人小腸3d類器官研究p-糖蛋白模型的構(gòu)建方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人小腸3D類器官研究P?糖蛋白(P?glycoprotein,P?gp)模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明中，首先將人小腸隱窩接種于基質(zhì)膠中，加入含有特定生長(zhǎng)因子的ADMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)以形成3D類器官；然后進(jìn)行形態(tài)觀察，并從mRNA和蛋白水平檢測(cè)P?gp的表達(dá)；最后采用共孵育的方法，以羅丹明123(Rhodamine 123,Rh123)為底物，研究維拉帕米(Verapamil)和米托坦(Mitotane)對(duì)Rh123轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。所述人小腸3D類器官研究P?gp的模型可應(yīng)用于P?gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究，所述人小腸3D器官研究P?gp的模型也可廣泛應(yīng)用于P?gp抑制劑的體外高通量篩選，所述方法高效、快速。
【專利說(shuō)明】
人小腸3D類器官研究P-糖蛋白模型的構(gòu)建方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人小腸3D類器官研究P-糖蛋白模型的構(gòu)建方法及其在P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究中的應(yīng)用。【背景技術(shù)】
[0002]口服藥物進(jìn)入人體主要經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝和排泄四個(gè)過(guò)程，而其中吸收、分布和排泄這三個(gè)過(guò)程通常是在轉(zhuǎn)運(yùn)體的參與下完成的。對(duì)口服藥物而言，藥物在消化道內(nèi)的吸收速度和吸收程度將直接影響藥效的發(fā)揮。其中，P-糖蛋白(P-glyc〇pr〇tein，P-gp)對(duì)藥物的吸收起到非常重要的作用。
[0003]P-gp(ABCBl，MDRl)是ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族中重要的一員，表達(dá)于膜表面，分子量約為nOkDJ-gp在許多正常的組織和器官中都有表達(dá)，尤其在小腸、肝臟、腎臟和血腦屏障中表達(dá)量較高。P-gp是由多藥耐藥基因(MDR1)編碼的單鏈蛋白，含有1280個(gè)氨基酸。這1280個(gè)氨基酸組成兩個(gè)亞基，每個(gè)亞基包括一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域 (TMD)和一個(gè)ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NBD)。其中，TMD是由6個(gè)疏水a(chǎn)-螺旋組成的極度疏水區(qū)，而NBD 則是極度保守的的親水區(qū)。P-gp的主要作用是利用ATP水解的能量將內(nèi)源性物質(zhì)(如膽酸、 脂肪、糖類、氨基酸、膽固醇、激素及一些電解質(zhì)等)、外源性物質(zhì)(如藥物及其代謝產(chǎn)物等) 以及毒素排出細(xì)胞外，起到保護(hù)細(xì)胞的作用，是機(jī)體抵御不良環(huán)境的一道天然屏障，但同時(shí)也是限制藥物吸收的主要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約有40%的先導(dǎo)化合物在臨床階段被否決的主要原因是其藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)不佳，尤其是口服藥物生物利用度過(guò)低。因此，在藥物研發(fā)的早期階段，不僅要關(guān)注化合物的活性，也要關(guān)注化合物的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，以期降低后期失敗的風(fēng)險(xiǎn)。 其中，P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究非常重要。另一方面，研究表明，P-gp在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平高于正常細(xì)胞，90%的腫瘤化療失敗是由于多藥耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生，而P-gp的過(guò)表達(dá)是產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因。基于以上兩點(diǎn)，研究P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要的臨床意義。 [00〇4]在p-gp介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)研究中，源自人結(jié)腸癌細(xì)胞系的Caco-2細(xì)胞單層模型被視為最經(jīng)典的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究模型。經(jīng)過(guò)21天的培養(yǎng)，Caco-2細(xì)胞之間可以通過(guò)緊密連接形成具有極性的細(xì)胞單層，并且分化出類似人小腸的絨毛結(jié)構(gòu)，可進(jìn)行吸收與外排的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)研究來(lái)評(píng)價(jià)藥物性質(zhì)。然而，此模型的亦存在一些缺陷，比如(1)培養(yǎng)周期長(zhǎng)，時(shí)間成本高；(2)細(xì)胞間的連接過(guò)于緊密，低估了藥物通過(guò)細(xì)胞間隙的運(yùn)輸；(3)體外永生化的細(xì)胞，與真實(shí)的機(jī)體環(huán)境有較大差異。
