一種富硒地頂孢霉菌株及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種富硒地頂孢霉菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的地頂孢霉FA1603，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2016331。本發(fā)明還保護(hù)一種地頂孢霉培養(yǎng)物和培養(yǎng)地頂孢霉FA1603的方法。地頂孢霉FA1603發(fā)酵生產(chǎn)高蟲草素含量的富硒地頂孢霉培養(yǎng)物產(chǎn)品的有機(jī)硒含量高，尤以活性的硒蛋氨酸為主，而且富含蟲草活性成分，特別突出蟲草素的含量，其對(duì)于飼料添加方面，安全無毒、無副作用，可顯著改善動(dòng)物肉質(zhì)營養(yǎng)，提高肉質(zhì)品質(zhì)，同時(shí)促進(jìn)動(dòng)物健康發(fā)育，提高機(jī)體免疫力，具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。CCTCC NO: M201633120160615
【專利說明】
一種富砸地頂孢霉菌株及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種富硒地頂孢霉菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 傳統(tǒng)上，蟲草菌是麥角菌科Clavicipitaceae中蟲草屬Cordyceps sensu lato的 所有真菌的統(tǒng)稱，是形成"蟲草"的真菌。目前，全世界報(bào)道記載和蟲草菌有關(guān)的名稱已超過 500多個(gè)，中國已報(bào)道約120種。蟲草菌的寄主范圍十分廣泛，可以寄生動(dòng)物(包括昆蟲、蜘 蛛、螨類和線蟲等)或者其他真菌（如大團(tuán)囊菌屬Elaphomyces Nees和麥角菌屬Claviceps Tul.的真菌）。部分蟲草菌與寄主的復(fù)合物在傳統(tǒng)中藥中可直接入藥，如冬蟲夏草、蛹蟲草 及蟬花等，而且多數(shù)蟲草菌還能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)。現(xiàn)代研究表明，蟲草菌中的活性成 分在臨床醫(yī)學(xué)與保健中發(fā)揮著重要的作用，尤其是蟲草素具備抑菌、抗腫瘤、抗病毒、免疫 調(diào)節(jié)、清除自由基等多種生物學(xué)活性。作為蟲草類產(chǎn)品標(biāo)志性的有效成分，蟲草素一直是蟲 草菌相關(guān)活性成分的研究重點(diǎn)。在眾多蟲草菌中，冬蟲夏草菌和蛹蟲草菌無論是基礎(chǔ)研究 還是開發(fā)利用都在蟲草菌中處于突出的地位，已成為蟲草菌研究中的"模式物種"。近年來， 科學(xué)工作者們在蟲草菌及其無性型的生物學(xué)特征、人工栽培、液體深層發(fā)酵培養(yǎng)、培養(yǎng)基組 成、培養(yǎng)條件優(yōu)化、菌絲體及代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分檢測、分離、提取、純化極其功能、優(yōu)良菌 株選育、功能性食品研制、保健藥物開發(fā)等方面進(jìn)行了大量的研究，但效果并不理想，反而 針對(duì)蟲草類產(chǎn)品的質(zhì)疑越來越多。
[0003] 地頂孢霉是一種蟲草真菌，它多是寄生于蟲草之中，能夠合成多種藥理活性物質(zhì)， 其菌絲體及培養(yǎng)物含有多類藥理活性成分，經(jīng)測試，這些藥理活性成分具有體外抗腫瘤活 性以及增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)免疫活性的功能，因此可用于飼料添加劑及藥品和保健食品的制備。 國內(nèi)已開發(fā)出多種地頂孢霉及其培養(yǎng)物等相關(guān)產(chǎn)品，但這些產(chǎn)品（包括飼料添加劑和保健 食品）均未在宣傳和包裝上標(biāo)明蟲草素含量。其中最主要的原因是其蟲草素含量普遍不高。 蟲草的幾種主要活性成分中，唯有蟲草素是蟲草類的特有成分，其他活性成分都有各自的 功能，但若能提高蟲草及其產(chǎn)品的蟲草素含量，不僅可以提高應(yīng)用效果，還可以在宣傳和包 裝上突出蟲草素含量，促進(jìn)蟲草及其產(chǎn)品的銷售推廣，為開發(fā)帶來可觀利潤。
