一種產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖生成酶的基因工程菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖生成酶的基因工程菌及其應(yīng)用，屬于微生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了直鏈麥芽低聚糖生成酶在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)，方法安全、高效，水解活力達(dá)到36.6U/mL，產(chǎn)酶能力是原始菌種的10倍以上；獲得的重組酶是胞外酶，有利于后期大規(guī)模生產(chǎn)的提取純化，產(chǎn)品符合食品要求。利用純化后的重組直鏈麥芽低聚糖生成酶水解淀粉，生成不含葡萄糖、含高比例麥芽五糖的直鏈麥芽低聚糖漿，這種直鏈麥芽低聚糖漿可直接用于生產(chǎn)功能性食品，也可用于生產(chǎn)高純度的直鏈麥芽低聚糖等產(chǎn)品。
【專利說明】
一種產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖生成酶的基因工程菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖生成酶的基因工程菌及其應(yīng)用，屬于微生物工 程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 直鏈麥芽低聚糖通常是指由3-10個(gè)葡萄糖單元以α-1，4糖苷鍵連接而成的聚合 體，是一種集營(yíng)養(yǎng)與功能于一體的新糖源，具有甜度低、口感好、保濕性強(qiáng)等特性，在食品中 能起到降甜和改善質(zhì)構(gòu)的作用。
[0003] 特別重要的是，直鏈麥芽低聚糖具有許多獨(dú)特的生理保健功能，可作為功能性食 品的原料，主要表現(xiàn)為：1)易消化吸收，其不必經(jīng)過唾液淀酶和胰淀粉酶的消化，可直接由 腸上皮細(xì)胞中的麥芽糖酶快速水解吸收，能急劇加速肝糖原和肌糖原的恢復(fù)，因此適用于 嬰幼兒食品、老年食品及特殊患者的流質(zhì)營(yíng)養(yǎng)食品中；2)滲透壓低，食用后可延長(zhǎng)供能時(shí) 間，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)員的肌體耐力，抗疲勞，因此適用于運(yùn)動(dòng)型飲料的生產(chǎn);3)保持血糖和胰島素 平衡，食用直鏈麥芽低聚糖后，其被吸收利用的速度較單、雙糖慢，不會(huì)導(dǎo)致血糖值急劇升 高，減少血乳酸的產(chǎn)生，同時(shí)能保持胰島素平衡，克服了服用單、雙糖引起的回躍性低血糖 反應(yīng)，因此適用于胰臟切除病人的飲食治療和腎病患者的能量來源等;4)改善腸道內(nèi)環(huán)境， 其可選擇性地促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng)，抑制腐敗菌的生長(zhǎng)，特別是抑制梭狀芽孢桿菌 (Clostridium)、腸桿菌(Enterobacteriaceae)和產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖；5)可促進(jìn)人體對(duì) Ca2+的吸收，有效預(yù)防中老年骨質(zhì)疏松;6)不易被細(xì)菌所發(fā)酵利用，同時(shí)可阻止部分高分子 糖在牙齒表面結(jié)垢，有利于預(yù)防齲齒;7)促進(jìn)人體內(nèi)雙糖酶的成熟和轉(zhuǎn)運(yùn)，誘導(dǎo)小腸上皮細(xì) 胞分化。
[0004] 直鏈麥芽低聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)主要采用酶法工藝，即通過直鏈麥芽低聚糖生成酶 從淀粉非還原末端切下多個(gè)葡萄糖單元而成。在日本、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家已開始批量生產(chǎn)直 鏈麥芽低聚糖，而國(guó)內(nèi)的淀粉糖生產(chǎn)主要集中于麥芽糖和葡萄糖，未見有直鏈麥芽低聚糖 的生產(chǎn)。其中，最重要的原因是直鏈麥芽低聚糖生成酶被國(guó)外所壟斷，國(guó)內(nèi)尚未實(shí)現(xiàn)其工業(yè) 化生產(chǎn)，造成直鏈麥芽低聚糖的生產(chǎn)成本過高。隨著直鏈麥芽低聚糖在各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用 前景越來越廣泛，在國(guó)內(nèi)開發(fā)具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的直鏈麥芽低聚糖生成酶、打破國(guó)外對(duì)該 酶的壟斷勢(shì)在必行。
