一種利用自組裝細(xì)胞芯片檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用自組裝細(xì)胞芯片檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響的方法。本發(fā)明所提供的自組裝細(xì)胞芯片包括基底，在所述基底上設(shè)有用于固定所述待測物質(zhì)的區(qū)域；在所述基底上除用于固定所述待測物質(zhì)的區(qū)域外的其他區(qū)域覆蓋抑制細(xì)胞生長的膜。實驗證明，本發(fā)明所提供的自組裝細(xì)胞芯片在檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響中具有重要的應(yīng)用價值；所述待測物質(zhì)具體可為siRNA分子、質(zhì)?；蚧衔铩?br>【專利說明】
一種利用自組裝細(xì)胞芯片檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)活性氧的影 響的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用自組裝細(xì)胞芯片檢測待測物質(zhì)對細(xì) 胞內(nèi)活性氧的影響的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 活性氧(reactive oxygen species，R0S)是指由分子氧直接或間接轉(zhuǎn)化而來，具 有比分子氧更活潑的化學(xué)反應(yīng)性的一類含氧物，包括氧離子、過氧化物和含氧自由基等。 R0S是正常氧代謝的副產(chǎn)物，并且在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、保持機體恒常性起很大作用。生物體內(nèi) 存在一套完善的氧化一抗氧化體系，正常情況下可將R0S維持在一個穩(wěn)定的范圍內(nèi)，并在抗 炎、抗菌等方面發(fā)揮積極作用。但當(dāng)體內(nèi)平衡打破，R0S持續(xù)升高，R0S介導(dǎo)細(xì)胞膜、DNA以及 蛋白質(zhì)的損傷，將促使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化、導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。
[0003] 有關(guān)細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測體系較普遍的是利用熒光探針DCFH-DA進行檢測，該技術(shù) 的原理是基于熒光探針DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜。進入細(xì)胞后，熒光探 針DCFH-DA可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，D(FH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針易于被裝 載到細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，檢測DCF的熒光就 可以知道細(xì)胞內(nèi)的活性氧的水平。
[0004] 目前，已經(jīng)發(fā)明了一種SAMcell芯片（Self-assembled Cell Microarray，自組裝 細(xì)胞芯片)技術(shù)。該技術(shù)有以下特點:第一，應(yīng)用微細(xì)加工技術(shù)，細(xì)胞生長區(qū)域的誤差可以控 制在不到萬分之一，這樣就可以對細(xì)胞芯片進行十分精確的控制;第二，有效結(jié)合了反式轉(zhuǎn) 染技術(shù)，可以實現(xiàn)定點、高效地將小核酸、質(zhì)粒、蛋白、化合物等轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中；第三，實驗過 程中，所有的細(xì)胞島都在相同的培養(yǎng)條件下孵育，所以所有的實驗組都是可以比較的；第 四，由于所有的細(xì)胞島在同一張芯片上，這樣在后期染色、成像等實驗過程中，操作簡便而 且成本較低?？梢灶A(yù)見，這種技術(shù)在未來的生物研究中具有十分廣闊的應(yīng)用前景。SAMcell 芯片技術(shù)已經(jīng)成為了生物學(xué)家們在研究基因功能或藥物功能的得力助手。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了自組裝細(xì)胞芯片在檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞 內(nèi)活性氧的影響中的應(yīng)用;所述自組裝細(xì)胞芯片包括基底，在所述基底上設(shè)有用于固定所 述待測物質(zhì)的區(qū)域;在所述基底上除用于固定所述待測物質(zhì)的區(qū)域外的其他區(qū)域覆蓋抑制 細(xì)胞生長的膜。
