一種鷹嘴豆蛋白粉和低聚肽粉及制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鷹嘴豆蛋白粉和低聚肽粉及制備方法和用途。所述鷹嘴豆蛋白粉的含量大于90wt％；鷹嘴豆低聚肽粉的肽含量不低于80wt％，其中85％以上肽分子量小于1500Dalton。所述方法包括將帶皮的鷹嘴豆粉碎并與有機(jī)溶劑混合處理；堿提酸沉法提取蛋白質(zhì)；分離純化等步驟。所述蛋白粉和低聚肽粉可用于治療或預(yù)防自由基過多引起的癥狀。本發(fā)明的制備方操作簡便，高收率低成本，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，工藝綠色環(huán)保，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】
一種鷹嘴豆蛋白粉和低聚肽粉及制備方法和用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明提供種高純度鷹嘴豆蛋白粉及其低聚肽粉的高效制備工藝，屬于生物工程 植物蛋白深加工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鷹嘴豆（Cicer arietinum L)，為蝶形花科草本植物，別名桃爾豆、雞豆、雞心豆 等，是印度和巴基斯坦的重要的蔬菜之一，在歐洲食用鷹嘴豆也十分普遍，也是維吾爾醫(yī)常 用藥材。維吾爾族用它治療支氣管炎、黏膜炎、霍亂、便秘痢疾、消化不良、腸胃氣脹、毒蛇咬 傷、糖尿病、性欲降低、皮膚瘙癢、高脂血癥、中暑等疾病。在中醫(yī)上，鷹嘴豆可以調(diào)節(jié)濕度， 有止瀉、解毒、壯身等作用。鷹嘴豆所含的營養(yǎng)成分非常豐富，無論是從種類，還是數(shù)量上， 都大大超過其他豆類。它含有18以上的氨基酸(含人體必須但自身不能合成的全部8種氨基 酸），多種營養(yǎng)元素和微量元素，如:鈣、羅、鋅、鎂、磷等。特別是每百克鷹嘴豆所含的鈣高達(dá) 350毫克，磷320毫克，高于大部分豆類，鐵的含量達(dá)47毫克，比其它豆類高出90%，維生素 C、 B1、B2含量高達(dá)12毫克，膳食纖維含量更高于其它。據(jù)報(bào)道，鷹嘴豆含有豐富的蛋白質(zhì)，高達(dá) 20%，其中球蛋白和清蛋白分別占總蛋白的42.16%和39.76%。球蛋白和清蛋白是人體非 常重要的營養(yǎng)物質(zhì)，可以起到提升免疫力的作用。
[0003] 鷹嘴豆蛋白因其氨基酸組成均衡、生物利用率高和抗?fàn)I養(yǎng)因子低而被作為植物蛋 白的重要來源。目前對于鷹嘴豆蛋白的分離純化、營養(yǎng)價(jià)值、功能性質(zhì)以及其被水解后制成 具有抑制血管緊縮素-I轉(zhuǎn)移酶(ACE)、抗氧化、抗腫瘤以及抗過敏活力的鷹嘴豆肽方面均有 報(bào)道。張濤等人將鷹嘴豆粉碎去皮并使用石油醚脫脂制備得到純度為90%以上的鷹嘴豆蛋 白，石油醚的使用在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中不易實(shí)現(xiàn)，殘留在產(chǎn)品中的石油醚影響人體健康;我 們實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)使用冷榨或者熱榨方法將去皮后的鷹嘴豆脫脂后，再使用堿提酸沉法制備蛋 白質(zhì)的純度(60%左右)很不理想。專利CN 104789629A公開了將鷹嘴豆浸泡去皮烘干粉碎， 使用堿提酸沉法獲得蛋白質(zhì)，再使用兩步酶解獲得的蛋白酶解液，最后經(jīng)兩次陶瓷膜純化 獲得低聚肽粉，獲得的蛋白質(zhì)和低聚肽的最高含量均不超過80%;將鷹嘴豆浸泡后種皮由 于非常堅(jiān)韌很難去除，因此在大型生產(chǎn)中去皮也很難實(shí)現(xiàn)；由于陶瓷膜膜表面積較小，造成 純化時(shí)膜通量下降較快，延長了膜純化時(shí)間，增加了生產(chǎn)成本。專利CN 104761617A中發(fā)明 人使用C18反相柱層析制備鷹嘴豆多肽，反相柱層析的成本高，在實(shí)際生產(chǎn)中不易實(shí)現(xiàn)。專 利CN 103525891B中將鷹嘴豆蛋白酶解液滅活離心后未將酶解液中的雜質(zhì)徹底清除，直接 使用6kDa和2kDa的超濾膜進(jìn)行純化，這樣容易造成超濾膜阻塞引起膜效率下降，同時(shí)發(fā)明 人沒有測定肽的分子量和純度。專利CN 103168913B和CN 103194517B使用多種復(fù)合酶多步 酶解獲得鷹嘴豆多肽，未進(jìn)行純化步驟，可見制備的只是粗肽。專利CN 103172706B和CN 102391361B公開了鷹嘴豆多肽的制備方法，工藝包括脫脂、蛋白酶水解、凝膠層析分離，凝 膠層析色譜的使用由于高成本，不能用于大規(guī)模生產(chǎn)。