[0005] 近年來，國(guó)內(nèi)外研究者一直在嘗試對(duì)直鏈麥芽低聚糖生成酶的異源表達(dá)，以期大 幅提高其產(chǎn)量，突破天然酶的分泌限制，而現(xiàn)有的研究主要集中于直鏈麥芽低聚糖生成酶 在大腸桿菌中的克隆表達(dá)，且主要定位于其細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)空間，不利于酶的分離純化及其 在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用。即使是在枯草芽孢桿菌中分泌表達(dá)，分泌量也相對(duì)較低，因 此，有必要建立并優(yōu)化更安全、高效的直鏈麥芽低聚糖生成酶食品級(jí)枯草芽孢桿菌分泌表 達(dá)體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的首先是獲得一種表達(dá)直鏈麥芽低聚糖生成酶的基因工程菌，是將編 碼直鏈麥芽低聚糖生成酶的基因?qū)肟莶菅挎邨U菌中進(jìn)行分泌表達(dá)。
[0007] 所述基因工程菌，是將編碼直鏈麥芽低聚糖生成酶的基因連接到大腸-枯草穿梭 分泌型載體pST，并轉(zhuǎn)化B. subti 1 is WB600，得到基因工程菌。
[0008] 編碼所述直鏈麥芽低聚糖生成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述 直鏈麥芽低聚糖生成酶，能夠以淀粉為底物生成不含葡萄糖、含高比例麥芽五糖的直鏈麥 芽低聚糖漿，這種直鏈麥芽低聚糖漿可直接用于生產(chǎn)功能性食品，也可用于生產(chǎn)高純度的 直鏈麥芽低聚糖等產(chǎn)品。
[0009] 本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖漿的方法，是以所述直鏈麥芽低聚糖生成 酶為催化劑，以pH 6.5~7.5的淀粉溶液為底物，按1~2U/g加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生 成酶，在40~50°C下反應(yīng)24小時(shí)，制得直鏈麥芽低聚糖漿。
[0010] 所述直鏈麥芽低聚糖生成酶以粗酶液或者純化的酶制劑的形式添加到底物中。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述酶制劑是粉末狀的。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述酶制劑是以所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)并分離純 化得到的純酶。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述淀粉溶液的質(zhì)量濃度為2%~5%。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0015] 1)實(shí)現(xiàn)了直鏈麥芽低聚糖生成酶在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)，方法安全、高效， 水解活力達(dá)到36.6U/mL，產(chǎn)酶能力是原始菌種的10倍以上;獲得的重組酶是胞外酶，有利于 后期大規(guī)模生產(chǎn)的提取純化，產(chǎn)品符合食品要求；
[0016] 2)本發(fā)明的直鏈麥芽低聚糖生成酶與其它所報(bào)道的同類酶相比，最大的優(yōu)勢(shì)是其 可以水解淀粉生成麥芽五糖含量達(dá)到50%的直鏈麥芽低聚糖漿，且即使延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間也不 會(huì)導(dǎo)致葡萄糖的生成。這種不含葡萄糖的直鏈麥芽低聚糖漿可用于生產(chǎn)功能性飲料及流質(zhì) 食品或生產(chǎn)高純度的直鏈麥芽低聚糖，避免了直鏈麥芽低聚糖漿中葡萄糖對(duì)生產(chǎn)加工的影 響，有利于直鏈麥芽低聚糖漿的深加工，從而更具有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力；
[0017] 3)本發(fā)明的直鏈麥芽低聚糖生成酶的淀粉轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物純度較高，分別達(dá)到75% 和50%，可以有效降低高純度直鏈麥芽低聚糖漿的生產(chǎn)加工成本，從而更具有工業(yè)應(yīng)用價(jià) 值。
