結(jié)合至20山鏈霉抗生物素蛋白磁性珠粒的2.化g生物素化抗Ago2抗體來執(zhí)行。RIP后珠粒在 含有化1蛋白酶K(Sigma-Al化ich P4850)的消化緩沖液（2化1的IOmM IYis-肥L、pH 8.0、 1.5mM MgCl2、50mM KCUlOmM DTT、0.1%IGEPAL)中伴W攬拌在室溫或37°C下解育 10分鐘， 或伴W攬拌在65°C下解育2分鐘。移除珠粒之后，蛋白酶K在95°C下滅活5分鐘并且將化1每 一種蛋白酶K消化物添加至10山聚腺巧酸加尾反應(yīng)W便使用Sigma-Aldrich的MystiCq RT- qPCR測定來進行特異性miRNA檢測。為了比較，RIP后珠粒的并行制備物使用QIAzol溶解試 劑來萃取并且用HiiRNeasy血清/血漿r總量"，設(shè)定為100% )來純化。來自RIP-蛋白酶K的 miRNA水平相對于來自其中使用miRNeasy試劑盒釋放miRNA的RIP的水平來表示。
[0105] 在室溫下使用蛋白酶K消化來釋放miRNA產(chǎn)生比在較高溫度下所釋放更多的miRNA (圖5)。在所有情況下，損失大量的總miRNA。損失很可能歸因于樣品中的殘留RNA酶。
[0106] 類似實驗在抑2、3或4下的緩沖液中使用胃蛋白酶消化針對miRNA而不是蛋白酶K 的釋放來執(zhí)行。使用胃蛋白酶的miRNA釋放回收小于1 %的miRNA(數(shù)據(jù)未展示）。
[0107] 實施例7.將RIP與從互物流體中萃取miRNA的其它方法比較。
[0108] miRNA使用生物素化抗Ago2和鏈霉抗生物素蛋白磁性珠粒和蛋白水解酶K釋放來 分離，基本上如實施例6所描述。為了比較，miRNA還使用來自Exiqon的miRCury?RNA分離試 劑盒-生物液體，或來自Qiagen的miRNeasy血清/血漿試劑盒來從血漿中直接純化(圖6)。運 些數(shù)據(jù)示出來自使用Exiqon試劑盒純化的RNA的let7a miRNA產(chǎn)率比使用Qiagen試劑盒純 化的產(chǎn)率高3-4倍。在大多數(shù)實驗中，使用Ago-RIP和蛋白酶K釋放來制備的大多數(shù)miRNA的 在Exiqon和Qiagen的產(chǎn)率中間。let7a的結(jié)果在圖6和圖7中示出，但是miR23a、miR142和 miR191的結(jié)果是類似的。另一方面，對于Ago-RIP和Exiqon來說，miR451a的產(chǎn)率是類似的。 miR451a需要Ago2切割器活性W便處理至成熟miRNA,因此，只在Ago2復(fù)合物中發(fā)生。除了 Ago2W外，其它miRNA可與Agol、Ago3或Ago4締合。由于所使用的抗體對于Ago2具有特異性， 因此與它對于所有其它成熟miRNA相比，它更有效地分離miR451a。
[0109] 實施例8.具有或不具有蛋白水解酶抑制劑和RNA酶抑制劑的RIP。
[0110] AgO-RIP用于在存在(+inh)或不存在(-inh)蛋白水解酶抑制劑和RNA酶抑制劑的 情況下分離miRNA,并且miRNA通過蛋白水解酶K從珠粒釋放。與未用抑制劑處理的樣品相 比，在抑制劑存在下執(zhí)行的Ago-RIP產(chǎn)生更多l(xiāng)et7a miRNA。對于miR191，發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。對 于miR451a，沒有顯著差異（圖8)。
[0111] 還執(zhí)行用具有或不具有抑制劑的IGEPAL來預(yù)處理血清(+pre)，并且與在添加抗體 珠粒的同時添加具有或不具有抑制劑的IGEPAL(-pre)進行比較。結(jié)果示出在與共處理相比 時，用蛋白水解酶和RNA酶抑制劑預(yù)處理血清未改進let7aor miR451a的產(chǎn)率(圖8)。
[0112] 實施例9.使用或不使用清潔劑的情況下的miRNA回收。
[0113] 為了確定清潔劑對于分離miRNA的效應(yīng)，Ago-RIP(使用0.2ml血漿)在存在或不存 在IGEPAL清潔劑的情況下使用IOiig生物素化抗Ago2抗體/鏈霉抗生物素蛋白磁性珠粒來執(zhí) 行。認為在不存在清潔劑時分離的任何miRNA是自由的（即，不在囊泡中），并且在清潔劑存 在下分離的任何miRNA是囊泡的?？俶iRNA是從IGEPAL處理血漿回收的miRNA的水平，并且設(shè) 定為100%。自由miRNA(未與囊泡締合的miRNA)是從未用IGEPAL處理的血漿回收的miRNA的 水平。囊泡締合miRNA計算為總miRNA樣品中的miRNA的水平減去自由miRNA樣品中的所述 miRNA的水平。圖9示出let7a、miR23a、miR142和miR451a miRNA的自由和囊泡締合水平。運 些結(jié)果示出可需要清潔劑處理W通過RIP有效地從血漿中回收一些miRNA。