[0004]在我國，硒的缺乏是一個(gè)普遍存在的問題。對(duì)缺硒地區(qū)而言，通過補(bǔ)充無機(jī)硒 源一一亞硒酸鈉，其吸收利用率低、安全性差，補(bǔ)硒還應(yīng)主要以富含有機(jī)硒為好，因有機(jī)硒 在利用率方面要優(yōu)于無機(jī)硒，而通過微生物吸收、轉(zhuǎn)化、富集的硒就是一類生物利用率非常 高的硒源。一般而言，食用菌型微生物都具有較強(qiáng)的富硒能力和較高的產(chǎn)率，而富硒酵母的 產(chǎn)率僅為1%左右，因此，富硒蟲草菌將較富硒酵母具有更高的產(chǎn)量。不僅如此，蟲草菌含有 多種活性成分，蟲草菌富硒之后將較其他富硒產(chǎn)品更具生物活性。但目前發(fā)現(xiàn)的地頂孢霉 菌株，其次級(jí)代謝產(chǎn)物蟲草素等活性成分的含量均不高，限制了對(duì)地頂孢霉的進(jìn)一步利用。 不僅如此，目前，還未有富硒地頂孢霉菌株及其培養(yǎng)物制備方面的報(bào)道，如何在提高地頂孢 霉菌株最主要活性成分蟲草素的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)菌株對(duì)硒的轉(zhuǎn)化與富集，開發(fā)集蟲草真菌和 硒的諸多生理功能于一體的新型地頂孢霉培養(yǎng)物產(chǎn)品成為一個(gè)新的研究課題，其對(duì)進(jìn)一步 開發(fā)地頂孢霉及其培養(yǎng)物的應(yīng)用方面具有顯著創(chuàng)新價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種富硒地頂孢霉菌株及其應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供的地頂抱霉FA1603(Acremonium terricola FA1603)，已于2016年06 月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC;地址：中國武漢，武漢大學(xué)；郵編： 430072)，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2016331。地頂孢霉FA1603(Acremonium terricola FA1603)CCTCC N0:M2016331 簡稱為地頂孢霉FA1603。
[0007]本發(fā)明還保護(hù)一種地頂孢霉培養(yǎng)物，是通過培養(yǎng)所述地頂孢霉FA1603得到的。 [0008]所述地頂孢霉培養(yǎng)物的用途為如下（1)或(2)或(3):
[0009] (1)制備富硒飼料添加劑；
[0010] (2)制備富硒保健品；
[0011] (3)制備富硒食品。
[0012] 所述培養(yǎng)物的硒含量大于等于800mg/kg，甚至可達(dá)1000mg/kg，且大于等于 80.23%的硒為有機(jī)硒形態(tài)，甚至可達(dá)99 %的硒為有機(jī)硒形態(tài)，其中硒蛋氨酸占富硒酵母產(chǎn) 品有機(jī)砸含量的至少40%，甚至可達(dá)60%。
[0013] 所述培養(yǎng)物中的蟲草素含量大于等于6.0g/kg培養(yǎng)物干重，甚至可達(dá)8.0 g/kg培 養(yǎng)物干重。
[0014] 本發(fā)明還保護(hù)所述地頂孢霉FA1603或所述培養(yǎng)物的應(yīng)用，為如下（1)或(2)或(3):
[0015] (1)制備富硒飼料添加劑；
[0016] (2)制備富硒保健品；
[0017] (3)制備富硒食品。
[0018] 本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，其活性成分為所述地頂孢霉FA1603或所述地頂孢霉 FA1603的培養(yǎng)物。
[0019] 所述產(chǎn)品為食品、保健品或飼料添加劑。
[0020] 所述產(chǎn)品的有機(jī)硒含量大于等于800mg/kg，甚至可達(dá)1000mg/kg，且大于等于 80.23%的硒為有機(jī)硒形態(tài)，甚至可達(dá)99 %的硒為有機(jī)硒形態(tài)，其中硒蛋氨酸占富硒酵母產(chǎn) 品有機(jī)砸含量的至少40%，甚至可達(dá)60%。