專利CN 102028036A將鷹嘴豆自然發(fā) 酵，再進(jìn)行酶解獲得多肽，自然發(fā)酵容易造成其它菌種的影響，不夠穩(wěn)定。專利CN 101962399A和CN101602799A公開的蛋白和多肽的制備工藝均用磷酸鹽緩沖液提取、硫酸銨 沉淀，但存在蛋白利用率低、制備多肽的效率偏低的缺點(diǎn)。綜上所述，以上專利大多存在原 料利用率低，工藝復(fù)雜，難以應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的缺點(diǎn)。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本專利提供了適合大規(guī)模生產(chǎn)的高純度鷹嘴豆蛋白粉的制 備工藝，同時(shí)也提供了獲得比原蛋白在營養(yǎng)、功能性及生物活性上更加優(yōu)良、純度較高的鷹 嘴豆低聚肽粉的制備方法。本專利彌補(bǔ)了高純度鷹嘴豆蛋白粉及其低聚肽粉在制備工藝上 的欠缺。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開了一種高純度鷹嘴豆蛋白粉及其低聚肽粉的高效制備工藝，將鷹嘴豆 粉碎后，使用特殊技術(shù)獲得高純度鷹嘴豆蛋白粉，并且通過一定工藝酶解后，獲得純度較高 的低聚肽粉。該生產(chǎn)方法是經(jīng)過長期的生產(chǎn)實(shí)踐和科學(xué)研究而總結(jié)出來的，該工藝的特點(diǎn) 在于工藝簡單、經(jīng)濟(jì)、綠色環(huán)保，尤其適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供了一種鷹嘴豆低聚肽粉，其采用GB/T22492-2008附錄B中 的多肽測定法和GB/T 22492-2008附錄A中的肽相對分子質(zhì)量分布的測定法，肽含量不低于 80wt%，其中85%以上肽分子量小于1500Da 1 ton，其分子量分布如下所示：
[0007] 分子量Dalton分布
[0009]本發(fā)明的目的在于提供所述鷹嘴豆低聚肽粉的制備方法，包括下述步驟:將帶皮 的鷹嘴豆粉碎并與有機(jī)溶劑混合處理;使用堿提酸沉法得到蛋白沉淀物;蛋白沉淀物酶解； 分離純化得到低聚肽粉;優(yōu)選地，所述的堿提酸沉法可以為逆流提取法或者普通提取法。 [0010] 優(yōu)選地，包括下述步驟：
[0011] (1)將帶皮的鷹嘴豆粉碎，過24目以上篩網(wǎng)從而獲得鷹嘴豆粉，將鷹嘴豆粉與有機(jī) 溶劑按質(zhì)量比為1:3~1:10混合，室溫?cái)嚢?0~60min，離心過濾，豆渣按以上步驟再次處理 1~2次，最后離心過濾后得到豆渣；
[0012] (2)將步驟（1)中的豆渣與其質(zhì)量比為1:5~1:20的純化水混合，調(diào)節(jié)pH至8~10， 室溫提取1~2h，提取完成后離心過濾，得到濾液；
[0013] (3)調(diào)節(jié)（2)中濾液的pH為3~5，離心棄去上清液，再使用pH為3~5純化水清洗沉 淀物1~2次，得到蛋白沉淀物；
[0014] (4)將步驟(3)中的蛋白沉淀物中加入體積比為1:5~1:15的純化水，攪拌均勻復(fù) 溶，將蛋白復(fù)溶液加熱至40~55 °C，加入鷹嘴豆粉質(zhì)量的Ο . 1~1 %蛋白酶，攪拌酶解4~6h 后，煮沸滅活10~30min，離心，上清液即為蛋白酶解液；
[0015] (5)將步驟(4)中的蛋白酶解液使用孔徑為0.1~0.5μπι的微濾膜進(jìn)行過濾，透過液 再經(jīng)2000~20000Dalton超濾膜處理后，將超濾膜透過液濃縮、干燥后，得到乳白色鷹嘴豆 低聚肽粉，所述微濾膜和超濾膜均為卷式膜。
[0016] 優(yōu)選地，本發(fā)明將鷹嘴豆粉碎、過篩，使用堿提酸沉法提取蛋白質(zhì)，離心過濾，得到 蛋白沉淀物;將蛋白沉淀物加水復(fù)溶、酶解，依次經(jīng)過微濾膜與超濾膜高效分離純化、濃縮， 最后將蛋白復(fù)溶液和酶解濃縮液干燥，得到白色鷹嘴豆蛋白粉和乳白色鷹嘴豆低聚肽粉。 鷹嘴豆蛋白的收率不少于8%，含量大于90wt% ;鷹嘴豆低聚肽粉的收率在5~7%，肽含量 不低于80wt%，其中85%以上肽分子量小于1500Dalton。
[0017] 優(yōu)選地，所述的濃縮方法可以為膜濃縮、減壓濃縮或常壓濃縮;所述的干燥方法可 以為噴霧干燥、真空干燥、加熱干燥或冷凍干燥。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種鷹嘴豆蛋白粉，其是通過下述方法制備得到：
[0019] (1)將帶皮的鷹嘴豆粉碎，過24目以上篩網(wǎng)從而獲得鷹嘴豆粉，將鷹嘴豆粉與有機(jī) 溶劑按質(zhì)量比為1:3~1:10混合，室溫?cái)嚢?0~60min，離心過濾，豆渣按以上步驟再次處理 1~2次，最后離心過濾后得到豆渣；