[0005]隨著科學(xué)與技術(shù)的發(fā)展，新的P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)研究模型應(yīng)運(yùn)而生。2009年，Toshiro Sato 等人報(bào)道了小鼠的單個(gè)隱窩在體外適宜的條件下可以形成一個(gè)三維的球狀結(jié)構(gòu)，稱之為3D 類器官。繼Toshiro Sato等人報(bào)道后，兩種新的轉(zhuǎn)運(yùn)研究方法相繼被報(bào)道。2012年， Tomohiro Mizutani等人報(bào)道了利用熒光定量顯微鏡可以對(duì)3D類器官內(nèi)的Rhl23進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，以此來(lái)研究P-gp介導(dǎo)的底物轉(zhuǎn)運(yùn)。2016年，我們實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)了利用超聲破碎法和多功能酶標(biāo)儀可以收集、檢測(cè)3D類器官內(nèi)的Rhl23。相比于Caco-2細(xì)胞單層，類器官模型具有很大的優(yōu)勢(shì):(1)培養(yǎng)周期短，節(jié)約時(shí)間和成本；(2)直接由小腸隱窩干細(xì)胞分化而來(lái)，能夠更真實(shí)地模擬機(jī)體環(huán)境；(3)P-gp的表達(dá)水平與機(jī)體更相似，能夠更好地模擬體內(nèi)藥物的吸收情況。然而，以上報(bào)道的這兩種方法操作都較為繁瑣，不利于藥物的高通量篩選。更重要的是，這兩種研究藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的方法都是使用小鼠的小腸3D類器官，而小鼠與人存在種屬差異，由小鼠3D類器官得來(lái)的數(shù)據(jù)與人體的真實(shí)情況相差較大。鑒于P-gp在人體內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的重要作用，我們需要一種與人體實(shí)際情況更接近的模型來(lái)研究P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)。2011年，人3D類器官的研究取得了突破性進(jìn)展，Toshiro Sato等人成功實(shí)現(xiàn)了人小腸3D 類器官培養(yǎng)。這一重大發(fā)現(xiàn)立刻引起了全球科學(xué)界的廣泛關(guān)注。人的小腸3D類器官應(yīng)用廣泛，可以用于進(jìn)行藥理學(xué)、毒理學(xué)以及微生物學(xué)研究，也可以用于開展癌基因修復(fù)等相關(guān)研究。我們首次建立了人小腸3D類器官研究P-gp的模型并將其應(yīng)用于P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究。與小鼠小腸3D類器官相比，人的小腸3D類器官能夠消除屬種差異，更真實(shí)地模擬人小腸的實(shí)際情況。使用人的小腸3D類器官來(lái)研究P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)，能夠更真實(shí)地反映人體內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的情況。與小鼠相比，人的類器官模型具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)與研究?jī)r(jià)值。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)中研究P-gp方法的不足，提出了一種人小腸3D類器官研究P-gp模型的構(gòu)建方法，本發(fā)明還提出了將所述人小腸3D類器官用于P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究，所述人小腸3D器官研究P-gp的模型也可廣泛應(yīng)用于P-gp抑制劑的體外高通量篩選，所述方法高效、快速。
[0007]本發(fā)明提出了一種人小腸3D類器官模型，所述人小腸3D類器官模型的形狀為三維中空球體，由干細(xì)胞、潘氏細(xì)胞以及上皮細(xì)胞等組成;類器官外側(cè)模擬的是小腸基底側(cè)，腔側(cè)模擬的是小腸絨毛側(cè)并有P-gp的表達(dá)。
[0008]其中，所述人小腸3D類器官模型培養(yǎng)至2-3天時(shí)類器官出現(xiàn)“出芽”現(xiàn)象，形成新的隱窩。
[0009]本發(fā)明提出了一種人小腸3D類器官模型的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:(1)將人小腸隱窩混懸于基質(zhì)膠中，取適量體積加入微孔板，如96孔板(5此)或24孔板(50此)，然后加入含有多種生長(zhǎng)因子的ADMEM/F12培養(yǎng)基(96孔板100yL，24孔板500yL)進(jìn)行37°C培養(yǎng)；(2)人小腸3D類器官培養(yǎng)的第0，1，2,3,4,5,6天，進(jìn)行形態(tài)觀察，當(dāng)培養(yǎng)2天，可得到所述使用的人小腸3D類器官模型。