【附圖說明】
[0018] 圖1純化重組直鏈麥芽低聚糖生成酶的SDS-PAGE分析。
[0019] 圖2溫度對(duì)重組直鏈麥芽低聚糖生成酶水解產(chǎn)物的影響。
[0020] 圖3 pH對(duì)重組直鏈麥芽低聚糖生成酶水解產(chǎn)物的影響。
[0021] 圖4加酶量對(duì)重組直鏈麥芽低聚糖生成酶水解產(chǎn)物的影響。
[0022] 圖5重組直鏈麥芽低聚糖生成酶水解產(chǎn)物的HPAEC-PAD曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0023 ]實(shí)施例1枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建
[0024]根據(jù)直鏈麥芽低聚糖生成酶的基因設(shè)計(jì)上游引物（包含EcoR I酶切位點(diǎn)）：5'_ GTATAACGAATTCCAACCGCGAACCG-3' ；下游引物（包含BamH I酶切位點(diǎn)）：5'_ CCTTAGGATCCAAAGCTTCCCGTTGGG-3'。
[0025] 克隆出含編碼信號(hào)肽序列的目的基因 SEQ ID N0.1，PCR體系為：10XEx Taq buffer(Mg2+Plus)5yL，dNTPs(各2.5mM) 5yL，正向引物（ΙΟμΜ)ΙμL，反向引物（ΙΟμΜ)ΙμL，模板 DNA lyL，Ex Taq邯（51]/^〇0.25以1^，加入雙蒸水至5(^匕？0財(cái)廣增條件為：94°(：預(yù)變性41^11; 再進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)（941€3〇8,551€3〇8,721€2111丨11) ;最后72°(：保溫1〇11^11。
[0026] 將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pMD 18-T simple分別進(jìn)行雙酶切后切膠回收，于16°C連接過 夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,涂布具有氨芐青霉素（lOOyg/mL)抗性的LB平板，測(cè)序、雙酶切驗(yàn)證 陽性轉(zhuǎn)化子，獲取克隆載體mfal/pMD 18-T simple。
[0027] 以質(zhì)粒mfal/pMD 18-T simple為模板，采用一步PCR法突變mtg基因中的EcoR I酶 切位點(diǎn)，不改變其氨基酸類型，設(shè)計(jì)上游引物（下劃線堿基為突變堿基）：5'-GCAACGAATT]；GCCAGCATGG-3 ' ：設(shè)計(jì)下游引物（下劃線堿基為突變堿基）：5 ' -CCATGCTGGC^AATTCGTTGC-3' WCR反應(yīng)體系及條件同上。將PCR產(chǎn)物用Dpn I處理后轉(zhuǎn)化 E.coli JM109,涂布具有氨芐青霉素 （100yg/mL)抗性的LB平板，測(cè)序、雙酶切驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化 子，獲取克隆載體mfa2/pMD 18-T simple。
[0028] 將已消除mtg基因中EcoR頂每切位點(diǎn)的載體mfa2/pMD 18-T simple和大腸-枯草 穿梭分泌型載體pST分別進(jìn)行雙酶切，切膠回收目的片段，連接并轉(zhuǎn)化E.coli JM109，涂布 具有5yg/mL卡那霉素和霉素抗性的LB平板，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序、雙酶切驗(yàn)證，獲取表達(dá)載 體mfa/pST。將表達(dá)載體mfa/pST轉(zhuǎn)化B. subti 1 is WB600，得到基因工程菌。
[0029] 實(shí)施例2重組直鏈麥芽低聚糖生成酶的發(fā)酵生產(chǎn)
[0030]從保藏平板挑取含表達(dá)載體mf a/pST的枯草芽孢桿菌單菌落接種于50mL含有5yg/ mL卡那霉素和赤霉素的LB培養(yǎng)基（1 %胰蛋白胨，0.5 %酵母提取物，1 %氯化鈉 ，pH 7.0)中， 37°C、200rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)過夜;按1 %的接種量轉(zhuǎn)接至50mL含有5yg/mL卡那霉素和赤霉素的 TB培養(yǎng)基（1.2 %胰蛋白胨，2.4 %酵母提取物，0.4 %甘油，17mM KH2P〇4，72mM K2HP〇4，pH 6.0)中，25°C、200rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)60h;將獲得的發(fā)酵液在lOOOOrpm下離心10min除菌體，獲 得的發(fā)酵上清液即為粗酶液。測(cè)定粗酶液的水解活力達(dá)到36.6U/mL。