[0020] (2)將步驟（1)中的豆渣與其質(zhì)量比為1:5~1:20的純化水混合，調(diào)節(jié)pH至8~10， 室溫提取1~2h，提取完成后離心過濾，得到濾液；
[0021] (3)調(diào)節(jié)(2)中濾液的pH為3~5,離心棄去上清液，再使用pH為3~5純化水清洗沉 淀物1~2次，得到蛋白沉淀物;干燥，得到白色鷹嘴豆蛋白粉。
[0022] 優(yōu)選地，得到高純度白色鷹嘴豆蛋白粉，產(chǎn)率可達(dá)8%以上，含量為90wt %以上； [0023]優(yōu)選地，得到乳白色鷹嘴豆低聚肽粉，產(chǎn)率可達(dá)5~7 %，并測得肽含量在80wt %以 上，90 %以上分子量分布在1500Dalton以下，其分子量分布如下所不：
[0024] 分子量Dalton分布
[0026]所述步驟（1)中的有機(jī)溶劑可以為醇類、脂類、醚類、烷烴類的一種或者它們的混 合物，優(yōu)選地使用乙醇溶液。
[0027]所述乙醇溶液配制使用的乙醇為食品級乙醇，乙醇溶液體積濃度為50%以上，優(yōu) 選地使用體積濃度為90 %以上的乙醇溶液。
[0028]優(yōu)選地，所述蛋白酶選自食品級的中性蛋白酶（酶活力多20萬u/g)、木瓜蛋白酶 (酶活力多40萬u/g)、菠蘿蛋白酶(酶活力多30萬u/g)、堿性蛋白酶(酶活力多20萬u/g)、胃 蛋白酶(酶活力多50萬u/g)、胰酶(酶活力多3000u/g)中的一種或者它們的混合物，優(yōu)選地 使用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種或者它們的混合物。
[0029]所述的蛋白粉的檢測方法為國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5-2010中的凱氏定氮法。
[0030]所述的多肽含量檢測方法為國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22492-2008附錄B中的多肽測定法。 [0031]所述的多肽相對分子量分布的檢測方法為國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T22492-2008附錄A中的肽 相對分子質(zhì)量分布的測定法。
[0032] 本發(fā)明還提供了一種組合物，其含有本發(fā)明所述的鷹嘴豆蛋白粉及其低聚肽粉， 藥物或食品上可接受的助劑。
[0033] 所述的組合物的劑型選自素片、薄膜包衣片、糖衣片、腸衣片、分散片、膠囊、顆粒 劑、口服溶液或口服混懸液。
[0034] 所述的鷹嘴豆低聚粉可用于制備治療或預(yù)防自由基過多引起的癥狀的藥物、食品 或保健品的應(yīng)用。
[0035]所述的鷹嘴豆低聚肽粉的抗氧化活性使用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除 法、超氧陰離子自由基清除法(SRSA)以及Fe3+還原能力法(FRAP)四種方法得以驗(yàn)證，測試 結(jié)果表明鷹嘴豆低聚肽粉具有較好的抗氧化活性。
[0036]本發(fā)明的優(yōu)勢在于：
[0037] 1、鷹嘴豆浸泡后種皮由于非常堅(jiān)韌很難去除，難以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明所述 制備方法中，將粉碎的鷹嘴豆與有機(jī)溶劑混合處理，使得鷹嘴豆不需提起去皮，適合于工業(yè) 化生產(chǎn)。
[0038] 2、現(xiàn)有技術(shù)中的方法一般需要經(jīng)過多次酶解，且生產(chǎn)一個(gè)產(chǎn)品需要3種以上的酶 才能實(shí)現(xiàn)，由于生產(chǎn)前需要對酶活力逐一測定，因此增加了成本。本發(fā)明的制備工藝中僅使 用一種酶，通過一次酶解即可完成;另外，本發(fā)明也沒有使用現(xiàn)有技術(shù)中經(jīng)常使用的凝膠色 譜柱，降低了成本，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0039] 3、現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行純化時(shí)，一般采用的膜材質(zhì)為陶瓷管式膜，比表面積小，單位時(shí)間 內(nèi)膜的流速下降快，造成過膜時(shí)間長，生產(chǎn)成本高。本發(fā)明所述方法使用了卷式膜，膜面積 大，單位時(shí)間內(nèi)流速下降比管式膜慢很多，從而節(jié)約了過膜時(shí)間，降低了成本。
[0040] 4、本發(fā)明的方法同時(shí)制備得到了蛋白粉和低聚肽粉，肽含量在80wt%以上，與現(xiàn) 有技術(shù)中的肽粉相比具有更強(qiáng)的自由基清楚能力。