[0010]其中，人小腸3D類器官培養(yǎng)的第1，2，3，4，5，6天類器官體積逐漸增大，培養(yǎng)至2-3 天時(shí)類器官出現(xiàn)“出芽”現(xiàn)象，形成新的隱窩。
[0011]其中，類器官外側(cè)模擬的是小腸基底側(cè)，腔側(cè)模擬的是小腸絨毛側(cè)并有P-gp的表達(dá)。
[0012]本發(fā)明提出了一種人小腸3D類器官研究p-gp的模型，包括所述人小腸3D類器官模型，類器官培養(yǎng)時(shí)間為2天;P-gp底物為Rhl23，底物濃度為5yM; P-gp抑制劑為Verapami 1和 Mitotane，抑制劑濃度均為20yM;類器官中的Rhl23收集方法為roS孵育法，PBS孵育的時(shí)間為4h。[0〇13]所述人小腸3D類器官模型的形狀為三維中空球體，由干細(xì)胞、潘氏細(xì)胞以及上皮細(xì)胞等組成;類器官外側(cè)模擬的是小腸基底側(cè)，腔側(cè)模擬的是小腸絨毛側(cè)并有P-gp的表達(dá)。 [〇〇14]本發(fā)明提出了一種人小腸3D類器官研究P-gp的模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟:(1)人小腸3D類器官培養(yǎng)；(2)人小腸3D類器官形態(tài)觀察；(3)人小腸3D類器官中P-gp蛋白表達(dá)在mRNA水平上的檢測(cè)；(4)免疫組化法檢測(cè)并定位人小腸3D類器官中P-gp蛋白的表達(dá)； (5)人小腸3D類器官中P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究。
[0015]其中，所述步驟(2)中，進(jìn)行形態(tài)觀察的具體時(shí)間為類器官培養(yǎng)的第0，1，2,3,4,5， 6天;培養(yǎng)的第0，1，2，3，4，5，6天類器官體積逐漸增大;培養(yǎng)至2-3天時(shí)類器官出現(xiàn)“出芽”現(xiàn)象，形成新的隱窩。
[0016]其中，所述步驟(3 )、( 4)中人小腸3D類器官的培養(yǎng)時(shí)間為2天。[0〇17]所述人小腸3D類器官模型的形狀為三維中空球體，由干細(xì)胞、潘氏細(xì)胞以及上皮細(xì)胞等組成;類器官外側(cè)模擬的是小腸基底側(cè)，腔側(cè)模擬的是小腸絨毛側(cè)并有P-gp的表達(dá)。 [〇〇18]其中，所述方法步驟(5)中P-gp底物為Rhl23,底物濃度為5yM; P-gp抑制劑為 Verapamil和Mitotane，抑制劑濃度均為20yM;類器官中Rhl23的收集方法為PBS孵育法，PBS 孵育的時(shí)間為4h。[0〇19]本發(fā)明還提出了一種在人小腸3D類器官研究P-gp的模型中檢測(cè)P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的方法，所述方法包括以下步驟:(1)人小腸3D類器官培養(yǎng)；(2)人小腸3D類器官分別與 ①P-gp底物Rhl23②P-gp底物Rhl23與P-gp抑制劑Verapamil或Mitotane共孵育；(3)人小腸 3D類器官中Rhl23收集與檢測(cè)。
[0020]其中，所述步驟(1)中，所述人小腸3D類器官培養(yǎng)時(shí)間為2天。[〇〇21] 其中，所述步驟(2)中，底物Rhl23濃度為5yM，P-gp抑制劑Verapamil和Mitotane濃度均為20yM;所述孵育時(shí)間為20，40，60，80，lOOmin;目的是作出Rhl23在類器官中時(shí)間依賴性的積累圖。無(wú)論是對(duì)照組還是給藥組，都可以再細(xì)分為不同小組，每小組分別孵育不同時(shí)間，然后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，Rh 123濃度為縱坐標(biāo)作圖，觀察Rh 123在類器官中隨孵育時(shí)間積累的情況。[〇〇22]其中，所述步驟(3)中，采用PBS孵育的方法促使Rhl23釋放，PBS的孵育時(shí)間為4h。 [〇〇23]本發(fā)明還提出了將所述人小腸3D類器官研究P-gp的模型用于P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究中的應(yīng)用。[〇〇24]本發(fā)明還提出了將所述人小腸3D類器官研究P-gp的模型用于P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究中的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括以下步驟:(1)人小腸3D類器官培養(yǎng)；(2)人小腸3D類器官分別與①P-gp底物Rhl23②P-gp底物Rhl23與P-gp抑制劑Verapamil或Mitotane共孵育；(3)人小腸3D類器官中Rhl23收集與檢測(cè)。[〇〇25]由于P-gp是一種外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，可以將其底物如Rhl23外排到3D類器官內(nèi)，但這種外排作用可以被P-gp的抑制劑如Verapamil和Mitotane抑制，通過(guò)收集、檢測(cè)并比較對(duì)照組和給藥組類器官中的Rhl23,可以得出相應(yīng)的結(jié)論。
[0026]其中，所述步驟(1)中，人小腸3D類器官培養(yǎng)時(shí)間為2天。