[0021] 所述產(chǎn)品的蟲草素含量大于等于6.0g/kg，甚至可達(dá)8.0 g/kg。
[0022]本發(fā)明還保護(hù)一種培養(yǎng)所述地頂孢霉FA1603的方法，依次包括如下步驟(a)、步驟 (b)和步驟(c):
[0023] 步驟(a):采用種子強(qiáng)化培養(yǎng)基培養(yǎng)地頂孢霉FA1603;
[0024] 步驟(b):將步驟(a)的產(chǎn)物接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
[0025] 步驟(c):將步驟(b)的產(chǎn)物接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
[0026] 本發(fā)明還保護(hù)一種制備地頂孢霉培養(yǎng)物的方法，包括如下步驟:培養(yǎng)所述地頂孢 霉FA1603。
[0027] 所述方法依次包括如下步驟(a)、步驟(b)和步驟(c):
[0028] 步驟(a):采用所述的種子強(qiáng)化培養(yǎng)基培養(yǎng)地頂孢霉FA1603;
[0029]步驟(b):將步驟(a)的產(chǎn)物接種至所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
[0030] 步驟(c):將步驟(b)的產(chǎn)物接種至所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
[0031] 以上任一所述步驟(a)具體可為將地頂孢霉FA1603接種至種子強(qiáng)化培養(yǎng)基(地頂 孢霉FA1603在培養(yǎng)體系中的初始濃度為0.5 X 105個(gè)/ml)，25 °C培養(yǎng)3天，得到強(qiáng)化種子培養(yǎng) 物(地頂孢霉FA1603在培養(yǎng)體系中的孢子濃度為1012個(gè)/克培養(yǎng)物）。
[0032]以上任一所述步驟(b)具體可為:將100g步驟(a)的產(chǎn)物接種至15L液體發(fā)酵培養(yǎng) 基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0033]以上任一所述步驟(b)的培養(yǎng)條件為：發(fā)酵罐通氣量為10-20L/min，攪拌控制為 150-250rpm，溫度控制在25°C，控制溶解氧(D0)為30%-50%。
[0034] 以上任一所述步驟(b)的培養(yǎng)過程具體可為:發(fā)酵周期為96小時(shí)。發(fā)酵起始時(shí)，培 養(yǎng)體系的pH為7.0,在發(fā)酵培養(yǎng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測培養(yǎng)體系中的還原糖濃度及pH，通過加入 70 %的葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.5-1.0g/100mL(每當(dāng)培養(yǎng)體系中的 還原糖濃度低于〇. 5g/100mL時(shí)，加入70 %的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達(dá) 到1.0g/100mL)，通過流加氨水控制發(fā)酵全過程中pH為7.0。培養(yǎng)全程參數(shù)為:發(fā)酵罐通氣量 為15L/min，攪拌控制為200rpm，溫度控制在25°C，控制溶解氧(D0)為40%。
[0035] 以上任一所述步驟(b)的培養(yǎng)過程具體可為:發(fā)酵周期為96小時(shí)。發(fā)酵起始時(shí)，培 養(yǎng)體系的pH為6.5,在發(fā)酵培養(yǎng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測培養(yǎng)體系中的還原糖濃度及pH，通過加入 70 %的葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.5-1.0g/100mL(每當(dāng)培養(yǎng)體系中的 還原糖濃度低于〇. 5g/100mL時(shí)，加入70 %的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達(dá) 到1.0g/100mL)，通過流加氨水控制發(fā)酵全過程中pH為6.0。培養(yǎng)全程參數(shù)為:發(fā)酵罐通氣量 為10L/min，攪拌控制為150rpm，溫度控制在25°C，控制溶解氧(D0)為30%。