[0041] 5、本發(fā)明所得低聚肽粉未經(jīng)活性碳脫色，即可直接得到乳白色肽粉。
【附圖說明】
[0042] 圖1:中性蛋白酶制得肽粉液相色譜圖；
[0043] 圖2:木瓜蛋白酶制得肽粉液相色譜圖。 實(shí)施例
[0044] 下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明實(shí)施例所述方法 僅僅是用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對本發(fā)明制備方 法的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例中用到的所有原料和溶劑均購自 Sigma Biochemical and Organic Compounds for Research and Diagnostic Clinical Reagents 公司。
[0045] 實(shí)施例1:
[0046] 將帶皮鷹嘴豆直接粉碎，過24目以上篩網(wǎng)從而獲得鷹嘴豆粉。將100kg鷹嘴豆粉與 體積濃度為95%乙醇溶液按質(zhì)量比為1:3混合，室溫?cái)嚢?0min，完成后，離心過濾，豆渣按 以上步驟再次處理一遍，離心過濾;將豆渣與其質(zhì)量比為1:8的純化水混合，調(diào)節(jié)pH至9.5， 室溫提取lh，提取完成后離心過濾，棄去濾渣，濾液待用；調(diào)節(jié)濾液的pH為3,離心棄去上清 液，再使用pH為3純化水清洗蛋白沉淀物一遍;沉淀物經(jīng)冷凍干燥后，得到白色鷹嘴豆蛋白 粉，產(chǎn)率為8.4%，含量為91.6wt%。
[0047] 實(shí)施例2:
[0048]將帶皮鷹嘴豆直接粉碎，過24目以上篩網(wǎng)從而獲得鷹嘴豆粉。將100kg鷹嘴豆粉與 體積濃度為90%乙醇溶液按質(zhì)量比為1:5混合，室溫?cái)嚢?0min，完成后，離心過濾，豆渣按 以上步驟再次處理一遍，離心過濾;將豆渣與其質(zhì)量比為1:10的純化水混合，調(diào)節(jié)pH至9,室 溫提取lh，提取完成后離心過濾，棄去濾渣，濾液待用；調(diào)節(jié)濾液的pH為3.5,離心棄去上清 液，再使用pH為3.5純化水清洗蛋白沉淀物兩遍;沉淀物經(jīng)冷凍干燥后，得到白色鷹嘴豆蛋 白粉，產(chǎn)率為8.2%，含量為92.7wt%。
[0049] 實(shí)施例3:
[0050]將帶皮鷹嘴豆直接粉碎，過24目以上篩網(wǎng)從而獲得鷹嘴豆粉。將100kg鷹嘴豆粉與 體積濃度為95%乙醇溶液按質(zhì)量比為1:3混合，室溫?cái)嚢?0min，完成后，離心過濾，豆渣按 以上步驟再次處理一遍，離心過濾;將豆渣與其質(zhì)量比為1:8的純化水混合，調(diào)節(jié)pH至9.5， 室溫提取lh，提取完成后離心過濾，棄去濾渣，濾液待用；調(diào)節(jié)濾液的pH為3,離心棄去上清 液，再使用pH為3純化水清洗蛋白沉淀物一遍;在清洗后的蛋白沉淀物中加入體積比為1: 5 的純化水，攪拌均勻復(fù)溶，將蛋白復(fù)溶液加熱至45°C，加入鷹嘴豆粉質(zhì)量的0.2 %中性蛋白 酶(酶活力為40萬u/g)，攪拌酶解4h后，煮沸滅活10min，離心，上清液即為蛋白酶解液;將蛋 白酶解液使用孔徑為〇. 5μπι的微濾膜進(jìn)行過濾，透過液再經(jīng)5000Dalton超濾膜處理后，其透 過液濃縮、干燥后，得到乳白色鷹嘴豆低聚肽粉，產(chǎn)率可達(dá)6.3%，并測得肽含量為81.4%， 至少97.33%以上分布在1500Dalton分子量以下，如表1所示。
[0051]表1中性蛋白酶所制備得鷹嘴豆肽粉的分子量分布
[0053] 實(shí)施例4:
[0054] 將帶皮鷹嘴豆直接粉碎，過24目以上篩網(wǎng)從而獲得鷹嘴豆粉。將100kg鷹嘴豆粉與 體積濃度為95%乙醇溶液按質(zhì)量比為1:3混合，室溫?cái)嚢?0min，完成后，離心過濾，豆渣按 以上步驟再次處理一遍，離心過濾;將豆渣與其質(zhì)量比為1:8的純化水混合，調(diào)節(jié)pH至9.5， 室溫提取lh，提取完成后離心過濾，棄去濾渣，濾液待用；調(diào)節(jié)濾液的pH為3,離心棄去上清 液，再使用pH為3純化水清洗蛋白沉淀物一遍;在清洗后的蛋白沉淀物中加入體積比為1: 5 的純化水，攪拌均勻復(fù)溶，將蛋白復(fù)溶液加熱至50°C，加入鷹嘴豆粉質(zhì)量的0.5%木瓜蛋白 酶(酶活力為50萬u/g)，攪拌酶解6h后，煮沸滅活lOmin，離心，上清液即為蛋白酶解液;將蛋 白酶解液使用孔徑為〇. 5μπι的微濾膜進(jìn)行過濾，透過液再經(jīng)5000Dalton超濾膜處理后，其透 過液濃縮、干燥后，得到乳白色鷹嘴豆低聚肽粉，產(chǎn)率可達(dá)5.2%，并測得肽含量為83.0%， 至少89.57%以上分布在1500Dalton分子量以下，如表2所示。