[0007] 上述應(yīng)用中，所述待測物質(zhì)可為siRNA分子、質(zhì)?；蚧衔?。
[0008] 上述應(yīng)用中，所述抑制細(xì)胞生長的膜可為聚-N-異丙基丙烯酰胺膜。
[0009] 上述應(yīng)用中，所述siRNA分子具體可為al)或a2)或a3)或a4):
[0010] al) -條鏈如序列表中序列1所示，另一條鏈如序列表中序列2所示；
[0011] a2)如序列表中序列1自5'末端起第1至19位所示；
[0012] a3) -條鏈如序列表中序列3所示，另一條鏈如序列表中序列4所示；
[0013] a4)如序列表中序列3自5'末端起第1至19位所示。
[0014] 上述應(yīng)用中，所述質(zhì)?？蔀橄虮磉_載體多克隆位點插入序列表中序列5或序列表 中序列6所示的雙鏈DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。
[0015] 所述表達載體具體可為載體pWSLV-sh02。
[0016] 所述質(zhì)粒具體可為重組質(zhì)粒甲或重組質(zhì)粒乙。
[0017] 所述重組質(zhì)粒甲具體可為將載體pWSLV-sh02用限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切，然后插 入核苷酸序列是序列表中序列5所示的雙鏈DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。
[0018] 所述重組質(zhì)粒乙具體可為將載體pWSLV-sh02用限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切，然后插 入核苷酸序列是序列表中序列6所示的雙鏈DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。
[0019] 上述應(yīng)用中，所述化合物可為蘆薈凝膠粉或兒茶酚。
[0020] 上述應(yīng)用中，所述細(xì)胞可為人皮膚成纖維細(xì)胞。所述人皮膚成纖維細(xì)胞可為HSF細(xì) 胞。
[0021] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響 的方法。
[0022] 本發(fā)明所提供的檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響的方法，可包括如下步驟：
[0023] (1)將待測物質(zhì)通過明膠包裹得到轉(zhuǎn)染復(fù)合物；
[0024] (2)將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物固定到自組裝細(xì)胞芯片上，得到固定待轉(zhuǎn)染物質(zhì)的芯片；
[0025] 所述自組裝細(xì)胞芯片包括基底，在所述基底上設(shè)有用于固定所述待測物質(zhì)的區(qū) 域;在所述基底上除用于固定所述待測物質(zhì)的區(qū)域外的其他區(qū)域覆蓋抑制細(xì)胞生長的膜； [0026] (3)將細(xì)胞接種到所述固定待轉(zhuǎn)染物質(zhì)的芯片上，培養(yǎng);檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)活 性氧的影響。
[0027] 上述方法中，所述步驟(1)中，所述將待測物質(zhì)通過明膠包裹得到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的方 法可包括如下步驟:將待測物質(zhì)溶液與明膠溶液混勻，孵育，得到轉(zhuǎn)染復(fù)合物；
[0028] 上述方法中，所述步驟(2)中，所述抑制細(xì)胞生長的膜可為聚-N-異丙基丙烯酰胺 膜;所述將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物固定到自組裝細(xì)胞芯片上的方法可包括如下步驟:先將所述轉(zhuǎn) 染復(fù)合物點樣在所述自組裝細(xì)胞芯片上的用于固定所述待測物質(zhì)的區(qū)域，再進行干燥。
[0029] 上述方法中，所述待測物質(zhì)可為siRNA分子、質(zhì)?；蚧衔?。所述待測物質(zhì)溶液可 為待測物質(zhì)水溶液。所述明膠溶液可由明膠、纖維連接蛋白和水組成，其中明膠在明膠溶液 中的質(zhì)量百分含量為0.25%，纖維連接蛋白在明膠溶液中的質(zhì)量百分含量為0.01%。
