一種平菇菌種鑒別的方法及專用dna條形碼片段的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種平菇菌種鑒別的方法及專用DNA條形碼片段。本發(fā)明提供了DNA片段，為如下1)或2)：1)、序列3所示的DNA片段；2)、為與1)所示片段的核苷酸序列同源性大于99％的片段。本發(fā)明提供的平菇DNA條形碼片段，其可以用于鑒別平菇菌種，用該片段鑒別有利于縮短平菇菌種鑒定時(shí)間，提高鑒定準(zhǔn)確性，用該方法最快48小時(shí)可以準(zhǔn)確鑒定平菇菌種，避免栽培出菇以后才發(fā)現(xiàn)菌種錯(cuò)誤的后果。
【專利說(shuō)明】
一種平菇菌種鑒別的方法及專用DNA條形碼片段
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及DNA條形碼快速鑒別食用菌菌種，尤其涉及一種平 菇菌種鑒別的方法及專用DNA條形碼片段。
【背景技術(shù)】
[0002] 食用菌是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物和出口農(nóng)產(chǎn)品。我國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)經(jīng)過(guò)30多年高速發(fā) 展，2014年產(chǎn)量已超過(guò)2800萬(wàn)噸、產(chǎn)值超過(guò)2000億元，已成為世界上最大的食用菌生產(chǎn)大 國(guó)。其中平菇產(chǎn)量最大，達(dá)560萬(wàn)噸，居世界第一。菌種質(zhì)量好壞對(duì)食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展十分重 要。食用菌產(chǎn)業(yè)有"一支母種影響一個(gè)食用菌產(chǎn)業(yè)"的說(shuō)法。菌種在平菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起著 重要的、不可替代的作用。近年來(lái)菌種事故多數(shù)是菌種錯(cuò)誤造成的，菌種隨意改名，假冒偽 劣菌種擾亂市場(chǎng)，坑農(nóng)時(shí)間時(shí)有發(fā)生。因此，菌種的真實(shí)性檢測(cè)在平菇菌種質(zhì)量檢測(cè)中顯得 至關(guān)重要。
[0003] 常規(guī)檢測(cè)手段主要有：肉眼感官觀察、菌絲生長(zhǎng)速度、農(nóng)藝性狀和商品性狀檢驗(yàn)、 同工酶電泳法、ISSR法等。這些方法耗時(shí)多，具有一定的組織與發(fā)育階段的特異性，結(jié)果不 可靠。
[0004] DNA條形碼技術(shù)是利用一段標(biāo)準(zhǔn)、通用的DNA序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定 的目的。該技術(shù)鑒定樣品具有不受其生長(zhǎng)發(fā)育階段影響、所需材料少，操作簡(jiǎn)單，所需時(shí)間 短，結(jié)果可靠等優(yōu)勢(shì)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)平菇菌種快速可靠的物種鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種DNA片段。
[0006] 本發(fā)明提供的DNA片段，為如下1)或2)或3):
[0007] 1)、序列3所示的DNA片段；
[0008] 2)、序列3第21-375位核苷酸所示的DNA片段；
[0009] 3)、為與1)或2)所示片段的核苷酸序列同源性大于99%的片段。
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述DNA片段的新用途。
[0011] 本發(fā)明提供了所述DNA片段在鑒別或輔助鑒別平菇菌種中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明第3個(gè)目的是提供檢測(cè)平菇菌種基因組中是否含有所述DNA片段的物質(zhì)的 新用途。
[0013] 本發(fā)明提供了檢測(cè)平菇菌種基因組中是否含有所述DNA片段的物質(zhì)在鑒別平菇菌 種中的應(yīng)用。
[0014] 上述應(yīng)用中，所述檢測(cè)平菇菌種基因組中是否含有所述DNA片段的物質(zhì)為如下1) 或2):
[0015] 1)用于擴(kuò)增所述DNA條形碼片段的引物對(duì)；
[0016] 2)含有所述引物對(duì)的PCR試劑或試劑盒。
[0017] 上述應(yīng)用中，所述引物對(duì)由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2 所示的單鏈DNA分子組成。
[0018] 或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的摩爾比為1:1。
[0019] 或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的濃度均為lOymol/L。
[0020] 本發(fā)明第4個(gè)目的是提供一種鑒別或輔助鑒別平菇菌種的方法。
[0021] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有所述DNA片段;如果 含有，則待測(cè)樣品為或候選為平菇菌種；如果不含有，則待測(cè)樣品不為或候選不為平菇菌 種。
[0022]上述方法中，
[0023]所述檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有所述DNA片段的方法包括如下步驟：