[0055] 表2木瓜蛋白酶所制備得鷹嘴豆肽粉的分子量分布
[0058] 對比實(shí)施例（專利CN104789629A所提供的方法）：
[0059] 將鷹嘴豆用溫水浸泡16小時(shí)，去皮，37°C烘干20h，打碎成粉狀，過60目篩，得到鷹 嘴豆粉，將lkg鷹嘴豆粉與10L水混合均勻，30°C保溫?cái)嚢?0min，用10 %氫氧化鈉溶液調(diào)pH 為10，離心收集上清液;調(diào)節(jié)所述上清液用1:1的鹽酸將pH調(diào)至4，30 °C攪拌30min，離心收集 沉淀，攪拌、離心，將沉淀與水按質(zhì)量比為1:4混合后，再次在30°C攪拌30min，離心，收集沉 淀，得到鷹嘴豆蛋白沉淀物;將鷹嘴豆蛋白按質(zhì)量體積比為1:10,加水2L攪拌均勻，用10% 氫氧化鈉調(diào)pH值為10，加入堿性蛋白酶進(jìn)行第一次酶解，堿性蛋白酶的用量為200u/g，酶解 時(shí)間為60min，得到第一酶解液;調(diào)節(jié)所述第一酶解液的pH為7,加入中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白 酶復(fù)合酶進(jìn)行第二次酶解，中性蛋白酶用量為200u/g，風(fēng)味蛋白酶用量為100u/g，酶解時(shí)間 為300min;將酶解液溫度升至95°C，維持15min，然后冷卻至室溫，離心分離，收取上清液，制 得酶解液;酶解液經(jīng)5000rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，將上清液用500nm陶瓷膜進(jìn)行粗濾，收集透過 液，再用50nm陶瓷膜進(jìn)行精濾，透過液濃縮后，加入3g活性炭，脫色30min，過濾除去活性炭， 最后經(jīng)噴霧干燥制成肽粉，產(chǎn)率為4.6%，并測得肽含量為74.3%。通過本對比實(shí)驗(yàn)可知，鷹 嘴豆經(jīng)浸泡后，豆皮堅(jiān)韌很難去除，使用此方法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)較難實(shí)現(xiàn);酶解時(shí)至少需要 3種蛋白酶，酶活力需逐一測定，因而大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)增加了成本;陶瓷膜為管式膜，比表面積 小，單位時(shí)間內(nèi)膜的流速下降快，造成過膜時(shí)間長，因而大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)成本高;使用活性炭 脫色時(shí)，活性炭會吸附一部分肽，造成產(chǎn)率不高;此方法的產(chǎn)品的低聚肽含量較低，仍有提 尚的空間。
[0060] 生物活性實(shí)施例1:
[0061 ] FRAP Fe3+還原能力測定實(shí)驗(yàn)
[0062] l、FeCl3溶液（20mmol/L):準(zhǔn)確稱取FeCl3 · 6H20固體108mg于20mL的棕色容量瓶 中，加15mL蒸餾水超聲溶解后，蒸餾水定容。
[0063] 2、三吡啶三吖嗪（TPTZ，10mmol/L):準(zhǔn)確稱取三吡啶三吖嗪固體62.47mg于20mL的 棕色容量瓶中，加40mmol/L的HC1 15mL超聲溶解后，用40mmol/L的HC1定容。
[0064] 3、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(0.3mol/L):準(zhǔn)確稱取無水乙酸鈉24.6g于1000mL的容量 瓶中，加蒸餾水700mL超聲溶解后，加入冰乙酸80mL，震蕩混勻后，蒸餾水定容。
[0065] 4、FRAP工作液:0.3mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液、10mmol/L的三吡啶三吖嗪溶液和 20mmol/L的FeC13溶液以10:1:1的比例混合即得。
[0066] 5、供試品溶液的配制:精密稱取適量鷹嘴豆低聚肽粉，置于20mL棕色容量瓶中，加 入15mL蒸餾水，超聲溶解后，用蒸餾水定容，搖勻，即得。
[0067] 6、FeS〇4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取FeS〇4 · 7H20 27.8mg于50mL棕色容量瓶中，加 30mL蒸餾水，超聲5min，蒸餾水定容，搖勻，即得2mmol/L的FeS04溶液。精密移取0.5mL、2mL、 41111^、6111]^、81111^于1〇1111^掠色容量瓶中，蒸饋水定容，得11]11]1〇1/]^、4_〇1/]^、8_〇1/]^、121]11]1〇1/1^和 16mmol/L的FeS〇4溶液。分別準(zhǔn)確吸取200yL上述FeS04溶液至25mL比色管中，加入6mL FRAP 工作液，600yL的蒸餾水，混勻，37 °C水浴中反應(yīng)10min，于593nm處測定其吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線。