[0030] 上述方法中，所述siRNA分子具體可為al)或a2)或a3)或a4):
[0031] al) -條鏈如序列表中序列1所示，另一條鏈如序列表中序列2所示；
[0032] a2)如序列表中序列1自5'末端起第1至19位所示；
[0033] a3) -條鏈如序列表中序列3所示，另一條鏈如序列表中序列4所示；
[0034] a4)如序列表中序列3自5'末端起第1至19位所示。
[0035]上述方法中，所述質(zhì)?？蔀橄虮磉_載體多克隆位點插入序列表中序列5或序列表 中序列6所示的雙鏈DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。
[0036] 所述表達載體具體可為載體pWSLV_sh02。
[0037] 所述質(zhì)粒具體可為重組質(zhì)粒甲或重組質(zhì)粒乙。
[0038] 所述重組質(zhì)粒甲具體可為將載體pWSLV-sh02用限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切，然后插 入核苷酸序列是序列表中序列5所示的雙鏈DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。
[0039]所述重組質(zhì)粒乙具體可為將載體pWSLV-sh02用限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切，然后插 入核苷酸序列是序列表中序列6所示的雙鏈DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。
[0040]上述方法中，所述化合物可為蘆薈凝膠粉或兒茶酚。
[0041 ] 所述步驟(3)中，所述細(xì)胞和所述siRNA分子的配比可為1 X 105~1.2 X 105個：lyg (如1X105個：lyg)。
[0042] 所述步驟(3)中，所述細(xì)胞和所述質(zhì)粒的配比為1.1 X 105~1.4X 105個：lyg(如1.1 X105 個：lyg)。
[0043] 所述步驟(3)中，所述細(xì)胞和所述化合物的配比為2 X 105~2 X 107個：lyg(如2 X 105個：lyg)。
[0044] 所述步驟(1)中，所述孵育的溫度可為23~28°C (如25°C)。
[0045] 所述步驟(1)中，所述孵育的時間為5~30min(如5min)。
[0046] 所述步驟(2)中，所述干燥的時間可為2~20h(如12h)。
[0047] 所述步驟(3)中，所述培養(yǎng)的溫度可為34~45°C (如37°C)。
[0048] 所述步驟(3)中，所述培養(yǎng)的時間為12~48h(如48h)。
[0049] 上述方法中，所述細(xì)胞可為人皮膚成纖維細(xì)胞。所述人皮膚成纖維細(xì)胞可為HSF細(xì) 胞。
[0050] 上述任一所述應(yīng)用或上述任一所述方法中，所述自組裝細(xì)胞芯片中用于固定所述 待測物質(zhì)的區(qū)域，即為后續(xù)細(xì)胞接種至所述自組裝細(xì)胞芯片上的位置。
[0051] 實驗證明，本發(fā)明所提供的自組裝細(xì)胞芯片，在檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)活性氧的 影響中的具有重要的應(yīng)用價值。所述待測物質(zhì)具體可為siRNA分子、質(zhì)?；蚧衔铩?br>【附圖說明】
[0052]圖1為檢測siRNA分子對HSF細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響。
[0053]圖2為檢測質(zhì)粒對HSF細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響。
[0054]圖3為檢測化合物對HSF細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響。
【具體實施方式】
[0055] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0056] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0057]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0058]以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0059]本發(fā)明中的6%(W/V)的聚-N-異丙基丙烯酰胺乙醇溶液具體為質(zhì)量濃度為60g/L 的聚-N-異丙基丙烯酰胺乙醇溶液。含10%(W/V)蔗糖的Opti-MEM具體為含質(zhì)量濃度為 100g/L 的鹿糖的 Opti-MEM。