[0024] 1)用序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組 成的引物對(duì)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0025] 2)測(cè)序所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與所述DNA片段進(jìn)行比對(duì)，若 同源性大于99%，則待測(cè)樣品中含有所述DNA片段，若同源性小于等于99%，則待測(cè)樣品中 不含有所述DNA片段。
[0026]上述方法中，
[0027]所述PCR擴(kuò)增的模板為待測(cè)樣品的基因組DNA。
[0028] 本發(fā)明第5個(gè)目的是提供檢測(cè)平菇菌種基因組中是否含有所述DNA片段的物質(zhì)。
[0029] 本發(fā)明提供的檢測(cè)平菇菌種基因組中是否含有所述DNA片段的物質(zhì)，其為如下1) 或2):
[0030] 1)用于擴(kuò)增所述DNA條形碼片段的引物對(duì)；
[0031 ] 2)含有所述引物對(duì)的PCR試劑或試劑盒。
[0032] 上述物質(zhì)中，所述引物對(duì)由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2 所示的單鏈DNA分子組成。
[0033]或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的摩爾比為1:1。
[0034] 或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的濃度均為lOymol/L。
[0035]為克服形態(tài)特征、生化及傳統(tǒng)分子標(biāo)記鑒定平菇菌種的缺陷，本發(fā)明提供了一種 平菇(Pleurotus cornucopiae，白黃側(cè)耳，又名小平菇、美味側(cè)耳、紫孢平菇、平菇)菌種DNA 條形碼鑒定方法，可以快速準(zhǔn)確地鑒別平菇菌種。
[0036]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的平菇DNA條形碼片段，其可以用于鑒別平菇菌 種，用該片段鑒別有利于縮短平菇菌種鑒定時(shí)間，提高鑒定準(zhǔn)確性，用該方法最快48小時(shí)可 以準(zhǔn)確鑒定平菇菌種，避免栽培出菇以后才發(fā)現(xiàn)菌種錯(cuò)誤的后果。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0038] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0039] 實(shí)施例1、平菇菌種鑒別DNA條形碼片段的獲得及方法的建立
[0040] 1、平菇菌種的基因組DNA獲得 [00411提取平菇菌種的基因組DNA。
[0042] 2、PCR 擴(kuò)增
[0043] 以上述1得到的基因組DNA為模板，用引物7 28F和引物1567R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0044] 728F: 5 ' -CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3 '（序列 1)
[0045] 1567R:5'-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3'（序列2)
[0046] 上述PCR擴(kuò)增體系為如下表1:
[0047] 表1為PCR反應(yīng)體系的組成(25yL)
[0049] 上述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，63°C退火55s，每個(gè)循環(huán)降低 1°C，72°C延伸9〇8，10個(gè)循環(huán);94°(：變性3〇8,53°(：退火558,72°(：延伸9〇8,36個(gè)循環(huán) ；最后72 °C7min〇
[0050] 得到800bp左右的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[00511 將800bp左右的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送去測(cè)序，測(cè)序引物為728F和Ef jr ;引物序列為： Efjr:5 '-TGYTCNCGRGTYTGNCCRTCYTT-3 '。
[0052]該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列3所示的核苷酸，其中序列3第1-20位為上游引物 728F，序列3第376-398位為下游引物Efjr的反向互補(bǔ)序列，該序列所示的片段或序列3第 21-375為平菇菌種鑒別DNA條形碼片段。
[0053] 平菇菌種鑒別DNA條形碼片段可用于鑒別平菇，具體方法如下：
[0054] 檢測(cè)待測(cè)樣品的基因組中是否含有平菇菌種標(biāo)準(zhǔn)鑒別DNA條形碼片段或含有與其 同源性在99%以上的片段，若含有，則待測(cè)樣品是平菇菌種，若不含有，則待測(cè)樣品不是平 菇菌種。
[0055]實(shí)施例2、鑒別平菇菌種 [0056] 1、本發(fā)明方法特異性檢測(cè)
[0057]分別提取已知品種的平菇菌種、杏鮑菇菌種的基因組DNA。
[0058]以各品種的基因組DNA作為模板，用上述引物728F和1567R擴(kuò)增，得到各品種的PCR 產(chǎn)物。
[0059] 將各品種的PCR產(chǎn)物送去測(cè)序，結(jié)果如下：
[0060] 已知品種的平菇菌種的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列3(平菇菌種鑒別DNA條形碼 片段）。
[0061] 已知品種的杏鮑菇菌種的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列4(序列4第1-20位為上游 引物728F，序列4第375-397位為下游引物Efjr的反向互補(bǔ)序列）；
[0062]已知品種的平菇菌種用本發(fā)明方法也鑒別為平菇菌種；
