一種α-2,3唾液酸化乳果糖制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種α?2，3唾液酸化乳果糖制備方法，其特征在于：一定組份的乳果糖、三磷酸胞苷鈉、唾液酸、溶于超純水中，用3摩爾/升的NaOH調(diào)pH8.5，加入1摩爾/升的pH8.5的Tris?HCl。然后將混合物放入37℃氣浴振蕩器中，反應(yīng)18～30小時(shí)。采用硅膠薄層層析(TLC)檢測(cè)反應(yīng)程度，TLC展開(kāi)溶劑采用正丙醇∶甲醇∶水＝5∶2∶1。待乳果糖反應(yīng)完全后，往反應(yīng)液中加等體積95％乙醇，混合均勻，放入4℃冰箱中靜置30min，然后在7000轉(zhuǎn)/分下離心30min，上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液采用硅膠色譜柱純化，再經(jīng)冷凍干燥即為純品。
【專利說(shuō)明】
一種α-2，3唾液酸化乳果糖制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于功能性寡糖制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種α-2，3唾液酸化乳果糖制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在醫(yī)療領(lǐng)域，唾液酸寡糖作為抗菌劑的潛力是非常大的。另外，唾液酸在細(xì)胞膜上的表達(dá)還與腫瘤的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)聯(lián)。唾液酸的類似物Zanami vir和Tamiflu已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)治療流感的新藥。
[0003]現(xiàn)有的研究結(jié)果表明唾液酸在生物體許多生命現(xiàn)象中發(fā)揮著極為重要的作用，特別是在與唾液酸有關(guān)的功能性寡糖劑方面的研究正方興未艾。因此，對(duì)唾液酸化寡糖的合成及以天然產(chǎn)物為母體進(jìn)行唾液酸化修飾，以及相關(guān)的生物活性研究在化學(xué)和生物學(xué)界形成了一個(gè)熱點(diǎn)，每年都有大量相關(guān)的研究工作報(bào)道。利用病毒對(duì)唾液酸寡糖有識(shí)別能力的特性，以有免疫活性的乳果糖為母體進(jìn)行唾液酸糖苷化，得到的唾液酸修飾的乳果糖類新型低聚糖是很有潛力的免疫活性寡糖，對(duì)它們的功能性研究具有非常重要的科學(xué)和民生意義。正是根據(jù)市場(chǎng)的需求，經(jīng)過(guò)不斷實(shí)驗(yàn)和探索，我們發(fā)明了一種α_2，3唾液酸化乳果糖制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是克服了用化學(xué)方法對(duì)乳果糖進(jìn)行唾液酸糖基化非常困難的問(wèn)題。這是因?yàn)橥僖核崽擒栈磻?yīng)條件較一般糖苷化反應(yīng)苛刻，立體選擇性通常較差，端基碳的立體構(gòu)型較難控制，唾液酸糖苷化反應(yīng)產(chǎn)率差，很難制備。利用最近發(fā)展的酶法對(duì)乳果糖進(jìn)行唾液酸糖基化修飾，利用高效的酶法合成制備技術(shù)，能夠成功的制備出一種α-2，3唾液酸化乳果糖。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種α-2，3唾液酸化乳果糖制備方法，其特征在于:乳果糖40重量份，三磷酸胞苷鈉(CTP)90?110重量份，唾液酸，S卩Neu5Ac，50?60重量份，溶于3000重量份超純水中，用3摩爾/升的NaOH調(diào)pH8.5，加入I摩爾/升的pH8.5的Tris-HCl，使其在反應(yīng)體系中的濃度為100毫摩爾/升；2摩爾/升的MgCl2,使其在反應(yīng)體系中的濃度為20毫摩爾/升；I?1.5重量份的CMP-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(NmCSS) '2?2.5重量份的α-2，3唾液酸苷轉(zhuǎn)移酶，S卩PmST1。然后將混合物放入37°C氣浴振蕩器中，反應(yīng)18?30小時(shí)。采用硅膠薄層層析(TLC)檢測(cè)反應(yīng)程度，TLC展開(kāi)溶劑采用正丙醇:甲醇:水= 5:2:1。待乳果糖反應(yīng)完全后，往反應(yīng)液中加等體積95%乙醇，混合均勻，放入4°C冰箱中靜置30min，然后在7000轉(zhuǎn)/分下離心30min，上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液采用硅膠色譜柱純化。純化溶劑的比例為乙酸乙酯:甲醇:水= 6:2:1。