血清中尿素氮肌酐雙項(xiàng)同時(shí)測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血清中尿素氮肌酐雙項(xiàng)同時(shí)測定方法，屬于利用可見光，通過測試反應(yīng)結(jié)果顏色的變化來測試材料的方法，其技術(shù)方案是：試劑II中僅有肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶有效組分；試劑I中含有尿素酶、谷氨酸脫氫酶、α?酮戊二酸、NADH有效成分；測定方法為：血清先與試劑Ⅰ于37℃溫浴3～5分鐘，血清中尿素與試劑Ⅰ反應(yīng)生成NAD+，加入試劑Ⅱ于37℃溫浴4～7分鐘，肌酐經(jīng)肌酐酰氨基水解酶水解后生成肌酸，肌酸經(jīng)肌酸脒基水解酶作用下生成尿素，尿素在尿素酶作用下與試劑I生成NAD+，在340nm波長處反應(yīng)速度與同樣處理過的標(biāo)準(zhǔn)品比較，測定中第一步反應(yīng)NADH變化即為血清中尿素氮的含量，第二步反應(yīng)NADH變化即為血清中肌酐的含量。
【專利說明】
血清中尿素氮肌酐雙項(xiàng)同時(shí)測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種同時(shí)測定尿素氮肌酐含量的方法，屬于一種包含酶的測定方法； 或是利用可見光，通過測試反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)生顏色變化來測試材料的方法，特別是涉及一種 用生化分析儀快捷、準(zhǔn)確檢測血清中尿素氮肌酐的測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 尿素是人體蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物，氨基酸脫氨基產(chǎn)生NH3和C02,兩者在肝臟 中合成尿素，每克蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生尿素氮〇.3g，尿素中氮含量為28/60,通常腎臟為排泄尿 素的主要器官，尿素從腎小球?yàn)V過后在各段小管均可重吸收，但腎小管內(nèi)尿流速越快重吸 收越少，也即達(dá)到了最大清除率，和血肌酐一樣，在腎功能損害早期，血尿素氮可在正常范 圍，當(dāng)腎小球?yàn)V過率下降到正常的50%以下時(shí)，血尿素氮的濃度才迅速升高，正常情況下， 血尿素氮與肌酐之比(BUN/Scr)值約為10,高蛋白飲食、高分解代謝狀態(tài)、缺水、腎缺血、血 容量不足及某些急性腎小球腎炎，均可使比值增高，甚至可達(dá)20~30;而低蛋白飲食，肝疾 病常使比值降低，此時(shí)可稱為低氮質(zhì)血癥。正常成人空腹BUN為3.2~7.1mmol/L(9~20mg/ dl)。各種腎實(shí)質(zhì)性病變，如腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、急慢性腎功能衰竭、腎內(nèi)占位性和破 壞性病變均可使血尿素氮增高，多腎外因素也可引起血尿素氮升高，如能排除腎外因素， BUN 21.4mmol/L(60mg/dl)即為尿毒癥診斷指標(biāo)之一。
[0003] 臨床實(shí)驗(yàn)室血和尿中肌酐的測定常用酶法或堿性苦味酸法(Jaffe法），Jaffe法雖 然試劑較便宜、重復(fù)性、準(zhǔn)確性也較好，但易受血清中其他假性肌酐物質(zhì)的干擾，尤其是當(dāng) 血清膽紅素值多165.5ymol/L時(shí)開始出現(xiàn)負(fù)偏差，而且血清膽紅素越高偏差越大。此外， Jaffe法受到酮體、乳糜血和溶血的嚴(yán)重干擾，頭孢類和維生素C及多巴胺等藥物也使其結(jié) 果出現(xiàn)較大干擾。
[0004] 酶法利用肌酐在肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、過氧化物酶 等酶及顯色劑和水、氧的共同作用下生成醌亞胺(紅色），在505nm波長下測定其吸光度A，其 A值的大小和樣品中肌酐的含量成正比的原理而設(shè)計(jì)的，由于酶本身具有的特異性及高效 性，肌酐酰氨基水解酐在反應(yīng)中針對肌酐而不受其他物質(zhì)的干擾，這使測定結(jié)果接近于真 值。