[0027]其中，所述步驟(2)中，底物Rhl23的濃度為5yM，P-gp抑制劑Verapamil和Mitotane 的濃度均為20yM;孵育時(shí)間為20，40，60，80，lOOrnin，目的是檢測(cè)Rhl23在類器官中的積累量是否存在時(shí)間依賴性，無(wú)論是對(duì)照組還是給藥組，都可以再細(xì)分為不同小組，每小組分別孵育不同時(shí)間，然后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，Rhl23濃度為縱坐標(biāo)作圖，可以觀察Rhl23在類器官中隨孵育時(shí)間積累的情況。[〇〇28]其中，所述步驟⑶中，采用PBS孵育的方法促使Rhl23釋放，PBS孵育時(shí)間為4h。
[0029]其中，隨著步驟(2)中孵育時(shí)間的增加，Rhl23的濃度在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組類器官中都呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)；由于實(shí)驗(yàn)組加入了P-gp抑制劑，P-gp的外排作用被抑制，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組類器官中Rhl23積累緩慢；Mitotane為第三代P-gp抑制劑，抑制效果比Verapamil強(qiáng)，加入 Mi totane后該組類器官中Rhl 23的積累比Verapamil組更緩慢。
[0030]本發(fā)明還提出了將所述人小腸3D類器官研究p-gp的模型用于p-gp抑制劑的體外高通量篩選的應(yīng)用。
[0031]本發(fā)明還提出了一種促使所述人小腸3D類器官研究p-gp的模型中Rhl23釋放的方法，采用孵育的方法促使其中的Rhl23釋放，其中，微孔板中加入的ros體積為150yL，孵育時(shí)間為4h，即可將人小腸3D類器官模型中的Rhl23釋放出來(lái)，避光環(huán)境下取80此上清至新的96孔板，然后用錫箱紙包裹至多功能酶標(biāo)儀，在WAem=485nm/535nm條件下進(jìn)行熒光值測(cè)定。[〇〇32]與現(xiàn)有技術(shù)采用超聲破碎的方法收集類器官中的Rhl23相比，本發(fā)明采用的是PBS 孵育的方法，操作簡(jiǎn)單、快速，節(jié)省人力物力，更加適合高通量藥物篩選。[〇〇33]本發(fā)明還提出了一種引物序列，其中，
[0034]上游引物序列為卩:5’-6厶660^厶0厶1厶0厶160:1'1'(:-3’，
[0035][〇〇36]本發(fā)明還提出了一種檢測(cè)P-gp的mRNA水平的方法，包括以下步驟:(1)提取總 mRNA; (2)將總mRNA反轉(zhuǎn)為cDNA; (3)ABCB1引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證；(4)PCR擴(kuò)增目的基因；(5)瓊脂糖凝膠電泳分離目的基因。[〇〇37] P-gp介導(dǎo)的藥物指的是可與P-gp的活性位點(diǎn)結(jié)合，并借助ATP提供的能量進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物。Rhl23作為P-gp的底物，可以與3D類器官上的P-gp結(jié)合而被轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)P-gp的活性位點(diǎn)被競(jìng)爭(zhēng)性抑制或者ATP的酶活被抑制時(shí)，P-gp介導(dǎo)的Rhl23轉(zhuǎn)運(yùn)就會(huì)受到限制，3D類器官腔側(cè)的Rhl 23濃度就會(huì)降低。[0〇38] 所述p-gp介導(dǎo)的藥物包括地高辛(Digoxin)、洛哌丁胺(Loeramide)、奎尼丁 (Quinidine)、長(zhǎng)春花喊(Vinblastine)等。[〇〇39]本發(fā)明首次構(gòu)建人的小腸3D類器官研究P-gp的模型并將其應(yīng)用于P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究，而且采用PBS孵育的方法促使其中的Rhl23釋放，其優(yōu)點(diǎn)在于:
[0040](1)相比于人結(jié)腸癌細(xì)胞系的Caco-2細(xì)胞單層模型，3D類器官直接由人小腸隱窩中的干細(xì)胞分化形成，在生理上與小腸更相似，能更好地模擬藥物在體內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn);培養(yǎng)周期短，時(shí)間成本低。
[0041](2)與培養(yǎng)小鼠的小腸3D類器官相比，人的類器官模型能夠消除屬種差異，更真實(shí)地模擬人小腸的實(shí)際情況。使用人的小腸3D類器官來(lái)研究P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)，能夠更直接地反映人體內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的情況。與小鼠的類器官相比，人的類器官研究具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)與研究?jī)r(jià)值。[〇〇42](3)PBS孵育促使Rhl23釋放的收集方法，不需加入額外的試劑，也無(wú)需進(jìn)行其他操作，簡(jiǎn)單、快速、高效，而且經(jīng)濟(jì)成本低，更加適合高通量藥物篩選?！靖綀D說(shuō)明】[〇〇43]圖1為人小腸3D類器官0-6天的形態(tài)。隨著培養(yǎng)天數(shù)增加類器官體積逐漸增大并出現(xiàn)“出芽”現(xiàn)象。