[0031 ]實(shí)施例3重組直鏈麥芽低聚糖生成酶水解活力的測(cè)定
[0032] 以檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(20mM，pH 6.5)配制1 % (w/v)的可溶性淀粉溶液為 底物，在1.8mL底物中加入0.2mL適當(dāng)稀釋的酶液，45 °C下反應(yīng)15min，加入2mL 3，5-二硝基 水楊酸(DNS)溶液終止酶促反應(yīng)，沸水浴5min后冰浴冷卻，540nm下測(cè)定吸光值，與葡萄糖標(biāo) 準(zhǔn)曲線比較。定義每分鐘生成Ιμπιο?還原糖（以葡萄糖計(jì))所需的酶量為1個(gè)酶活單位(U)。
[0033] 實(shí)施例4重組直鏈麥芽低聚糖生成酶的分離純化
[0034] 發(fā)酵粗酶液在20mM磷酸緩沖液(pH 7.0)中透析48h，用5個(gè)柱體積的含lM(NH4)2S〇4 的磷酸緩沖液（1〇11^，？!16.5)平衡疏水?116即1??柱;上樣，流速為1111171^11，用超純水進(jìn)行 洗脫，流速為5mL/min;收集含有目的蛋白的組分后，經(jīng)Superdex 75凝膠柱層析，在ddH2〇洗 脫液中得到目的蛋白，在20mM磷酸緩沖液(pH 7.0)中透析48h，通過測(cè)定酶活力和SDS-PAGE (圖1)進(jìn)行鑒定，純化酶超濾濃縮后，_80°C保存。
[0035]實(shí)施例5溫度對(duì)直鏈麥芽低聚糖酶法生產(chǎn)的影響
[0036]配制pH 7.0的濃度為2.0% (w/v)的玉米淀粉溶液作為底物，按2.0U/g加酶量加入 純化重組直鏈麥芽低聚糖生成酶，分別在30、40、45、50、55和60°(：下反應(yīng)2411，反應(yīng)結(jié)束后于 沸水浴30min滅酶，在10000r/min條件下離心5min，稀釋一定倍數(shù)后用0.22μηι針頭式濾器過 濾，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法（HPAEC-PAD)測(cè)定樣品的組分與含量。 HPAEC-PAD分析條件：色譜柱CarboPac ΡΑ2003Χ 250mm;流動(dòng)相0.25Μ Na0H、1.0M NaOAc、 水;脈沖安培檢測(cè)器;流速〇.5mL/min，柱溫30°C，糖四電位波形。產(chǎn)物分析結(jié)果如圖2所示。 [0037]從圖2中可以看出，當(dāng)反應(yīng)溫度高于45°C時(shí)，轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)降低；在一定的溫度范圍 內(nèi)（30°C~50°C)，麥芽五糖的比例隨溫度的升高而增大，綜合考慮，酶法生產(chǎn)直鏈麥芽低聚 糖的反應(yīng)溫度以40~50°C為宜。
[0038]實(shí)施例6 pH對(duì)直鏈麥芽低聚糖酶法生產(chǎn)的影響
[0039] 配制pH 5.0~9.0的濃度為2.0 % (w/v)玉米淀粉溶液作為底物，按2.0U/g加酶量 加入純化重組直鏈麥芽低聚糖生成酶，在45°C下反應(yīng)24h，按照實(shí)施例5中提及的方法進(jìn)行 樣品處理與組分分析，產(chǎn)物分析結(jié)果如圖3所示。
[0040] 從圖3中可以看出，在中性條件下(pH 6.5~7.5)，轉(zhuǎn)化率較高，可達(dá)到55%以上； pH對(duì)產(chǎn)物組成的影響較小，綜合考慮，酶法生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖以中性pH條件為宜。
[0041 ]實(shí)施例7加酶量對(duì)直鏈麥芽低聚糖酶法生產(chǎn)的影響
[0042]配制pH 7.0的濃度為2.0% (w/v)的玉米淀粉溶液作為底物，按1.0~8.0U/g加酶 量加入純化重組直鏈麥芽低聚糖生成酶，在45°C下反應(yīng)24h，按照實(shí)施例5中提及的方法進(jìn) 行樣品處理與組分分析，產(chǎn)物分析結(jié)果如圖5所示。
[0043] 從圖4中可以看出，在一定范圍內(nèi)（1.0~2.0U/g)，增加重組直鏈麥芽低聚糖生成 酶的加酶量可以提高轉(zhuǎn)化率，但過高的加酶量會(huì)導(dǎo)致過度水解，產(chǎn)生過多的小分子糖，從而 降低麥芽五糖的比例。綜合考慮，酶法生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖以1~2U/g加酶量為宜。