[0005] 血清（或血漿）中的尿素氮，在尿素氮試劑的酸性環(huán)境中與二乙酰-肟(DAM)共沸 后，可縮合成一紅色化合物，稱為fearon反應(yīng)。其顏色的深淺與血清(或血漿）中尿素氮的含 量成正比，與同樣處理的尿素氮標(biāo)準(zhǔn)液比色，即可測算出血清(或血漿）中尿素氮的含量。由 于此方法干擾性大，目前臨床實(shí)驗(yàn)室多多采用尿素酶偶聯(lián)法，用尿素酶分解尿素產(chǎn)生氨，氨 在谷氨酸脫氫酶的作用下使NADH氧化為NAD+時(shí)，通過340nm吸光度的降低值可計(jì)算出尿素 氮含量。
[0006] 血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)兩者分別為含氮的有機(jī)物和蛋白質(zhì)代謝的終末產(chǎn)物， 在腎功能正常的情況下，這些小分子物質(zhì)從腎小球?yàn)V出，故可用作腎小球?yàn)V過功能的診斷 和過篩指標(biāo)，當(dāng)腎小球?yàn)V過功能減低時(shí)，血肌酐和尿素氮因潴留而增高。
[0007]本發(fā)明研究一種在同一反應(yīng)體系中同時(shí)測定尿素氮肌酐的測定方法，血清中尿素 與試劑I反應(yīng)生成NAD+，加入試劑Π 于37°C溫浴4~7分鐘，肌酐經(jīng)肌酐酰氨基水解酶水解后 生成肌酸，肌酸經(jīng)肌酸脒基水解酶作用下生成尿素，尿素在尿素酶作用下與試劑I生成NAD +，在340nm波長處反應(yīng)速度與同樣處理過的標(biāo)準(zhǔn)品比較，測定中第一步反應(yīng)NADH變化即為 血清中尿素氮的含量，第二步反應(yīng)NADH變化即為血清中肌酐的含量。
[0008] 反應(yīng)過程為：
解決的問題是:我們僅以肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶為第二試劑的兩步酶測 定方法，由于第一步反應(yīng)體系中有尿素酶，谷氨酸脫氫酶，α-酮戊二酸，NADH，血清中的尿素 在尿素酶和谷氨酸脫氫酶的作用下生成NAD+;當(dāng)加入第二試劑后，血清中肌酐經(jīng)肌酐酰氨 基水解酶水解生成肌酸，肌酸經(jīng)肌酸脒基水解酶水解生成尿素，再經(jīng)尿素酶，谷氨酸脫氫酶 催化下與α_酮戊二酸，NADH反應(yīng)生成NAD+，儀器以第一步反應(yīng)NADH變化計(jì)算出尿素氮的含 量，以第二步NADH變化計(jì)算出肌酐的含量，在同一反應(yīng)體系中，尿素為待測物，由于在反應(yīng) 的全過程檢測的都為NADH變化，NADH的變化與尿素、肌酐呈等量關(guān)系，因此，可采用尿素氮 為標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行定標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0017] 為了能簡單及準(zhǔn)確地測定血清中尿素氮肌酐，本發(fā)明提供一種經(jīng)濟(jì)方便易行，準(zhǔn) 確性高、在同一反應(yīng)體系中同時(shí)測定尿素氮肌酐的測定方法。
[0018] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:試劑Π 內(nèi)僅含有肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶 及適量防腐劑;試劑I中含有尿素酶、谷氨酸脫氫酶、酮戊二酸、NADH等有效成分;其測定 方法為:血清先與試劑I于37°C溫浴3~5分鐘，血清中尿素與試劑I反應(yīng)生成NAD+，加入試劑 Π于37 °C溫浴4~7分鐘，肌酐經(jīng)肌酐酰氨基水解酶后生成肌酸，肌酸經(jīng)肌酸脒基水解酶作 用下生成尿素，尿素在尿素酶作用下生成NAD+，在340nm波長處反應(yīng)速度與同樣處理過的標(biāo) 準(zhǔn)品比較，第一步反應(yīng)NADH變化即為血清中尿素氮的含量，第二步反應(yīng)NADH變化即為血清 中肌酐的含量。