[0044]圖2為ABCB1引物退火溫度摸索結(jié)果。在各溫度下引物條帶單一，為避免后續(xù)PCR反應(yīng)出現(xiàn)雜帶，選擇64°C為最適退火溫度。[〇〇45]圖3為人小腸、隱窩和3D類器官中P-gp蛋白表達(dá)在mRNA水平上的檢測(cè)結(jié)果。在3D類器官中存在P-gp的表達(dá)。[〇〇46]圖4為免疫組化法檢測(cè)人小腸和3D類器官中P-gp蛋白表達(dá)水平的結(jié)果。箭頭所指為P-gp的表達(dá)位置，在小腸組織中P-gp表達(dá)于絨毛側(cè)，在類器官中P-gp表達(dá)于腔側(cè)。[〇〇47]圖5為羅丹明123(Rhl23)的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線。在5-500nM濃度范圍內(nèi)，取權(quán)重因子為 1/x2進(jìn)行線性回歸，標(biāo)曲呈現(xiàn)很好的線性(r2>0.99)。[〇〇48]圖6為兩種P-gp抑制劑對(duì)羅丹明123(Rhl23)跨3D類器官轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。隨著孵育時(shí)間的增加，Rhl23的濃度在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組類器官中都呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)；由于P-gp受到抑制，實(shí)驗(yàn)組中Rh 123積累緩慢；米托坦(Mi to tane)的對(duì)P-gp的抑制效果比維拉帕米 (Verapami 1)強(qiáng)，Mi to tane組Rh 123積累更緩慢?！揪唧w實(shí)施方式】[〇〇49]結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程、 條件、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
[0050]實(shí)施例1人小腸3D類器官培養(yǎng)
[0051](1)將包含小腸干細(xì)胞、潘氏細(xì)胞以及小腸上皮細(xì)胞等細(xì)胞類型的人小腸隱窩混懸于基質(zhì)膠中，密度以每lyL含5-10個(gè)完整隱窩為宜。
[0052](2)取適量體積上述基質(zhì)膠加入預(yù)熱的96孔板(5yL)或24孔板(50yL)，37°C培養(yǎng)箱放置15min以便基質(zhì)膠凝固。[〇〇53](3)基質(zhì)膠凝固后，加入相應(yīng)體積(96孔板100yL，24孔板500yL)的含有多種生長(zhǎng)因子(Recombinant Human R-Spondin-1,Recombinant Murine Noggin,Recombinant Mouse Epidermal Growth Factor(EGF),Recombinant Mouse Wnt_3a)的ADMEM/F12培養(yǎng)基，然后將其放置37 °C培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。每?jī)商鞊Q一次培養(yǎng)基。[〇〇54] 實(shí)施例2人小腸3D類器官形態(tài)觀察[〇〇55] 將培養(yǎng)0、1、2、3、4、5和6天的3D類器官置于配備Olympus DP 71拍照系統(tǒng)的 Olympus IX 71顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，隱窩體積逐漸增大并形成類器官結(jié)構(gòu)。當(dāng)類器官體積增大到一定程度時(shí)，隱窩中的干細(xì)胞開始分化形成新的隱窩，表現(xiàn)為“出芽”現(xiàn)象。[〇〇56]實(shí)施例3人小腸3D類器官中P-gp蛋白表達(dá)在mRNA水平上的檢測(cè) [〇〇57](1) 3D類器官的獲取:按照實(shí)施例1中的培養(yǎng)方法在3D類器官培養(yǎng)2天后(24孔板中)，將其從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗兩遍后每孔加入lmL預(yù)冷的PBS，將基質(zhì)膠輕輕吹散后轉(zhuǎn)移至15mL離心管，室溫下200 Xg離心5min，沉淀即為3D類器官，棄去上清，備用。[〇〇58](2)mRNA的獲取:向裝有小腸組織和分選出的隱窩以及3D類器官的管中每管加入500yL Trizol，按照標(biāo)準(zhǔn)步驟提取總mRNA。(其中，人的小腸組織經(jīng)過(guò)勻漿處理)
[0059](3)cDNA的獲取:以提取的總mRNA為模板(模板量為lOOOng)，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒， 在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)為cDNA，反轉(zhuǎn)體系為20yL。