[0114] 實施例10. RIP是可規(guī)?；摹?br>[0115] RIP使用0.2ml血漿和IOiig生物素化抗Ago2/鏈霉抗生物素蛋白珠粒，或0.4ml血漿 和20yg生物素化抗Ago2/鏈霉抗生物素蛋白珠粒，隨后通過蛋白酶K消化進行釋放來執(zhí)行。 為了比較，miRNA使用Exiqon的miR化巧RNA分離試劑盒-生物液體從0.2ml相同血漿分離。使 用每一種制備方法回收的Ie巧a、miR191和miR451a的總產(chǎn)率在圖10中示出。與Ago-RIP- 樣，兩倍同樣多的血漿（即，0.4ml相比于0.2ml)產(chǎn)生1.5-2倍同樣多的測試miRNA,而柱基試 劑盒(諸如來自Exiqon和Qiagen的試劑盒)是容量受到限制的并且建議使用不超過0.2ml血 漿。
[0116] 實施例11. RIP的最小解育和洗涂時間。
[0117] RIP使用0.2ml血漿和扣g生物素化抗Ago2/鏈霉抗生物素蛋白珠粒來執(zhí)行，伴W旋 轉(zhuǎn)在室溫下解育5、15、30或60分鐘。解育5、15或30min的miRNA在解育完成之后全部洗涂5 次。解育60min的miRNA用RIP洗涂緩沖液洗涂5、4、3、2或1次。所有miRNA通過蛋白酶K來釋 放。let7a的產(chǎn)率提供于圖11中。結(jié)果示出超過15分鐘的解育期似乎為在所使用的條件(例 如，抗體和珠粒的類型和量）下最大miRNA回收所必需，但是在使用Sigma-Aldr i Ch的 MystiCq測定（聚腺巧酸加尾，RT，qPCR)來檢灘HiRNA之前只需要一次洗涂。對于miR122、 miR191和miR451a，獲得類似結(jié)果。
[0118] 實施例12. RIP對于miRNA具有特異性。
[0119] 執(zhí)行W下實例W確定是否Ago-RIP對于miRNA具有特異性或是否Ago-RIP還分離物 其它RNA。使用Ago-RIP(S)、Exiqon的HiiRCuryRNA分離試劑盒-生物液體化），或Qiagen的 mi化easy血清/血漿試劑盒(Q)從0.2ml新鮮血漿(實驗巧日2)或0.2ml冷凍血漿(實驗3)中執(zhí) 行分離。實驗1用2.扣g生物素化抗ago2抗體/2化1鏈霉抗生物素蛋白珠粒來執(zhí)行。實驗2和3 用2.化g生物素化抗ago2抗體/2化1鏈霉抗生物素蛋白珠粒來執(zhí)行?；旧先缟蠈嵤├?所 述的蛋白酶K消化用于從珠粒中釋放miRNA。特定miRNA(例如，let7a)和特定小核或核仁RNA (例如，RNU6或SNO畑48)使用MyStiCq RT-qPCR測定來檢測，并且更長mRNA或個rRNA(例如， GAPDH、RN18S、RN28S)使用KiCqStart?RT-qPCR(Sigma-Aldrich)測定來檢測。來自海拉 化eLa)細胞(使用TRI反eagent?抓來分離）的總RNA用于定量標準。
[0120] 如預(yù)期，miRNA諸如Ie巧a使用Ago-RIP或任一種柱基試劑盒來分離(參見圖12A)。 然而，其它小RNA或大RNA未通過Ago-RIP來分離，而是使用Exiqon和Qiagen試劑盒來分離。 如圖和圖12C中示出，幾乎沒有RNU6、SN0畑48、GAPDH、RN18S或RN28S RNAS使用Ago-RIP 得到分離，而是所有運些其它類型的RNA使用Exiqon和Qiagen試劑盒得到分離。因此，Ago- RIP僅特異性地分離miRNA。
[0121] 實施例13.使用抗Agol和抗Ago2抗體增加RIP產(chǎn)率。
[0122] 由于不同miRNA與不同Ago蛋白質(zhì)締合，因此可能某些miRNA的產(chǎn)率可經(jīng)由針對不 同Ago蛋白質(zhì)的抗體的組合使用來改進。因此，miRNA使用IOyg抗Ago 1抗體/2化1蛋白質(zhì)A珠 粒、IOiig抗Ago2抗體/20iU蛋白質(zhì)A珠粒，或20iU的每一種類型抗體珠粒的1:1混合物從 0.2ml血漿中分離。miRNA從珠粒的釋放使用QIAzol溶解試劑來執(zhí)行并且使用Qiagen試劑盒 來純化，基本上如上實施例3所述。特定miRNA(例如，let7a、miR142-3p、miR122、miR19dP miR451a)使用MystiCq RT-qPCR測定來檢測。