收集純化后的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并冷凍干燥即為純品。采用質(zhì)譜和核磁共振鑒定純品的分子量以及結(jié)構(gòu)，通過(guò)質(zhì)譜鑒定分子量(見(jiàn)附圖1)，附圖1中橫坐標(biāo)(m/z)是質(zhì)荷比，縱坐標(biāo)(relative abundance)是相對(duì)豐度，能夠鑒定出本發(fā)明制備出的純品分子量為632(由于質(zhì)譜測(cè)定采用負(fù)離子模式，所以質(zhì)譜圖上顯示分子量的數(shù)據(jù)為631)，與一種α-2，3唾液酸化乳果糖分子量632相同，說(shuō)明本發(fā)明制備出的純品是一種α-2，3唾液酸化乳果糖;通過(guò)核磁共振鑒定分子結(jié)構(gòu)(見(jiàn)附圖2)，附圖2中橫坐標(biāo)fl(ppm)是化學(xué)位移，縱坐標(biāo)是吸收峰的強(qiáng)度，能夠鑒定出本發(fā)明制備出的純品分子結(jié)構(gòu)為一種α-2，3唾液酸化乳果糖，說(shuō)明本發(fā)明的一種α-2，3唾液酸化乳果糖制備成功。一種α-2，3唾液酸化乳果糖的結(jié)構(gòu)如下:
【附圖說(shuō)明】
[0006]圖1為本發(fā)明的一種α-2，3唾液酸化乳果糖質(zhì)譜圖。
[0007]圖2為本發(fā)明的一種一種α_2，3唾液酸化乳果糖核磁共振1H譜圖。
[0008]圖3為本發(fā)明的一種一種α_2，3唾液酸化乳果糖核磁共振13C譜圖。
[0009]圖4一種α-2，3唾液酸化乳果糖的結(jié)構(gòu)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1
[00?1 ] 原料配方乳果糖40mg，三磷酸胞苷鈉(CTP)95mg，唾液酸(Neu5Ac)53mg，溶于3000mg超純水中，用3摩爾/升的NaOH調(diào)pH8.5，加入I摩爾/升的pH8.5的Tris-HCl，使其在反應(yīng)體系中的濃度為100毫摩爾/升；2摩爾/升的MgCl2,使其在反應(yīng)體系中的濃度為20毫摩爾/升；Img的CMP-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(NmCSS) ;2mg的唾液酸苷轉(zhuǎn)移酶，即PmSTuS后將混合物放入37°C氣浴振蕩器中，反應(yīng)20小時(shí)。采用硅膠薄層層析(TLC)檢測(cè)反應(yīng)程度，TLC展開(kāi)溶劑采用正丙醇:甲醇:水= 5:2:1。待乳果糖反應(yīng)完全后，往反應(yīng)液中加等體積95%乙醇，混合均勻，放入4°C冰箱中靜置30min，然后在7000轉(zhuǎn)/分下離心30min，上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液采用硅膠色譜柱純化。純化溶劑的比例為乙酸乙酯:甲醇:水= 6:2:1。收集純化后的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并冷凍干燥即為成品。最后得到的一種α_2，3唾液酸化乳果糖純品采用質(zhì)譜和核磁鑒定結(jié)構(gòu)。
[0012]實(shí)施例2
[0013]乳果糖40mg，三磷酸胞苷鈉(CTP) IlOmg，唾液酸(Neu5Ac )60mg，溶于3000mg超純水中，用3摩爾/升的NaOH調(diào)pH8.5，加入I摩爾/升的pH8.5的Tris-HCl，使其在反應(yīng)體系中的濃度為10mM； 2摩爾/升的MgCl2，使其在反應(yīng)體系中的濃度為20毫摩爾/升；1.5mg的CMP-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(NmCSS); 2.5mg的唾液酸苷轉(zhuǎn)移酶(PmSTi)。然后將混合物放入37 °C氣浴振蕩器中，反應(yīng)24小時(shí)。采用硅膠薄層層析(TLC)檢測(cè)反應(yīng)程度，TLC展開(kāi)溶劑采用正丙醇:甲醇:水=5: 2:1。待乳果糖反應(yīng)完全后，往反應(yīng)液中加等體積95%乙醇，混合均勻，放入4°C冰箱中靜置30min，然后在7000轉(zhuǎn)/分下離心30min，上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液采用硅膠色譜柱純化。純化溶劑的比例為乙酸乙酯:甲醇:水=6:2:1。收集純化后的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并冷凍干燥即為成品。最后得到的一種α_2，3唾液酸化乳果糖純品采用質(zhì)譜和核磁鑒定結(jié)構(gòu)。
[0014]實(shí)施例3