[0036] 以上任一所述步驟(b)的培養(yǎng)過程具體可為:發(fā)酵周期為96小時(shí)。發(fā)酵起始時(shí)，培 養(yǎng)體系的pH為7.5,在發(fā)酵培養(yǎng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測培養(yǎng)體系中的還原糖濃度及pH，通過加入 70 %的葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.5-1.0g/100mL(每當(dāng)培養(yǎng)體系中的 還原糖濃度低于〇. 5g/100mL時(shí)，加入70 %的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達(dá) 到1.0g/100mL)，通過流加氨水控制發(fā)酵全過程中pH為7.5。培養(yǎng)全程參數(shù)為:發(fā)酵罐通氣量 為20L/min，攪拌控制為250rpm，溫度控制在25°C，控制溶解氧(D0)為50%。
[0037]以上任一所述步驟(c)具體可為將步驟(b)的產(chǎn)物接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培 養(yǎng)(每1L的液體發(fā)酵產(chǎn)物接種至5kg的固體發(fā)酵培養(yǎng)基上）。
[0038]以上任一所述步驟（c)的培養(yǎng)條件具體可為：固體發(fā)酵溫度25°C，濕度為60%-80%，光照強(qiáng)度為100-200LX，發(fā)酵時(shí)間為3-5天，每天光照時(shí)間10小時(shí)、黑暗14小時(shí)。
[0039]以上任一所述步驟(c)的培養(yǎng)條件具體可為：固體發(fā)酵溫度25°C，濕度為70%，光 照強(qiáng)度為150Lx，發(fā)酵時(shí)間為4天，每天光照時(shí)間10小時(shí)、黑暗14小時(shí)。
[0040]以上任一所述步驟(c)的培養(yǎng)條件具體可為：固體發(fā)酵溫度25°C，濕度為60%，光 照強(qiáng)度為l〇〇Lx，發(fā)酵時(shí)間為5天，每天光照時(shí)間10小時(shí)、黑暗14小時(shí)。
[0041]以上任一所述步驟(c)的培養(yǎng)條件具體可為：固體發(fā)酵溫度25°C，濕度為80%，光 照強(qiáng)度為200Lx，發(fā)酵時(shí)間為3天，每天光照時(shí)間10小時(shí)、黑暗14小時(shí)。
[0042]本發(fā)明還保護(hù)一種用于培養(yǎng)所述地頂孢霉FA1603的試劑盒，包括所述種子強(qiáng)化培 養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基和固體發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0043]本發(fā)明還保護(hù)一種用于制備地頂孢霉培養(yǎng)物的試劑盒，包括所述種子強(qiáng)化培養(yǎng) 基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基和固體發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0044]所述試劑盒的用途為如下（1)或(2)或(3):
[0045] (1)制備富硒飼料添加劑；
[0046] (2)制備富硒保健品；
[0047] (3)制備富硒食品。
[0048]本發(fā)明還保護(hù)所述試劑盒的應(yīng)用，為如下（1)或(2)或(3):
[0049] (1)制備富硒飼料添加劑；
[0050] (2)制備富硒保健品；
[00511 (3)制備富硒食品。
[0052]以上任一所述種子強(qiáng)化培養(yǎng)基的原料配比為：1L營養(yǎng)液:0.5-1.5kg小米;所述營 養(yǎng)液由溶質(zhì)和溶劑組成;所述溶質(zhì)及其在所述營養(yǎng)液中的濃度如下:黃豆粉l_3g/100ml、蔗 糖0 · 5-1 · 5g/100ml、酵母膏0 · 4-0 · 6g/100ml、蛋白胨0 · 2-0 · 4g/100ml、磷酸二氫鉀0 · 04-0 · 06g/100ml、硫酸鎂0 · 005-0 · 015g/100ml、硫酸亞鐵8-12mg/100ml、維生素 B1 l-3mg/ 100ml、維生素 B2 0.5-1.5mg/100ml、維生素 B6 0.5-1.5mg/100ml、維生素 B12 4-6yg/ 100ml;所述溶劑為水。