[0123]如圖13中示出，共同使用兩種抗體的產(chǎn)率大約是單獨使用的每一種抗體的總和。 對于大多數(shù)miRNA，使用抗Ago2導(dǎo)致比使用抗Agol更大的產(chǎn)率。然而，在使用抗Agol時，回收 更多miR122,與l\irchinovich等人2012，RNA Biology 9(8) :1066-75)-致。另外，miR451a 只使用抗Ago2來回收，如W上實施例7中所說明。
【主權(quán)項】
1. 一種用于從生物流體中分離微小RNA(miRNA)的方法，所述方法包括(a)使所述生物 流體與表面活性劑和抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸，其中所述表面活性劑使生物流體組分解 離并且所述抗miRNA結(jié)合蛋白試劑與和miRNA締合的miRNA結(jié)合蛋白相互作用從而形成免疫 沉淀miRNA復(fù)合物;和(b)在未純化的情況下使miRNA從所述免疫沉淀miRNA復(fù)合物中釋放。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物流體包括囊泡miRNA和非囊泡miRNA。3. 如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述生物流體是血漿或血清。4. 如權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述表面活性劑是非離子表面活性劑。5. 如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述生物流體同時與所述表面活性劑和 所述抗miRNA結(jié)合蛋白試劑接觸。6. 如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中將所述生物流體、所述表面活性劑和所 述抗miRNA結(jié)合蛋白試劑孵育約30分鐘。7. 如權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中在室溫下孵育所述生物流體、所述表面 活性劑和所述抗miRNA結(jié)合蛋白試劑。8. 如權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述抗miRNA結(jié)合蛋白試劑包括附接至 固體載體的抗Argonaut抗體。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述固體載體是磁性珠粒。10. 如權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括使所述免疫沉淀miRNA復(fù) 合物與蛋白水解酶接觸。11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述蛋白水解酶是蛋白酶K。12. 如權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的方法，其中所述免疫沉淀miRNA復(fù)合物與蛋白水 解酶接觸約10分鐘。13. 如權(quán)利要求10至12中任一項所述的方法，其中所述免疫沉淀miRNA復(fù)合物在室溫下 與蛋白水解酶接觸。14. 如權(quán)利要求1至13中任一項所述的方法，其中從所述免疫沉淀miRNA復(fù)合物釋放的 所述miRNA不含其它類型的RNA分子。15. -種用于從生物流體中分離微小RNA的試劑盒，所述試劑盒包括表面活性劑和抗 miRNA結(jié)合蛋白試劑。16. 如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述表面活性劑是非離子表面活性劑。17. 如權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的試劑盒，其還包括蛋白酶K。18. 如權(quán)利要求15至17中任一項所述的試劑盒，其中所述抗miRNA結(jié)合蛋白試劑包括附 接至固體載體的抗Argonaut抗體。19. 如權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中所述固體載體是磁性珠粒。
【文檔編號】C07H21/04GK105934439SQ201480074125
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2014年11月25日
【發(fā)明人】C.克里德
【申請人】西格馬-奧爾德里奇有限責任公司