[0063]已知品種的杏鮑菇菌種的PCR產(chǎn)物的序列4第21-374位核苷酸與平菇鑒別DNA條形 碼片段序列3第21-375位核苷酸進(jìn)行比對(duì)，同源性為96.6%，已知品種的杏鮑菇菌種用本發(fā) 明方法鑒別不為平菇菌種。
[0064] 2、ITS鑒定與本發(fā)明方法比較
[0065]分別提取已知品種的小平菇菌種與杏鮑菇菌種的基因組DNA。
[0066]以各品種的基因組DNA作為模板，用上述引物ITS1和引物ITS4擴(kuò)增，得到各品種的 PCR產(chǎn)物。
[0067] ITS1:5 '-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '
[0068] ITS4:5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '
[0069] 上述PCR擴(kuò)增體系為表2:
[0070] 表2PCR反應(yīng)體系的組成（25yL)
[0073] 上述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s， 30個(gè)循環(huán)；最后72°C10min。
[0074] 得到650bp左右的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0075] 將650bp左右的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送去測(cè)序，得到小平菇菌種ITS序列（序列5,其中1-19 位為引物ITSl，614-633位為引物ITS4反向互補(bǔ)序列）與杏鮑菇菌種ITS序列（序列6,其中1-19位為引物ITSl，613-632位為引物ITS4反向互補(bǔ)序列）。
[0076] 序列5第20-613位與序列6第20-612位同源性為:98.0% (該同源性為均不含上下 游引物的序列的比較），異質(zhì)性為2.0%，即小平菇菌種與杏鮑菇菌種ITS序列的異質(zhì)性為 2.0%。而本方法得到的兩者同源性為96.6%，異質(zhì)性為3.4%。靈敏度高于ITS序列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種DNA片段，為如下1)或2)或3): 1) 、序列3所示的DNA片段； 2) 、序列3第21-375位核苷酸所示的DNA片段； 3) 、為與1)或2)所示片段的核苷酸序列同源性大于99%的片段。2. 權(quán)利要求1所述的DNA片段在鑒別或輔助鑒別平菇菌種中的應(yīng)用。3. 檢測(cè)平菇菌種基因組中是否含有權(quán)利要求1所述DNA片段的物質(zhì)在鑒別平菇菌種中 的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述物質(zhì)為如下1)或2): 1) 用于擴(kuò)增所述DNA片段的引物對(duì)； 2) 含有所述引物對(duì)的PCR試劑或試劑盒。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述引物對(duì)由序列表中序列1所示的單鏈 DNA分子和序列表中序列2所不的單鏈DNA分子組成； 或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的摩爾比為1:1; 或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的濃度均為lOymol/L。6. -種鑒別或輔助鑒別平菇菌種的方法，包括如下步驟:檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有權(quán) 利要求1所述DNA片段;如果含有，則待測(cè)樣品為或候選為平菇菌種;如果不含有，則待測(cè)樣 品不為或候選不為平菇菌種。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于： 所述檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有權(quán)利要求1所述DNA片段的方法包括如下步驟： 1) 用序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成的 引物對(duì)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 2) 測(cè)序所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與所述DNA片段進(jìn)行比對(duì)，若同源 性大于99%，則待測(cè)樣品中含有所述DNA片段，若同源性小于等于99%，則待測(cè)樣品中不含 有所述DNA片段。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于： 所述PCR擴(kuò)增的模板為待測(cè)樣品的基因組DNA。9. 檢測(cè)平菇菌種基因組中是否含有權(quán)利要求1所述DNA片段的物質(zhì)，其為如下1)或2): 1) 用于擴(kuò)增所述DNA片段的引物對(duì)； 2) 含有所述引物對(duì)的PCR試劑或試劑盒。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的物質(zhì)，其特征在于:所述引物對(duì)由序列表中序列1所示的單鏈 DNA分子和序列表中序列2所不的單鏈DNA分子組成； 或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的摩爾比為1:1; 或所述PCR試劑中，所述引物1和所述引物2的濃度均為lOymol/L。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK105950776SQ201610554693
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年7月14日
【發(fā)明人】趙鵬, 紀(jì)森鵬, 周軍輝, 高興喜
【申請(qǐng)人】魯東大學(xué)