[0060]下述實施例中所用的SAMcell芯片（自組裝細(xì)胞芯片）包括基底，在基底上設(shè)有用 于固定S i RNA分子、質(zhì)?；蚧衔锏膮^(qū)域;在基底上除用于固定所述s i RNA分子、質(zhì)粒或化合 物的區(qū)域外的其他區(qū)域覆蓋抑制細(xì)胞生長的聚-N-異丙基丙烯酰胺膜(PNI膜）；具體構(gòu)建方 法如下：
[0061] 用去垢劑和超純水清洗實驗室常用的玻片(25毫米X25毫米)表面。在其表面覆蓋 一層PNI膜，使用65yL 6 % (W/V)的聚-N-異丙基丙烯酰胺乙醇溶液，干燥后，25 °C保存12h。 根據(jù)實驗室要求制備硅片掩模，利用微加工技術(shù)可在其上刻出微孔，得到SAMcell芯片（自 組裝細(xì)胞芯片），該方法也在專利申請200910210565.1中公開。SAMcell芯片包括玻片（25毫 米X 25毫米)和附著于玻片上的PNI膜。玻片起支持介質(zhì)的作用。PNI膜上具有若干微孔（貫 穿孔），微孔的直徑為0 · SmnuPNI膜的厚度為0 · Ζδπιπ^ΡΝΙ膜的材質(zhì)為6% (W/V)的聚-N-異丙 基丙烯酰胺乙醇溶液。聚-N-異丙基丙烯酰胺具有抑制細(xì)胞生長的作用，微孔為貫穿孔，底 面為玻片，因此只有加入到微孔中的細(xì)胞才可以生長。
[0062] 明膠溶液由明膠、纖維連接蛋白和水組成，其中明膠在明膠溶液中的質(zhì)量百分含 量為0.25%，纖維連接蛋白在明膠溶液中的質(zhì)量百分含量為0.01 %。
[0063]明膠和纖維連接蛋白均為Sigma公司產(chǎn)品，貨號分別為G-9391和F0895。倒置熒光 顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品，產(chǎn)品型號為LH-M100CB Apti-MEM為GIBC0公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號 為11058021 aLipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑為invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為 1734974。載體pWSLV-sh02為北京唯尚立德生物科技有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為P0008。 HSF細(xì)胞為自上海拜力生物科技有限公司產(chǎn)品。蘆薈凝膠粉為Unigen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號 為QC08149。兒茶酚為Sigma公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為096K1434。
[0064] DCFH-DA稀釋液由無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA(濃度為10mM)至1000倍體積得到； DCFH-DA在DCFH-DA稀釋液中的濃度為ΙΟμΜ。無血清培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為 1710801 ACFH-DAaOmM)為碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為S0033。
[0065] 染色液為含Hoechst 33342Nuclear Stain的pH7.4、10mM PBS水溶液， Hoechst33342Nuclear Stain在染色液中的濃度為 10yg/mL。其中Hoechst 33342Nuclear Stain為細(xì)胞自噬檢測試劑盒(美國ΕΝΖ0公司產(chǎn)品）中的組件。
[0066] 實施例1、檢測siRNA分子對HSF細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響
[0067] 檢測siRNA分子對HSF細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響的具體步驟如下：
[0068] 1、由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成靶基因DAF的雙鏈siRNA分子，在下文中簡稱 為DAF siRNA，DAF siRNA為序列表中序列1所示的RNA單鏈和序列表中序列2所示的RNA單鏈 互補而成的雙鏈siRNA分子。由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成隨機雙鏈siRNA分子，在下 文中簡稱隨機siRNA，隨機siRNA為序列表中序列3所示的RNA單鏈和序列表中序列4所示的 RNA單鏈互補而成的雙鏈s iRNA分子(作為陰性對照）。