[0060](4)ABCB1 引物設(shè)計(jì):上游引物為F:5’-GAGGCCAACATACATGCCTTC-3’，下游引物為R: 5 ’ -GTCTAACAAGGGCACGAGCTA-3 ’。產(chǎn)物長(zhǎng)度為 127bp。[〇〇611(5)ABCB1引物退火溫度摸索:取lyL cDNA為模板，加入上述引物，分別選取56、58、60、62和64 °C共5個(gè)退火溫度進(jìn)行PCR反應(yīng)。其中反應(yīng)體系為20yL，循環(huán)數(shù)為35。結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出在上述條件下PCR產(chǎn)物條帶單一，產(chǎn)物長(zhǎng)度為127bp。為避免后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物出現(xiàn)雜帶，選擇64 °C為最適退火溫度。[〇〇62](6)PCR反應(yīng):分別取1此cDNA為模板，加入驗(yàn)證好的上述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20yL，循環(huán)數(shù)為35,退火溫度為64°C。[〇〇63](7)瓊脂糖凝膠電泳:配置2% (w/v)的瓊脂糖凝膠。向上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入4此DNA上樣緩沖液，混勻后取6yL上樣，120V電泳20min后將其置于凝膠成像系統(tǒng)(B1-1maging System 910)下拍照，結(jié)果如圖3所示。其中，f3-actin作為內(nèi)參。從圖中可以看出在小腸3D類器官中存在P-gp的表達(dá)。[〇〇64]實(shí)施例4免疫組化法檢測(cè)并定位人小腸3D類器官中P-gp蛋白的表達(dá) [〇〇65](1) 3D類器官的獲取:按照實(shí)施例1中的培養(yǎng)方法在3D類器官培養(yǎng)2天后(96孔板中)，將其從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗兩遍后每孔加入150此預(yù)冷的PBS，放置冰上，然后用槍頭將基質(zhì)膠輕輕吹散并轉(zhuǎn)移至15mL離心管，室溫下200Xg離心5min，沉淀即為3D類器官，棄去上清，備用。[〇〇66](2)固定:將3D類器官包裹于稱量紙內(nèi)，與卷好的小腸組織一起放入4%多聚甲醛中，并于4°C搖床過(guò)夜。[〇〇67](3)沖洗:用自來(lái)水將3D類器官與小腸組織沖洗24h，洗掉固定液。[〇〇68](4)脫水:采用乙醇脫水法，將3D類器官與小腸組織依次在50%、75%、85%、95%、100%乙醇中放置1小時(shí)。[〇〇69](5)透明:先將3D類器官與小腸組織放入無(wú)水乙醇:二甲苯(1:1，v/v)20min，再將其在二甲苯I和二甲苯II中各放置15min。
[0070](6)浸蠟:將3D類器官與小腸組織放置在蠟I 30min，蠟II 2小時(shí)，最后放置蠟III 中過(guò)夜。
[0071](7)包埋:先將小腸組織修剪成合適大小再包埋。蠟塊凝固后將其放入-20°C冰箱冰凍5min后再將其與鉛盒輕輕分離。
[0072](8)切片:切片前，先除去組織塊周圍多余的石蠟，將蠟塊修剪成形狀規(guī)則的正方形或長(zhǎng)方形;將蠟塊固定在切片機(jī)上切片，切片厚度為4wii;切好后用毛筆小心地將切片放到42°C水浴鍋中展片；然后再將其貼于載玻片上，做好標(biāo)記后放到62°C烤片機(jī)上烤片2小時(shí);烤片結(jié)束后待其冷卻便可放入切片盒中保存。[〇〇73](9)免疫組化:[〇〇74] ①脫蠟:將切片依次放入二甲苯I(10min)、二甲苯Il(lOmin)、二甲苯:100%乙醇 (1:1，v/v) (5min)、100% 乙醇(5min)、95% 乙醇(5min)、85% 乙醇(5min)、75% 乙醇(5min)、 純水(3min)進(jìn)行脫蠟。[〇〇75](事先打開水浴鍋，調(diào)至100°C)
[0076]②抗原修復(fù):配制200mL檸檬酸鈉(lOmM)修復(fù)液倒入修復(fù)盒中，將玻片按照一定的方向逐一插入修復(fù)盒，然后蓋緊蓋子放入水浴鍋中l(wèi)〇〇°C修復(fù)20min，自然冷卻至室溫。 [〇〇77]③去除過(guò)氧化氫酶，潤(rùn)洗:準(zhǔn)確量取甲醇36mL，然后加入4mL 30 %H2〇2配置終濃度為3%的H2〇2,將其倒入浸泡瓶，將切片按照一定的方向插入浸泡瓶后避光放置lOmin以去除過(guò)氧化氫酶，之后蒸餾水潤(rùn)洗3次，再用含2 % Tri ton-X 100的TOST潤(rùn)洗(細(xì)胞打孔)2次，每次3min〇
[0078]④抗原位點(diǎn)封閉:先用濾紙將切片四周的液體擦干，然后在切片周圍畫一合適大小的油圈，再在油圈內(nèi)滴加1 -2滴封閉液(5%脫脂奶粉)，于濕盒內(nèi)反應(yīng)20min。
[0079]⑤添加一抗:棄去封閉液，先用濾紙將油圈上殘留的液體擦去，再向油圈內(nèi)滴加50 yL P-gp單克隆抗體，最后將其平放在濕盒內(nèi)4°C過(guò)夜。
[0080]⑥添加二抗:棄去一抗，PBST清洗3次，每次5min，然后添加生物素標(biāo)記的二抗，室溫反應(yīng)30min。(注意保持切片濕潤(rùn))。
[0081]⑦添加鏈親和素標(biāo)記-HRP(辣根過(guò)氧化物酶):棄去二抗，PBST清洗3次，每次5min， 然后添加50此鏈親和素標(biāo)記的HRP并于避光環(huán)境下反應(yīng)30min。[〇〇82]⑧顯色:先用TOST清洗3次，每次5min，在避光環(huán)境下將DAB試劑盒中三種液體混合并以純水稀釋后，向每個(gè)玻片添加50yL的顯色液顯色5min。[〇〇83]⑨蘇木精染色:先用自來(lái)水沖洗3次將顯色液去除，然后用蘇木精染色5min;自來(lái)水沖洗3次之后再用75 %酒精(含1 %鹽酸)去色20s;蒸餾水清洗3次后在自來(lái)水中返藍(lán) 20min〇