[0068] 7、樣品的測定:精密移取供試品溶液200yL于25mL比色管中，加入600yLFRAP工作 液，600yL蒸餾水，混勾后，37 °C水浴中反應(yīng)10min，于593nm處測定其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 計(jì)算其還原能力，測定結(jié)果如表3所示：
[0069]表3鷹嘴豆低聚粉還原能力的測定結(jié)果
[0071]由表3可知，兩種酶制備所得的鷹嘴豆低聚肽粉均具有較強(qiáng)的還原能力，中性蛋白 酶酶解產(chǎn)品活性略高。
[0072] 生物活性實(shí)施例2:
[0073] 1、DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)
[0074] 1. 1DPPH乙醇溶液的配制：精密稱取DPPH 4mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入50mL 乙醇，超聲30s，用乙醇定容至刻度，搖勾，待用。本品須現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0075] 1.2供試品溶液的配制：精密稱取適量鷹嘴豆低聚肽粉，置于50mL棕色容量瓶中， 加入30mL乙醇，超聲5min，用乙醇定容至刻度，搖勾，即得。
[0076] 1.3操作步驟:準(zhǔn)確吸取2mL供試品溶液和2mL DPPH溶液混合均勻;準(zhǔn)確吸取2mL供 試品溶液和2mL乙醇混合均勻;準(zhǔn)確吸取2mLDPPH溶液和2mL乙醇混合均勻，室溫放置30min， 在515nm波長處測定吸光度，并根據(jù)以下計(jì)算公式計(jì)算自由基清除率：
[0077] IR% = [l-(Ai-Aj)/A0]*100%；
[0078] 其中，Ai表示待測溶液和DPPH混合后溶液的吸光度；
[0079] Aj表示待測溶液和溶劑混合后溶液的吸光度；
[0080] A0表示DPPH和溶劑混合后溶液的吸光度。
[0081] 2、SRSA超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)
[0082] 2.10.1 moL/L PBS緩沖液(pH7.4)的配制：稱取氯化鈉80g，氯化鉀2g，磷酸二氫鉀 2.4g，三水合磷酸氫二鉀23. lg，置于1000mL燒杯中，加入600mL蒸餾水，攪伴使其溶解，用鹽 酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，待用。 [0083] 2.2150ymoL/L NBT溶液的配制：準(zhǔn)確稱取NBT 12.5mg置于100mL棕色容量瓶中，加 入蒸餾水，超聲使其溶解，并用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。
[0084] 2.360ymoL/L PMS溶液的配制：準(zhǔn)確稱取PMS 18.8mg，置于1000mL的容量瓶中，加 入蒸餾水，超聲使其溶解，并用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。
[0085] 2.4468ymoL/L NADH溶液的配制：準(zhǔn)確稱取NADH 33.9mg，置于100mL的容量瓶中， 加入蒸餾水，超聲使其溶解，并用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。
[0086] 2.5供試品溶液的配制：精密稱取適量鷹嘴豆低聚肽粉，置于20mL棕色容量瓶中， 加入15mL PBS緩沖液，超聲5min，用PBS緩沖液定容至刻度，搖勻，即得。
[0087] 2.6工作液的配制:取lmL 0.1moL/L PBS緩沖液(ρΗ7·4)于容量瓶中，加入lmL 150 ymoL/L NBT溶液，加入2mL 468ymoL/L NADH溶液，加入lmL 60ymoL/L PMS溶液，攪拌均勻， 25°C下反應(yīng)5min，與560nm波長處測定其吸光度值。
[0088] 2.7操作步驟:準(zhǔn)確吸取0.5mL供試品溶液和5mL上述工作溶液混合均勻;準(zhǔn)確吸取 0.5mL供試品溶液和5mL蒸餾水混合均勻;準(zhǔn)確吸取5mL上述工作溶液和0.5mL蒸餾水混合均 勻，立即在560nm處測定吸光度，并根據(jù)以下公式計(jì)算自由基清除率：
[0089] IR% = [l-(Ai-Aj)/A0]*100%；