[0069] 序列表中序列 1 :GAUUCACCAUGAUUGGAGAtt;
[0070] 序列表中序列 2: UCUCCAAUCAUGGUGAAUCct;
[0071] 序列表中序列 3:UUCUCCGAACGUGUCACGUtt;
[0072 ]序列表中序列 4: ACGUGACACGUUCGGAGAAtt。
[0073] 2、取96孔板，每孔加入3yL含 10 % (W/V)蔗糖的Opti-MEM和2 · 5yL Lipof ectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，充分混勻，25°C孵育5min。
[0074] 3、完成步驟2后，取所述96孔板，每孔加入2yg步驟1合成的DAF siRNA或隨機 s iRNA，充分混勻，25 °C孵育20min。
[0075] 4、完成步驟3后，取所述96孔板，每孔加入7.5yL明膠溶液，充分混勻，25 °C孵育 5min，得到的混合液即為反向轉(zhuǎn)染s iRNA復(fù)合物。
[0076] 5、完成步驟4后，利用點樣儀將所述反向轉(zhuǎn)染siRNA復(fù)合物交錯的點在SAMcell芯 片的用于固定所述轉(zhuǎn)染siRNA的區(qū)域，干燥過夜(25°C，12h)，得到固定siRNA復(fù)合物的芯片。
[0077] 6、完成步驟5后，將HSF細(xì)胞消化并吹打均勻，然后接種于所述固定siRNA復(fù)合物的 芯片上(HSF細(xì)胞和siRNA分子的配比為1 X 105個：lyg)，37°C溫度培養(yǎng)48h，得到轉(zhuǎn)染siRNA 復(fù)合物的細(xì)胞芯片。
[0078] 7、完成步驟6后，將轉(zhuǎn)染siRNA復(fù)合物的細(xì)胞芯片在25 °C放置5min，PNI膜脫落，然 后使用PH7.4、10mM的PBS水溶液清洗3次，得到待檢測細(xì)胞芯片。
[0079] 8、細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測
[0080] (1)取步驟7得到的待檢測細(xì)胞芯片，加入2mL DCFH-DA稀釋液，37°C孵育20min。
[0081] (2)完成步驟（1)后，取所述待檢測細(xì)胞芯片，用無血清培養(yǎng)基洗滌3遍，以充分去 除未進入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。
[0082] (3)完成步驟(2)后，取所述待檢測細(xì)胞芯片，加入染色液，避光染色20min。
[0083] (4)完成步驟(3)后，取所述待檢測細(xì)胞芯片，置于倒置熒光顯微鏡下檢測，在10倍 物鏡下觀察熒光。
[0084] 實驗結(jié)果見圖1(A為隨機siRNA分子，B為DAF siRNA分子，其中Hoechst為細(xì)胞核染 色結(jié)果，F(xiàn)ITC為細(xì)胞質(zhì)的染色結(jié)果）。結(jié)果表明，與隨機siRNA相比，轉(zhuǎn)染DAF siRNA在相應(yīng)位 置上的細(xì)胞小島，活性氧形成的比例明顯減少，說明細(xì)胞內(nèi)活性氧減少，抗氧化活性提高。
[0085] 實施例2、檢測質(zhì)粒對HSF細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響
[0086] 檢測質(zhì)粒對HSF細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響的具體步驟如下：
[0087] 1、質(zhì)粒的構(gòu)建
[0088] (1)重組質(zhì)粒甲的構(gòu)建
[0089]根據(jù)靶基因DAF設(shè)計并合成如序列表中序列5所示的雙鏈DNA分子，即目的shRNA序 列。將載體pWSLV-sh02用限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切，然后插入核苷酸序列是序列表中序列5 所示的雙鏈DNA分子，得到重組質(zhì)粒甲。
[0090] 序列表中序列5為：
[0091 ] 5 '-AAAAGCAACCATCTCCTTCTCATGTCTCGAGACATGAGAAGGAGATGGTTGC-3 '。
[0092] (2)重組質(zhì)粒乙的構(gòu)建
[0093] 隨機合成如序列表中序列6所示的雙鏈DNA分子，即隨機shRNA序列。將載體pWSLV- sh02用限制性內(nèi)切酶BsmB頂每切，然后插入核苷酸序列是序列表中序列6所示的雙鏈DNA分 子，得到重組質(zhì)粒乙。
[0094] 序列表中序列6為：
[0095] 5 '-AAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAA-3 '。