[0053]所述種子強(qiáng)化培養(yǎng)基的原料配比具體可為：1L營養(yǎng)液：1.0kg小米。
[0054] 所述種子強(qiáng)化培養(yǎng)基的制備方法具體可為:將營養(yǎng)液與小米混合均勻，隔水蒸(時(shí) 間具體可為45min)。
[0055] 以上任一所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成;所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵 培養(yǎng)基中的濃度如下：葡萄糖4_6g/100ml、大豆粉l-3g/100ml、玉米粉0.6-1.0g/100ml、蛋 白胨 l-2g/100ml、酵母膏 0.6-1.0g/100ml、磷酸二氫鉀0.3-0.48/100!111、硫酸鎂0.04-0 · 06g/100ml、亞硒酸鈉4-5mg/100ml;所述溶劑為水。
[0056]所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為:葡萄糖5g/100ml、大豆 粉2g/100ml、玉米粉0.8g/100ml、蛋白胨1.5g/100ml、酵母膏0.8g/100ml、磷酸二氫鉀 0 · 35g/100ml、硫酸儀 0 · 05g/100ml、亞砸酸納 4.5mg/100ml。
[0057]所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為:葡萄糖4g/100ml、大豆 粉 lg/100ml、玉米粉 0.6g/100ml、蛋白胨1.0g/100ml、酵母膏 0.6g/100ml、磷酸二氫鉀 0.3g/ 100ml、硫酸儀 0 · 04g/100ml、亞砸酸納 4.0mg/100ml。
[0058]所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為：葡萄糖6g/100ml、大豆 粉 3g/100ml、玉米粉 1.0g/100ml、蛋白胨2.0g/100ml、酵母膏 1.0g/100ml、磷酸二氫鉀 0.4g/ 100ml、硫酸儀 0 · 06g/100ml、亞砸酸納 5 · 0mg/100ml。
[0059] 以上任一所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基豆柏粉、小麥粉和麩皮粉組成;所述豆柏粉、小麥粉 和麩皮粉的質(zhì)量比為3-5:2-4:2-4。
[0060] 所述豆柏粉、小麥粉和麩皮粉的質(zhì)量比具體可為4:3:3。
[0061] 固體發(fā)酵培養(yǎng)基乙中，豆柏粉、小麥粉和麩皮粉的質(zhì)量比具體可為3:4:2。
[0062] 固體發(fā)酵培養(yǎng)基丙中，豆柏粉、小麥粉和麩皮粉的質(zhì)量比具體可為5:2:4。
[0063] 本發(fā)明提供了地頂孢霉FA1603、培養(yǎng)地頂孢霉FA1603和地頂孢霉FA1603培養(yǎng)物。 地頂孢霉FA1603能夠高效積累蟲草素，同時(shí)能夠提高菌株的好氧生長能力，具有高濃度亞 硒酸鈉耐受性和轉(zhuǎn)化能力，其在進(jìn)行高生物量發(fā)酵的同時(shí)具有較高的硒轉(zhuǎn)化能力，可以用 來制備高蟲草素含量的富硒地頂孢霉培養(yǎng)物產(chǎn)品，該產(chǎn)品中有機(jī)硒含量高達(dá)lOOOmg/kg，且 99 %的硒為有機(jī)硒形態(tài)，其中硒蛋氨酸占富硒酵母產(chǎn)品有機(jī)硒含量的60 %。地頂孢霉 FA1603發(fā)酵生產(chǎn)高蟲草素含量的富硒地頂孢霉培養(yǎng)物產(chǎn)品的有機(jī)硒含量高，尤以活性的硒 蛋氨酸為主，而且富含蟲草活性成分，特別突出蟲草素的含量，其對(duì)于飼料添加方面，安全 無毒、無副作用，可顯著改善動(dòng)物肉質(zhì)營養(yǎng)，提高肉質(zhì)品質(zhì)，同時(shí)促進(jìn)動(dòng)物健康發(fā)育，提高機(jī) 體免疫力，具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0064] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。