[0090] 其中，Ai表示待測溶液和SRSA混合后溶液的吸光度；
[0091 ] Aj表示待測溶液和溶劑混合后溶液的吸光度；
[0092] A0表示SRSA和溶劑混合后溶液的吸光度。
[0093] 3、ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn)
[0094] 3.1PBS緩沖液的配制:稱取氯化鈉8g，氯化鉀0.2g，磷酸二氫鉀0.24g，十二水合磷 酸氫二鈉3.62g，置于lOOOmL燒杯中，加入800mL蒸餾水，攪伴使其溶解，用鹽酸或氫氧化鈉 調(diào)節(jié)pH至7.4，轉(zhuǎn)移至lOOOmL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，待用。
[0095] 3.2ABTS+貯存溶液的配制：精密稱取ABTS+78mg左右，置于20mL棕色容量瓶中，加入 15mL蒸餾水，超聲5min，用蒸餾水定容至刻度，搖勾。精密稱取過硫酸鉀76mg左右，置于2mL 棕色容量瓶中，加入lmL蒸餾水，超聲使其溶解，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。精確吸取352yL 過硫酸鉀溶液加入至ABTS溶液中，搖勻，靜置過夜。
[0096] 3.3ABTS+工作溶液的配制：精確吸取貯存溶液lmL，加入65mL左右PBS緩沖液，搖 勻。
[0097] 3.4供試品溶液的配制：精密稱取適量鷹嘴豆低聚肽粉，置于20mL棕色容量瓶中， 加入15mL PBS緩沖液，超聲5min，用PBS緩沖液定容至刻度，搖勻，即得。
[0098] 3.5操作步驟:準(zhǔn)確吸取0.5mL供試品溶液和5mL ABTS工作溶液混合均勻；準(zhǔn)確吸 取0.5mL供試品溶液和5mL PBS緩沖液混合均勻；準(zhǔn)確吸取5mL ABTS工作溶液和0.5mL PBS 緩沖液混合均勻，立即在734nm處測定吸光度，并根據(jù)以下公式計(jì)算自由基清除率：
[0099] IR% = [l-(Ai-Aj)/A0]*100%；
[0100] 其中，Ai表示待測溶液和ABTS混合后溶液的吸光度；
[0101 ] A j表示待測溶液和溶劑混合后溶液的吸光度；
[0102] A0表示ABTS和溶劑混合后溶液的吸光度。
[0103] 分別配制不同濃度的中性蛋白酶解產(chǎn)品和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)品、對比實(shí)施例酶解 產(chǎn)品進(jìn)行DPPH、SRSA以及ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn)，并測定其IC 5Q值，結(jié)果如表4所示：
[0104] 表4鷹嘴豆低聚粉自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0106]由表4可知，兩種酶制備所得的鷹嘴豆低聚肽粉均有較好的自由基清除活性。在 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中，中性蛋白酶酶解產(chǎn)品自由基清除能力明顯強(qiáng)于木瓜蛋白酶酶解產(chǎn) 品，而SRSA超氧陰離子實(shí)驗(yàn)中，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)品超氧陰離子清除效果顯著高于中性蛋 白酶酶解產(chǎn)品。兩種酶解產(chǎn)品對ABTS自由基清除能力相當(dāng)。可見酶解時(shí)酶的種類影響產(chǎn)品 低聚肽的生物活性。此外生物活性結(jié)果顯示對比實(shí)施例的酶解產(chǎn)品比本發(fā)明所述方法制備 所得的酶解產(chǎn)品活性弱，可見產(chǎn)品中肽的含量影響其生物活性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鷹嘴豆低聚肽粉，其特征在于：采用GB/T 22492-2008附錄B中的多肽測定法和 GB/T 22492-2008附錄A中的肽相對分子質(zhì)量分布的測定法，肽含量不低于80wt%，其中 85%以上肽分子量小于1500Dalton，其分子量分布如下所不： 分子量Dal ton分布數(shù)均分子量范圍：13~2050 重均分子量范圍：13~2260。2. 權(quán)利要求1所述鷹嘴豆低聚肽粉的制備方法，其特征在于包括下述步驟:將帶皮的鷹 嘴豆粉碎并與有機(jī)溶劑混合處理;使用堿提酸沉法得到蛋白沉淀物;蛋白沉淀物酶解;所述 的堿提酸沉法可以為連續(xù)逆流提取法或者普通提取法。