[0044] 實(shí)施例8反應(yīng)時(shí)間對(duì)直鏈麥芽低聚糖酶法生產(chǎn)的影響
[0045]配制pH 7.0的濃度為2.0% (w/v)的玉米淀粉溶液作為底物，按2.0U/g加酶量加入 純化重組直鏈麥芽低聚糖生成酶，在45 °C下反應(yīng)4、12、24和48h，按照實(shí)施例5中提及的方法 進(jìn)行樣品處理與組分分析，反應(yīng)24h的水解產(chǎn)物色譜圖及產(chǎn)物分析結(jié)果分別如圖5和表1所 示。從圖5中可以看出，重組直鏈麥芽低聚糖生成酶對(duì)玉米淀粉的水解產(chǎn)物以麥芽五糖為 主，且無葡萄糖生成；由表1可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化率持續(xù)增加，水解產(chǎn)物中的麥 芽六糖和麥芽七糖比例減少，小分子糖的比例增加。反應(yīng)至24h時(shí)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到75.2 %，麥 芽五糖的比例可達(dá)到50.2%;反應(yīng)24h后，轉(zhuǎn)化率緩慢上升，麥芽五糖比例逐漸降低，水解產(chǎn) 物中出現(xiàn)較多的麥芽糖、麥芽三糖和麥芽四糖，但仍然沒有葡萄糖生成，故反應(yīng)時(shí)間以24h 為宜。
[0046]表1不同反應(yīng)時(shí)間下重組直鏈麥芽低聚糖生成酶水解玉米淀粉的產(chǎn)物組成及轉(zhuǎn)化 率
[0048]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種表達(dá)直鏈麥芽低聚糖生成酶的基因工程菌，其特征在于，是將編碼直鏈麥芽低 聚糖生成酶的基因?qū)肟莶菅挎邨U菌中進(jìn)行分泌表達(dá)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，是將編碼直鏈麥芽低聚糖生成酶的 基因連接到大腸-枯草穿梭分泌型載體PST，并轉(zhuǎn)化B. subti Iis WB600;所述編碼直鏈麥芽 低聚糖生成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. 應(yīng)用權(quán)利要求1或2所述的重組直鏈麥芽低聚糖生成酶生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖漿的方 法，其特征在于，以淀粉為底物生成不含葡萄糖、含高比例麥芽五糖的直鏈麥芽低聚糖漿。4. 應(yīng)用權(quán)利要求1或2所述的重組直鏈麥芽低聚糖生成酶生產(chǎn)功能性食品的方法，其特 征在于，以淀粉為底物生成不含葡萄糖、含高比例麥芽五糖的直鏈麥芽低聚糖漿，以所得直 鏈麥芽低聚糖漿直接生產(chǎn)功能性食品。5. -種生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖漿的方法，其特征在于，是以直鏈麥芽低聚糖生成酶為催 化劑，以pH 6.5~7.5的淀粉溶液為底物，按1~2U/g加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶，在 40~50°C下反應(yīng)24小時(shí)，制得麥芽低聚糖漿;編碼直鏈麥芽低聚糖生成酶的基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述直鏈麥芽低聚糖生成酶以粗酶液或者 純化的酶制劑的形式添加到底物中。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶制劑是粉末狀的。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶制劑是以權(quán)利要求1或2所述基因工 程菌發(fā)酵生產(chǎn)并分離純化得到的純酶。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，淀粉溶液的質(zhì)量濃度為2 %~5 %。
【文檔編號(hào)】A23L33/125GK105950528SQ201610421308
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月13日
【發(fā)明人】李兆豐, 顧正彪, 李才明, 丁寧, 尹健, 潘思惠, 程力, 洪雁
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)