[0019] 尿素氮濃度=FXA〇DBUN/At
[0020] 肌酐濃度=FX Δ 〇D&/ Δ t
[0021] 其中Δ 〇DBUN/At是單位時(shí)間內(nèi)尿素氮產(chǎn)生的速率，Δ 〇DCr/At是單位時(shí)間內(nèi)肌酐 產(chǎn)生的速率，F(xiàn)是校正因數(shù)。
【附圖說明】 附圖1是本發(fā)明測定健康人體血清尿素氮肌酐雙項(xiàng)的反應(yīng)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】：
[0022] 下面通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0023] 實(shí)施例1
[0024]試劑的組成：
[0025] &.試劑1:
[0026] 試劑I內(nèi)含TRIS-鹽酸磷酸鹽緩沖液50mmol/L，尿素酶5000U/L，谷氨酸脫氫酶 9000U/L，a-酮戊二酸 160mmol/L，NADH 3.0mmol/L，Proclin-300 150~250μ1〇
[0027] b.試劑 Π:
[0028] 試劑Π內(nèi)含TRIS-鹽酸磷酸鹽緩沖液50mmol/L，肌酐酰氨基水解酶20KU/L，肌酸脒 基水解酶 20KU/L，Proclin-300 150 ~250μ1〇
[0029] c.標(biāo)準(zhǔn)液:標(biāo)準(zhǔn)液為7.14mmol/尿素氮。
[0030] 實(shí)施例2
[0031]測定程序
[0032]測定方法:在日本OLYMPUS AU2700全自動化生化分析儀上，儀器自動將3μ1樣品加 入到225μ1試劑I中混勻，37 °C孵育3分鐘，加入75μ1試劑Π混勻，37 °C孵育5.1分鐘，全自動 分析儀在340nm波長處檢測。儀器自動計(jì)算出尿素氮肌酐結(jié)果，具體見表1:
[0033] 表1.本發(fā)明自動化生化分析儀測試條件
[0034]
[0035] 尿素氮濃度=F X Δ 〇DBUN/ Δ t
[0036] 肌酐濃度=FX Δ 〇Dcr/ Δ t
[0037] 其中Δ 〇DBUN/At是單位時(shí)間內(nèi)尿素氮產(chǎn)生的速率，Δ 〇DCr/At是單位時(shí)間內(nèi)肌酐 產(chǎn)生的速率，F(xiàn)是校正因數(shù)，測定方法為帶標(biāo)準(zhǔn)的速率法，其實(shí)時(shí)反應(yīng)曲線如附圖1所示。 [0038]下面通過采用本發(fā)明方法與《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》推薦方法比較來驗(yàn)證本法 的準(zhǔn)確性。
[0039] 1.檢測對象：腎功能正常及異常患者426例，其中男240人，平均年齡42.5歲；女性 186人，平均年齡41.5歲，空腹靜脈采血2. OmL。
[0040] 2.采用方法及試劑
[0041 ] 2.1試劑：
[0042] (1)本發(fā)明方法采用實(shí)施例1中的試劑I、試劑Π。
[0043] (2)對照方法采用北京利德曼生化股份有限公司生產(chǎn)的尿素紫外分光度法試劑 盒;肌酐采用肌酐氧化酶測定法試劑盒。
[0044] 2.2.儀器：（1)日本Olympus AU2700型全自動生化分析儀。
[0045] 2.3.方法
[0046] 2.3.1對照方法尿素氮測定方法樣品2以1，試劑120(^1，試劑114(^137°(：，反應(yīng) 時(shí)間90秒，340nm波長處速率法測定。肌酐測定樣品3μ1，試劑I 180μ1，試劑II 60μ1 37°C， 反應(yīng)時(shí)間300秒，340nm波長處速率法測定。
[0047] 2.3.2.本發(fā)明方法樣品3以1，試劑1 225以1，試劑1175以137°(：，反應(yīng)時(shí)間180秒后， 在340nm波長處測定點(diǎn)為P3~P9，計(jì)算出尿素氮含量;加入試劑II后，儀器自動溫浴5.1分鐘 內(nèi)，在340nm波長處測定點(diǎn)為P 15~P21，計(jì)算出肌酐含量，其實(shí)時(shí)反應(yīng)曲線如圖1。