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于包括下述步驟： (1) 將帶皮的鷹嘴豆粉碎，過24目以上篩網(wǎng)從而獲得鷹嘴豆粉，將鷹嘴豆粉與有機(jī)溶劑 按質(zhì)量比為1:3~1:10混合，室溫?cái)嚢?0~60min，離心過濾，豆渣按以上步驟再次處理1~2 次，最后離心過濾后得到豆渣； (2) 將步驟（1)中的豆渣與其質(zhì)量比為1:5~1: 20的純化水混合，調(diào)節(jié)pH至8~10，室溫 提取1~2h，提取完成后離心過濾，得到濾液； (3) 調(diào)節(jié)(2)中濾液的pH為3~5，離心棄去上清液，再使用pH為3~5純化水清洗沉淀物1 ~2次，得到蛋白沉淀物； (4) 將步驟(3)中的蛋白沉淀物中加入體積比為1:5~1:15的純化水，攪拌均勻復(fù)溶，將 蛋白復(fù)溶液加熱至40~55°C，加入鷹嘴豆粉質(zhì)量的0.1~1 %蛋白酶，攪拌酶解4~6h后，煮 沸滅活10~30min，離心，上清液即為蛋白酶解液； (5) 將步驟(4)中的蛋白酶解液使用孔徑為0.1~0.5μπι的微濾膜進(jìn)行過濾，再經(jīng)2000~ 20000Dalton超濾膜處理后，將超濾膜透過液濃縮、干燥后，得到乳白色鷹嘴豆低聚肽粉，所 述微濾膜和超濾膜均為卷式膜。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述的濃縮方法選自膜濃縮、減壓濃 縮或常壓濃縮;所述的干燥方法選自噴霧干燥、真空干燥、加熱干燥或冷凍干燥。5. -種鷹嘴豆蛋白粉，其特征在于是通過下述方法制備得到： (1) 將帶皮的鷹嘴豆粉碎，過24目以上篩網(wǎng)從而獲得鷹嘴豆粉，將鷹嘴豆粉與有機(jī)溶劑 按質(zhì)量比為1:3~1:10混合，室溫?cái)嚢?0~60min，離心過濾，豆渣按以上步驟再次處理1~2 次，最后離心過濾后得到豆渣； (2) 將步驟（1)中的豆渣與其質(zhì)量比為1:5~1: 20的純化水混合，調(diào)節(jié)pH至8~10，室溫 提取1~2h，提取完成后離心過濾，得到濾液； (3)調(diào)節(jié)(2)中濾液的pH為3~5，離心棄去上清液，再使用pH為3~5純化水清洗沉淀物1 ~2次，得到蛋白沉淀物;干燥，得到白色鷹嘴豆蛋白粉。6. 權(quán)利要求5所述鷹嘴豆蛋白粉的制備方法，其特征在于包括下述步驟： (1) 將帶皮的鷹嘴豆粉碎，過24目以上篩網(wǎng)從而獲得鷹嘴豆粉，將鷹嘴豆粉與有機(jī)溶劑 按質(zhì)量比為1:3~1:10混合，室溫?cái)嚢?0~60min，離心過濾，豆渣按以上步驟再次處理1~2 次，最后離心過濾后得到豆渣； (2) 將步驟（1)中的豆渣與其質(zhì)量比為1:5~1: 20的純化水混合，調(diào)節(jié)pH至8~10，室溫 提取1~2h，提取完成后離心過濾，得到濾液； (3) 調(diào)節(jié)(2)中濾液的pH為3~5，離心棄去上清液，再使用pH為3~5純化水清洗沉淀物1 ~2次，得到蛋白沉淀物;干燥，得到白色鷹嘴豆蛋白粉。7. 根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的制備方法，其特征在于:所述的酶解使用的蛋白酶選自食 品·級的中性蛋白酶(酶活力多20萬u/g)、木瓜蛋白酶(酶活力多40萬u/g)、菠蘿蛋白酶(酶 活力彡30萬u/g)、堿性蛋白酶(酶活力彡20萬u/g)、胃蛋白酶(酶活力彡50萬u/g)、胰酶(酶 活力多3000u/g)中的一種或者它們的混合物，優(yōu)選地使用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一 種或者它們的混合物。8. 根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的制備方法，其特征在于:所述的有機(jī)溶劑選自醇類、脂類、 醚類、烷烴類的一種或者它們的混合物，優(yōu)選乙醇溶液;所述乙醇溶液配制使用的乙醇為食 品級乙醇，乙醇溶液體積濃度為50%以上，優(yōu)選體積濃度為90%以上的乙醇溶液。9. 一種組合物，其特征在于:含有權(quán)利要求1所述的鷹嘴豆低聚肽粉或含有權(quán)利要求5 所述的鷹嘴豆蛋白粉，以及藥物或食品上可接受的助劑。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于:其劑型選自素片、薄膜包衣片、糖衣片、 腸衣片、分散片、膠囊、顆粒劑、口服溶液或口服混懸液。11. 權(quán)利要求1所述的鷹嘴豆低聚肽粉可以用于制備治療或預(yù)防自由基過多引起的癥 狀的藥物、食品或保健品的用途。
【文檔編號】A23L33/18GK105949290SQ201610369735
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】王昭日, 楊勝杰, 劉明川, 劉敏, 楊進(jìn)平, 洪達(dá), 金志強(qiáng)
【申請人】杏輝天力（杭州）藥業(yè)有限公司