[0084]⑩封片:將切片依次放入75%乙醇(31^11)、85%乙醇(3111111)、95%乙醇(3111111)、100% 乙醇(5min)、無(wú)水乙醇:二甲苯(1:1，v/v) (5min)、二甲苯I (5min)、二甲苯II (lOmin)，然后取出切片，擦干后滴加一滴樹脂膠，蓋上蓋玻片，自然晾干。[〇〇85](10)拍照:待切片晾干后，將其置于配備有LEICA DFC310FX拍照系統(tǒng)的LEICADM4000B LED顯微鏡下觀察并拍照，結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出在小腸組織中P-gp表達(dá)于小腸絨毛側(cè)，而在小腸3D類器官中，P-gp表達(dá)于球狀類器官的內(nèi)側(cè)邊緣。結(jié)果說(shuō)明小腸 3D類器官的內(nèi)側(cè)模擬的是小腸的絨毛側(cè)，而類器官的外側(cè)模擬的是小腸的基底側(cè)。[〇〇86]實(shí)施例5人小腸3D類器官中P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究 [〇〇87](l)Rhl23標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線的建立。[〇〇88]避光環(huán)境下，用PBS將Rhl23稀釋成系列濃度梯度(5，10，20，50，100，200，500nM)的標(biāo)準(zhǔn)液并依次加入96孔板，每孔80此，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行。然后將96孔板于避光環(huán)境下放入多功能酶標(biāo)儀(FLUOStar 0PHMA)，在WAem=485nm/535nm條件下進(jìn)行檢測(cè)。以Rhl23濃度為橫坐標(biāo)、測(cè)得的熒光值為縱坐標(biāo)、權(quán)重因子為1/x2進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如圖5所示。相關(guān)系數(shù)r2>0.99，表明線性很好。[〇〇89](2)人小腸3D類器官培養(yǎng)。[〇〇9〇]按照實(shí)施例1所述培養(yǎng)方法在96孔板內(nèi)進(jìn)行人小腸3D類器官培養(yǎng)。[〇〇91](3)人小腸3D類器官中P-gp底物與抑制劑共孵育。
[0092]類器官培養(yǎng)2天后，將其從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，并于顯微鏡下計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)束后在避光環(huán)境下進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組加入只含Rh 123的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入同時(shí)含有 Verapamil (第一代P-gp抑制劑)或Mitotane(第三代P-gp抑制劑)與Rhl23的培養(yǎng)基，然后將其放入37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。Rhl23的濃度為5yM，抑制劑的濃度為20yM。[〇〇93](4)人小腸3D類器官中Rhl23收集與測(cè)定。[〇〇94] 在特定孵育時(shí)間點(diǎn)(20，40，60，80，lOOmin)取出相應(yīng)的96孔板，于避光環(huán)境下向每孔加入150yL預(yù)熱的PBS連續(xù)清洗5次(每次2min)以去除殘留的Rhl23。再向每孔加入150yL 預(yù)熱的PBS，然后將96孔板放入37°C培養(yǎng)箱并開始計(jì)時(shí)。待4小時(shí)后，類器官破裂，囊腔中積累的Rhl23釋放到PBS中，此時(shí)于避光環(huán)境下取80此上清液至新的96孔板中，然后用錫箱紙包裹至多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光值測(cè)定。將測(cè)得的樣品熒光值代入標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，得到樣品中Rhl23的總濃度。然后將總濃度除以每孔的類器官個(gè)數(shù)，得到平均每個(gè)類器官中Rhl23的濃度以消除類器官個(gè)數(shù)的影響以及由類器官個(gè)體差異帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)誤差。
[0095]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，從圖中可以看到，隨著孵育時(shí)間的增加，Rhl23的濃度在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組類器官中都呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)；由于實(shí)驗(yàn)組加入了P-gp抑制劑，P-gp的外排作用被抑制，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組類器官中Rhl23積累緩慢;Mitotane為第三代P-gp抑制劑，抑制效果比 Verapamil強(qiáng)，加入Mi totane后該組類器官中Rhl 23的積累比Verapamil組更緩慢。