[0048] 本發(fā)明方法與對照方法尿素氮、肌酐測定結(jié)果比較如表2,3。
[0049] 表2.兩種方法測定待檢者血清尿素氮測定結(jié)果比較(mmol/L)
[0050]
[0051] 表3.兩種方法測定待檢者血清肌酐測定結(jié)果比較(ymol/L)
[0052]
[0053] 從表2,3測定結(jié)果得知，本發(fā)明與《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》推薦方法測定結(jié)果相 關(guān)性良好，測定批內(nèi)、批間精密度符合要求，測定范圍符合臨床需要，尿素氮、肌酐結(jié)果在同 一反應(yīng)體系中能夠同時(shí)測出，反映出腎功能狀況對病人的診斷與治療具有重要意義。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種血清中尿素氮肌酐雙項(xiàng)同時(shí)測定方法，其特征在于試劑π內(nèi)僅含有肌酐酰氨基 水解酶、肌酸脒基水解酶有效成分;試劑I中含有尿素酶、谷氨酸脫氫酶、α-酮戊二酸、NADH 等有效成分;測定方法為:血清先與試劑I于37°C溫浴3~5分鐘，血清中尿素與試劑I反應(yīng)生 成NAD+，加入試劑Π 于37°C溫浴4~7分鐘，肌酐經(jīng)肌酐酰氨基水解酶后生成肌酸，肌酸經(jīng)肌 酸脒基水解酶作用下生成尿素，尿素在尿素酶作用下生成NAD+，在340nm波長處反應(yīng)速度與 同樣處理過的標(biāo)準(zhǔn)品比較，第一步反應(yīng)NADH變化即為血清中尿素氮的含量，第二步反應(yīng) NADH變化即為血清中肌酐的含量。 尿素 Ml 濃度=F X AODbun/At 肌酐濃度=F X A〇DCr/At 其中Δ ODbun/ Δ t是單位時(shí)間內(nèi)尿素氮產(chǎn)生的速率，Δ ODcr/ Δ t是單位時(shí)間內(nèi)肌酐產(chǎn)生 的速率，F(xiàn)是校正因數(shù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清中尿素氮肌酐雙項(xiàng)同時(shí)測定方法，其特征在于試劑I內(nèi)含 TRIS-鹽酸緩沖液30~70mmol/L，尿素酶4000~6000U/L，谷氨酸脫氫酶8000~10000U/L，a-酮戊二酸140~180111111〇1/1，嫩0!12.0~4.0111111〇1/1，？『〇。1111-300 150~25(^1;試劑11內(nèi)含 TRIS-鹽酸緩沖液30~70mmol/L，肌酐酰氨基水解酶18~22KU/L，肌酸脒基水解酶18~ 22KU/L，Proclin-300 150~250μ1〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清中尿素氮肌酐雙項(xiàng)同時(shí)測定方法，其特征在于試劑I及試 劑Π 中防腐劑選自Proclin-300。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清中尿素氮肌酐雙項(xiàng)同時(shí)測定方法，其特征在于試劑I和試 劑Π 中磷酸鹽緩沖液的pH值為7.7 ±0.2。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清中尿素氮肌酐雙項(xiàng)同時(shí)測定方法，其特征在于測定所用 各物品的體積比為:樣品：試劑I:試劑Π = 1:70~80:20~30。
【文檔編號】C12Q1/32GK105950704SQ201610266683
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】李立和, 丁弘, 魏志斌
【申請人】天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院