[0096] 2、同實施例1中步驟2。
[0097] 3、完成步驟2后，取所述96孔板，每孔加入lyg步驟1構(gòu)建的重組質(zhì)粒甲或重組質(zhì)粒 乙，充分混勻，25°C孵育20min。
[0098] 4、完成步驟3后，取所述96孔板，每孔加入7.5yL明膠溶液，充分混勻，室溫孵育 5min，得到的混合液即為反向轉(zhuǎn)染質(zhì)粒復(fù)合物。
[0099] 5、完成步驟4后，利用點樣儀將所述反向轉(zhuǎn)染質(zhì)粒復(fù)合物分別交錯的點在SAMcell 芯片的用于固定所述轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的區(qū)域，干燥過夜(25°C，12h)，得到固定質(zhì)粒復(fù)合物的芯片。
[0100] 6、完成步驟5后，將HSF細(xì)胞消化并吹打均勻，然后接種于所述固定質(zhì)粒復(fù)合物的 芯片上(HSF細(xì)胞和質(zhì)粒(重組質(zhì)粒甲或重組質(zhì)粒乙）的配比為1.1 X 105個：lyg)，37°C溫度 培養(yǎng)48h，得到轉(zhuǎn)染質(zhì)粒復(fù)合物的細(xì)胞芯片。
[0101] 7、完成步驟6后，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒復(fù)合物的細(xì)胞芯片在25°C放置5min，PNI膜脫落，然后 使用PH7.4、10mM的PBS水溶液清洗3次，得到待檢測細(xì)胞芯片。
[0102] 8、細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測 [0103]同實施例1中步驟8。
[0104]實驗結(jié)果見圖2(A為重組質(zhì)粒乙，B為重組質(zhì)粒甲，其中Hoechst為細(xì)胞核染色結(jié) 果，F(xiàn)ITC為細(xì)胞質(zhì)的染色結(jié)果）。結(jié)果表明，與利用SAMcell芯片技術(shù)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒乙相比， 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒甲在相應(yīng)位置上的細(xì)胞小島，活性氧形成的比例明顯減少，說明細(xì)胞內(nèi)活性 氧減少，抗氧化活性提高。
[0105]實施例3、檢測化合物對HSF細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響
[0106] 檢測蘆薈凝膠粉(Aloe gel powder)或兒茶HKCatechin)對HSF細(xì)胞內(nèi)活性氧的 影響的具體步驟如下：
[0107] 1、用100mL DMS0溶解10mg蘆薈凝膠粉，得到溶液甲。用100mL DMS0溶解10mg兒茶 酚，得到溶液乙。
[0108] 2、取96孔板，每孔加入10yL DMS0、步驟1制備的溶液甲或溶液乙。
[0109] 3、完成步驟2后，取所述96孔板，每孔加入10yL明膠溶液，充分混勻，25 °C孵育 5min，得到的混合液即為反向轉(zhuǎn)染化合物復(fù)合物。
[0110] 4、完成步驟3后，利用點樣儀將所述反向轉(zhuǎn)染化合物復(fù)合物分別交錯的點在 SAMcell芯片的用于固定所述轉(zhuǎn)染化合物的區(qū)域，干燥過夜(25°C，12h)，得到固定化合物復(fù) 合物的芯片。
[0111] 5、完成步驟4后，將HSF細(xì)胞消化并吹打均勻，然后接種于所述固定化合物復(fù)合物 的芯片上(HSF細(xì)胞和化合物(蘆薈凝膠粉或兒茶酚）的配比為2X10 5個：lyg)，37°C溫度培 養(yǎng)48h，得到轉(zhuǎn)染化合物復(fù)合物的細(xì)胞芯片。
[0112] 6、完成步驟5后，將轉(zhuǎn)染化合物復(fù)合物的細(xì)胞芯片在25 °C放置5min，PNI膜脫落，然 后使用PH7.4、10mM的PBS水溶液清洗3次，得到待檢測細(xì)胞芯片。
[0113] 7、細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測
[0114] 同實施例1中步驟8。
[0115] 實驗結(jié)果見圖3(H〇eChst為細(xì)胞核染色結(jié)果，F(xiàn)ITC為細(xì)胞質(zhì)的染色結(jié)果）。結(jié)果表 明，利用SAMcell芯片技術(shù)轉(zhuǎn)染蘆薈凝膠粉或兒茶酚，在相應(yīng)位置上的細(xì)胞小島，活性氧形 成的比例明顯減少，說明細(xì)胞內(nèi)活性氧減少，抗氧化活性提高。
【主權(quán)項】