[0065] 黃豆粉:西安文竹生物科技有限公司。
[0066] PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉20g，葡萄糖20g，瓊脂15_20g，蒸餾水定容至 lOOOmL，調(diào)pH至7 · 0; 121 °C高壓蒸汽滅菌22min。
[0067] roA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉20g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，磷酸二氫鉀0.8g，硫酸 鎂0· 3g，維生素 Bi 20mg，蒸餾水定容至1000ml，調(diào)pH至7 ·0; 121°C高壓蒸汽滅菌22min。
[0068] 再生液體培養(yǎng)基:在PDA液體培養(yǎng)基中添加20 % (W/V)甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑。 [0069]再生固體培養(yǎng)基:在PDA固體培養(yǎng)基中添加20% (W/V)甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑。 [0070]種子強(qiáng)化培養(yǎng)基的制備方法:黃豆粉20g，蔗糖10g，酵母膏5.0g，蛋白胨3.0g，磷酸 二氫鉀〇.5g，硫酸鎂O.lg，硫酸亞鐵100mg，維生素 Bi 20mg，維生素 B2 10mg，維生素 B6 10mg， 維生素 B12 50yg，蒸餾水定容至1000ml，制成營養(yǎng)液；1000ml營養(yǎng)液與1000g小麥混合均勻， 隔水蒸45min，121°C高壓蒸汽滅菌20-30min，得到種子強(qiáng)化培養(yǎng)基。各溶質(zhì)在營養(yǎng)液中的濃 度如下:黃豆粉2g/100ml、鹿糖lg/100ml、酵母膏0.5g/100ml、蛋白胨0.3g/100ml、磷酸二氫 鉀0.05g/100ml、硫酸鎂0.01g/100ml、硫酸亞鐵 10mg/100ml、維生素 Bi 2mg/100ml、維生素 B2 lmg/100ml、維生素 B6 lmg/100ml、維生素 Bi2 5yg/100ml。
[0071]液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法:取葡萄糖，大豆粉，玉米粉，蛋白胨，酵母膏，磷酸二 氫鉀，硫酸鎂，亞硒酸鈉，加蒸餾水定容至l〇〇ml; 125 °C高壓蒸汽滅菌30min。按照上述方法 分別制備得到液體發(fā)酵培養(yǎng)基甲、液體發(fā)酵培養(yǎng)基乙及液體發(fā)酵培養(yǎng)基丙。
[0072]液體發(fā)酵培養(yǎng)基甲中，各溶質(zhì)的濃度如下：葡萄糖5g/100ml、大豆粉2g/100ml、玉 米粉 0 · 8g/100ml、蛋白胨1 · 5g/100ml、酵母膏 0 · 8g/100ml、磷酸二氫鉀 0 · 35g/100ml、硫酸鎂 0 · 05g/100ml、亞砸酸納 4.5mg/100ml。
[0073]液體發(fā)酵培養(yǎng)基乙中，各溶質(zhì)的濃度如下：葡萄糖4g/100ml、大豆粉lg/100ml、玉 米粉0 · 6g/100ml、蛋白胨1 · 0g/100ml、酵母膏0 · 6g/100ml、磷酸二氫鉀0 · 3g/100ml、硫酸鎂 0 · 04g/100ml、亞砸酸納 4.0mg/100ml。
[0074]液體發(fā)酵培養(yǎng)基丙中，各溶質(zhì)的濃度如下：葡萄糖6g/100ml、大豆粉3g/100ml、玉 米粉1 · 0g/100ml、蛋白胨2 · 0g/100ml、酵母膏1 · 0g/100ml、磷酸二氫鉀0 · 4g/100ml、硫酸鎂 0 · 06g/100ml、亞砸酸納 5 · 0mg/100ml。
[0075]固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法:取豆柏粉、小麥粉和麩皮粉混合，125°C高壓蒸汽滅 菌30min。按照上述方法分別制備得到固體發(fā)酵培養(yǎng)基甲、固體發(fā)酵培養(yǎng)基乙及固體發(fā)酵培 養(yǎng)基丙。