[0015]乳果糖40mg，三磷酸胞苷鈉(CTP)90mg，唾液酸(Neu5Ac) 5 Omg，溶于3000mg超純水中，用3摩爾/升的NaOH調(diào)pH8.5，加入I摩爾/升的pH8.5的Tris-HCl，使其在反應(yīng)體系中的濃度為100毫摩爾/升;2摩爾/升的MgCl2，使其在反應(yīng)體系中的濃度為20毫摩爾/升；1.2mg的CMP-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，即NmCSS ； 2.3mg的唾液酸苷轉(zhuǎn)移酶，即PmST1。然后將混合物放入37 °C氣浴振蕩器中，反應(yīng)26小時(shí)。采用硅膠薄層層析(TLC)檢測(cè)反應(yīng)程度，TLC展開(kāi)溶劑采用正丙醇:甲醇:水=5: 2:1。待乳果糖反應(yīng)完全后，往反應(yīng)液中加等體積95%乙醇，混合均勻，放入4°C冰箱中靜置30min，然后在7000轉(zhuǎn)份下離心30min，上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液采用硅膠色譜柱純化。純化溶劑的比例為乙酸乙酯:甲醇:水=6: 2:1。收集純化后的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并冷凍干燥即為成品。最后得到的一種α_2，3唾液酸化乳果糖純品采用質(zhì)譜和核磁鑒定結(jié)構(gòu)。
[0016]實(shí)施例4
[0017]乳果糖40mg，三磷酸胞苷鈉(CTP) 10mg，唾液酸(Neu5Ac )56mg，溶于3000mg超純水中，用3摩爾/升的NaOH調(diào)pH8.5，加入I摩爾/升的pH8.5的Tris-HCl，使其在反應(yīng)體系中的濃度為100毫摩爾/升;2摩爾/升的MgCl2，使其在反應(yīng)體系中的濃度為20毫摩爾/升；1.4mg的CMP-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，即NmCSS; 2.4mg的唾液酸苷轉(zhuǎn)移酶，即PmST1。然后將混合物放入37 °C氣浴振蕩器中，反應(yīng)28小時(shí)。采用硅膠薄層層析(TLC)檢測(cè)反應(yīng)程度，TLC展開(kāi)溶劑采用正丙醇:甲醇:水=5: 2:1。待乳果糖反應(yīng)完全后，往反應(yīng)液中加等體積95%乙醇，混合均勻，放入4°C冰箱中靜置30min，然后在7000轉(zhuǎn)/分下離心30min，上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液采用娃膠色譜柱純化。純化溶劑的比例為乙酸乙酯:甲醇:水=6: 2:1。收集純化后的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并冷凍干燥即為成品。最后得到的一種α_2，3唾液酸化乳果糖純品采用質(zhì)譜和核磁鑒定結(jié)構(gòu)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種α-2，3唾液酸化乳果糖制備方法，其特征在于:乳果糖40重量份，三磷酸胞苷鈉(CTP)90?110重量份，唾液酸(Neu5Ac)50?60重量份，溶于3000重量份超純水中，用3摩爾/升的NaOH調(diào)pH8.5，加入I摩爾/升的pH8.5的Tris-HCl，使其在反應(yīng)體系中的濃度為100毫摩爾/升;2摩爾/升的MgCl2，使其在反應(yīng)體系中的濃度為20暈?zāi)?升；I?1.5重量份的CMP-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(NmCSS); 2?2.5重量份的唾液酸苷轉(zhuǎn)移酶，即PmSTlt3然后將混合物放入37°C氣浴振蕩器中，反應(yīng)18?30小時(shí)。2.—種權(quán)利要求1所述的α-2，3唾液酸化乳果糖制備方法，其特征還包括以下純化步驟:采用硅膠薄層層析(TLC)檢測(cè)反應(yīng)程度，TLC展開(kāi)溶劑采用正丙醇:甲醇:水= 5:2:1。待乳果糖反應(yīng)完全后，往反應(yīng)液中加等體積95%乙醇，混合均勻，放入4°C冰箱中靜置30min，然后在7000轉(zhuǎn)/分下離心30min，上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液采用硅膠色譜柱純化。純化溶劑的比例為乙酸乙酯:甲醇:水=6: 2:1。收集純化后的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并冷凍干燥即為純品。
【文檔編號(hào)】C07H7/033GK105949250SQ201610290375
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年4月26日
【發(fā)明人】曾潔, 高海燕, 賈甜, 胡雅婕, 張瑞瑤, 孫俊良, 李光磊, 張軍合
【申請(qǐng)人】河南科技學(xué)院