1. 自組裝細(xì)胞芯片在檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響中的應(yīng)用； 所述自組裝細(xì)胞芯片包括基底，在所述基底上設(shè)有用于固定所述待測物質(zhì)的區(qū)域;在 所述基底上除用于固定所述待測物質(zhì)的區(qū)域外的其他區(qū)域覆蓋抑制細(xì)胞生長的膜。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述待測物質(zhì)為SiRNA分子、質(zhì)粒或化合物。3. 如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述抑制細(xì)胞生長的膜為聚-N-異丙基丙 烯酰胺膜。4. 如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述s iRNA分子為al)或a2)或a3)或a4): al) -條鏈如序列表中序列1所示，另一條鏈如序列表中序列2所示； a2)如序列表中序列1自5'末端起第1至19位所示； a3) -條鏈如序列表中序列3所示，另一條鏈如序列表中序列4所示； a4)如序列表中序列3自5'末端起第1至19位所示； 所述質(zhì)粒為向表達載體多克隆位點插入序列表中序列5或序列表中序列6所示的雙鏈 DNA分子，得到的重組質(zhì)粒； 所述化合物為蘆薈凝膠粉或兒茶酚。5. -種檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響的方法，包括如下步驟： (1) 將待測物質(zhì)通過明膠包裹得到轉(zhuǎn)染復(fù)合物； (2) 將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物固定到自組裝細(xì)胞芯片上，得到固定待轉(zhuǎn)染物質(zhì)的芯片； 所述自組裝細(xì)胞芯片包括基底，在所述基底上設(shè)有用于固定所述待測物質(zhì)的區(qū)域;在 所述基底上除用于固定所述待測物質(zhì)的區(qū)域外的其他區(qū)域覆蓋抑制細(xì)胞生長的膜； (3) 將細(xì)胞接種到所述固定待轉(zhuǎn)染物質(zhì)的芯片上，培養(yǎng);檢測待測物質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)活性氧 的影響。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于： 所述步驟（1)中，所述將待測物質(zhì)通過明膠包裹得到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的方法包括如下步驟： 將待測物質(zhì)溶液與明膠溶液混勻，孵育，得到轉(zhuǎn)染復(fù)合物； 所述步驟(2)中，所述將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物固定到自組裝細(xì)胞芯片上的方法包括如下步 驟:先將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物點樣在所述自組裝細(xì)胞芯片上的用于固定所述待測物質(zhì)的區(qū)域， 再進行干燥。7. 如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于： 所述待測物質(zhì)為siRNA分子、質(zhì)粒或化合物； 所述待測物質(zhì)溶液為待測物質(zhì)水溶液； 所述明膠溶液由明膠、纖維連接蛋白和水組成，其中明膠在明膠溶液中的質(zhì)量百分含 量為0.25%，纖維連接蛋白在明膠溶液中的質(zhì)量百分含量為O. Ol %。8. 如權(quán)利要求5至7任一所述的方法，其特征在于： 所述步驟(3)中，所述細(xì)胞和所述siRNA分子的配比為I X IO5~1.2X IO5個：Iyg;所述細(xì) 胞和所述質(zhì)粒的配比為I. I X IO5~1.4 X IO5個：Iyg;所述細(xì)胞和所述化合物的配比為2 X IO5~2X107個：lyg。9. 如權(quán)利要求4至8任一所述的方法，其特征在于： 所述步驟（1)中，所述孵育的溫度為23~28°C，所述孵育的時間為5~30min; 所述步驟(2)中，所述干燥的時間為2~20h; 所述步驟(3)中，所述培養(yǎng)的溫度為34~45°C，所述培養(yǎng)的時間為12~48h。10.如權(quán)利要求4至9任一所述的方法，其特征在于:所述細(xì)胞為人皮膚成纖維細(xì)胞。
【文檔編號】C12Q1/02GK105950698SQ201610325704
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】張函槊, 李娟 , 龍菲菲
【申請人】蘇州吉諾瑞生物科技有限公司