[0076]固體發(fā)酵培養(yǎng)基甲中，豆柏粉、小麥粉和麩皮粉的質(zhì)量比為4:3:3。
[0077]固體發(fā)酵培養(yǎng)基乙中，豆柏粉、小麥粉和麩皮粉的質(zhì)量比為3:4:2。
[0078]固體發(fā)酵培養(yǎng)基丙中，豆柏粉、小麥粉和麩皮粉的質(zhì)量比為5:2:4。
[0079] 菌絲體干重:將液體發(fā)酵菌絲體80 °C烘干至恒重。
[0080]培養(yǎng)物干重:將固體二次發(fā)酵培養(yǎng)物80°C烘干至恒重。
[00811檢測蟲草素含量的方法:NY/T 2116-2012蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定高效液 相色譜法。
[0082]檢測硒含量的方法:參照參考文獻(xiàn)"王瑩，鐵梅，康平利，等.ICP-MS等三種測定蛹 蟲草硒含量方法的比較[J].光譜學(xué)與光譜分析，2009，29(3):815-818中的3，3-二氨基聯(lián) 苯胺分光光度法。
[0083]檢測硒蛋氨酸含量的方法：參照參考文獻(xiàn)"楊文婕，張明，陳競，等.LC-MS-MS同時(shí) 定量檢測硒蛋氨酸和硒胱氨酸[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2008，20(3): 204-207中的方法。 [0084] 實(shí)施例1、地頂孢霉FA1603的選育 [0085] 一、出發(fā)菌株菌絲體的收集
[0086] 1、以分離篩選自遼寧長白山的野生蛹蟲草子實(shí)體中的得到的地頂孢霉菌株為出 發(fā)菌株，將出發(fā)菌株接種至PDA固體斜面培養(yǎng)基，25 °C培養(yǎng)4天。
[0087] 2、用無菌的生理鹽水將步驟1培養(yǎng)好的PDA固體斜面培養(yǎng)基上的孢子洗脫，并通過 無菌濾紙過濾得到孢子懸液，孢子懸液中含孢子濃度為0.5X106個(gè)/mL。
[0088] 3、將步驟2制備的孢子懸液按5 %接種量轉(zhuǎn)接于PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)（2 5 °C， 200rpm，48h)，獲得液體培養(yǎng)物。
[0089] 4、將步驟3獲得的液體培養(yǎng)物6000rpm離心30min收集菌絲體，用無菌生理鹽水洗 滌二次，用無菌濾紙吸干水分，得到菌絲體。
[0090] 二、出發(fā)菌株原生質(zhì)體懸液的制備
[0091] 1、取步驟一得到的菌絲體，采用由溶壁酶、蝸牛酶和纖維素酶混合得到的酶解液 對(duì)菌絲體進(jìn)行酶解反應(yīng)，得到反應(yīng)后的酶解液。酶解反應(yīng)中：溶壁酶的使用濃度為1.2%，蝸 牛酶的使用濃度〇. 8 %，纖維素酶的使用濃度為1.0 %，酶解溫度為28°C，酶解時(shí)間為4h，調(diào) 節(jié)酶解pH為6.5。
[0092] 2、采用20% (W/V)甘露醇水溶液重懸步驟2得到的原生質(zhì)體細(xì)胞沉淀，得到原生質(zhì) 體懸液。
[0093]三、出發(fā)菌株原生質(zhì)體的常壓室溫等離子體(ARTP)誘變處理 [0094] 1、進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇誘變處理時(shí)間，方法如下：
[0095]取10_20yL的步驟二制備的原生質(zhì)體懸液，均勻涂布在金屬載片的上表面，干燥后 用鑷子將載片轉(zhuǎn)移至載物臺(tái)。采用高純氦氣作為等離子體的工作氣體處理菌物載片，設(shè)置 電源功率60W，照射距離3mm，等離子體的溫度26°C，氣流量10L/min，設(shè)置不同的處理組，各 組的處理時(shí)間分別為〇(對(duì)照）、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、558，每組設(shè)置三次重復(fù)。 將處理后的載片轉(zhuǎn)移到裝有l(wèi)mL再生液體培養(yǎng)基的EP管中，在振蕩器上再生培養(yǎng)60min，把 附著在載片上的微生物洗脫到再生液體培養(yǎng)基中，形成菌懸液。將菌懸液涂布至再生固體 培養(yǎng)基后置于25°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3天后對(duì)平板菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率，致死率計(jì)算方法 如下所示：