[0096]本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以上實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種人小腸3D類器官模型，其特征在于，所述人小腸3D類器官模型的形狀為三維中 空球體;包括干細(xì)胞、潘氏細(xì)胞以及上皮細(xì)胞;所述人小腸3D類器官外側(cè)模擬的是小腸基底 側(cè)，腔側(cè)模擬的是小腸絨毛側(cè)，并有P-gp的表達(dá)。2.—種人小腸3D類器官模型的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:將人小 腸隱窩混懸于基質(zhì)膠中，取適量體積加入微孔板，然后加入含有多種生長(zhǎng)因子的ADMEM/F12 培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)2天，得到如權(quán)利要求1所述的人小腸3D類器官模型。3.—種人小腸3D類器官研究P-gp的模型，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的人小腸 3D類器官模型、濃度為5yM的P-gp底物Rhl23、濃度均為20yM的P-gp抑制劑Verapamil和 Mitotane。4.一種人小腸3D類器官研究P-gp的模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟:(1) 人小腸3D類器官培養(yǎng)；(2)人小腸3D類器官形態(tài)觀察；(3)人小腸3D類器官中P-gp蛋白表達(dá) 在mRNA水平上的檢測(cè)；(4)免疫組化法檢測(cè)并定位人小腸3D類器官中P-gp蛋白的表達(dá)；(5) 人小腸3D類器官中P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究;所述人小腸3D類器官研究P-gp的模型如權(quán)利 要求3所述。5.其中，所述步驟(2)中，進(jìn)行形態(tài)觀察的具體時(shí)間為類器官培養(yǎng)的第0，1，2,3,4,5,6 天;培養(yǎng)的第〇，1，2，3，4，5，6天，類器官體積逐漸增大;培養(yǎng)至2-3天時(shí)類器官出現(xiàn)“出芽”現(xiàn) 象，形成新的隱窩；所述方法步驟(3)、(4)中類器官的培養(yǎng)時(shí)間為2天;所述方法步驟(5)中 P-gp底物為Rhl23,底物濃度為5yM，P-gp抑制劑為Verapamil和Mitotane，抑制劑濃度均為 20yM，類器官中Rh 123的收集方法為PBS孵育法，PBS孵育的時(shí)間為4h。6.—種在人小腸3D類器官研究P-gp的模型中檢測(cè)P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的方法，其特征 在于，所述方法包括以下步驟:(1)人小腸3D類器官培養(yǎng)；(2)人小腸3D類器官分別與①P-gp 底物Rhl23②P-gp底物Rhl23與P-gp抑制劑Verapamil或Mitotane共孵育；(3)人小腸3D類器 官中Rhl23收集與檢測(cè);所述人小腸3D類器官研究P-gp的模型如權(quán)利要求3所述。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，人小腸3D類器官培養(yǎng)的時(shí)間 為2天;所述步驟(2)中，底物Rhl23的濃度為5yM，P-gp抑制劑Verapamil和Mitotane的濃度 均為20yM;所述步驟(3)中，采用PBS孵育的方法促使Rhl23釋放，PBS孵育時(shí)間為4h。8.將如權(quán)利要求3所述的人小腸3D類器官研究P-gp的模型用于P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研 究中的應(yīng)用。9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括以下步驟:(1)人小腸3D類器官 培養(yǎng)；(2)人小腸3D類器官分別與①P-gp底物Rhl23②P-gp底物Rhl23與P-gp抑制劑 Verapami 1或Mitotane共孵育；(3)人小腸3D類器官中Rhl23收集與檢測(cè)。10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(1)中，人小腸3D類器官培養(yǎng)時(shí)間 為2天;所述步驟(2)中，底物Rhl23的濃度為5yM，P-gp抑制劑Verapamil和Mitotane的濃度 均為20yM;所述步驟(3)中，采用PBS孵育的方法促使Rhl23釋放，PBS孵育時(shí)間為4h。11.將如權(quán)利要求3所述的人小腸3D類器官研究P-gp的模型用于P-gp抑制劑的體外高 通量篩選的應(yīng)用。12.—種促使人小腸3D類器官研究P-gp的模型中Rhl23釋放的方法，其特征在于，采用 PBS孵育的方法促使其中的Rhl23釋放，其中，微孔板中加入的PBS體積為150此，孵育時(shí)間為 4h;所述人小腸3D類器官研究P-gp的模型如權(quán)利要求3所述。13.—種引物序列，其特征在于，上游引物序列為F: 5 ’ -GAGGCCAACATACATGCCTTC-3 ’，下 游引物序列為R: 5 ’ -GTCTAACAAGGGCACGAGCTA-3 ’。14.一種檢測(cè)P-gp的mRNA水平的方法，包括以下步驟:(1)提取總mRNA; (2)將總mRNA反 轉(zhuǎn)為cDNA;(3)ABCBl引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證，所述ABCB1引物如權(quán)利要求13所述；(4)PCR擴(kuò)增目的 基因；(5)瓊脂糖凝膠電泳分離目的基因。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK105950539SQ201610345283
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月23日
【發(fā)明人】王昕 , 趙軍芳, 曾之揚(yáng), 張遠(yuǎn)金, 李大力, 劉明耀
【申請(qǐng)人】華東師范大學(xué)