[0096] 致死率％ =(未經(jīng)誘變處理菌落數(shù)-經(jīng)誘變處理菌落數(shù))/未經(jīng)誘變菌落數(shù)X 100% [0097] 通過統(tǒng)計(jì)各處理組的致死率，選擇致死率為85%的照射處理時(shí)間進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)， 處理時(shí)間為25s。
[0098] 2、根據(jù)步驟1的結(jié)果，進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，方法如下：
[0099]取1 OyL的步驟二制備的原生質(zhì)體懸液，均勻涂布在金屬載片的上表面，干燥后用 鑷子將載片轉(zhuǎn)移至載物臺(tái)。采用高純氦氣作為等離子體的工作氣體處理菌物載片，設(shè)置電 源功率60W，照射距離3mm，等離子體的溫度26°C，氣流量10 L/min，處理時(shí)間為25s。樣品處 理完畢后，用無菌鑷子將載片放至裝有l(wèi)mL再生培養(yǎng)基的EP管中，在振蕩器上再生培養(yǎng) 60min，把附著在載片上的微生物洗脫到再生液體培養(yǎng)基中，形成新的菌懸液。
[0100] 四、優(yōu)良高效積累蟲草素的富硒地頂孢霉菌株的篩選
[0101] 1、將步驟三得到的新的菌懸液稀釋1〇5倍，取500yL稀釋液涂布到含亞硒酸鈉的抗 性平板，將在亞硒酸鈉抗性平板長出的菌落進(jìn)行影印至含有不同濃度的亞硒酸鈉的抗性平 板上(濃度依次從低到高）。經(jīng)過多次的抗性篩選過程，獲得在含亞硒酸鈉50mg/L的平板上 生長的菌落。
[0102] 2、將步驟1的平板上的生長快速的突變菌株接種到裝有l(wèi)mL PDA液體培養(yǎng)基的96 孔微孔板振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為200 rpm，培養(yǎng)3天，離心收集菌絲體，檢測菌絲 體蟲草素含量和硒含量。
[0103] 統(tǒng)計(jì)得到硒耐受濃度達(dá)50mg/L的3000株突變菌株，其中蟲草素含量提高的正突變 菌株為209株，蟲草素含量降低的負(fù)突變菌株為2791株。與出發(fā)菌株相比，正突變菌株中的 202株的蟲草素含量提高幅度為100 % -300 %，7株的蟲草素含量提高幅度為500 %以上。 [0104] 3、收集步驟2中蟲草素含量明顯提高的正突變菌株（7株），繼續(xù)進(jìn)行搖瓶復(fù)篩， 250ml搖瓶，裝液量30ml，亞硒酸鈉的添加濃度為45mg/L，培養(yǎng)條件為25 °C，200rpm，培養(yǎng)3 天，收集菌絲體，檢測其蟲草素含量、硒含量及硒轉(zhuǎn)化率。
[0105] 硒轉(zhuǎn)化率=(突變菌株液體發(fā)酵菌絲體中的硒含量/液體發(fā)酵培養(yǎng)基中總的硒含 量）X100%〇
[0106] 7株正突變菌株中，6株的蟲草素含量為"3. Og/kg菌絲體干重"以下，硒含量為 "200mg/kg菌絲體干重"以下，硒轉(zhuǎn)化率為85 %以下，另外1株菌（即編號(hào)FA 1603的菌株）的 蟲草素含量達(dá)到"8.〇g/kg菌絲體干重"，硒含量達(dá)到"1000mg/kg菌絲體干重"，硒轉(zhuǎn)化率達(dá) 到99.68%"。將編號(hào)FA 1603的菌株命名為菌株FA1603,進(jìn)行斜面保存及甘油保種。
[0107] 五、菌株FA1603的形態(tài)鑒定及分子鑒定
[0108] 1、將菌株FA1603接種至Η)Α固體斜面培養(yǎng)基（18X 180mm試管），25°C培養(yǎng)5天。5天 后，形態(tài)學(xué)特征如下：形成白色菌落，整體呈圓形，正面淡灰白色，背面由外至內(nèi)呈淡黃至棕 色，中央皺縮，菌苔較稀薄，直徑為25 · 1 ± 0 · 3mm;營養(yǎng)菌絲無色，光滑、寬度為1 · 2-2 · Ομπι，具 隔膜，偶聚成繩索狀的菌索或孢梗束，孢子梗直接從菌絲上長出，呈錐形，多單生，大小為 9.0-17.2 X 1.0-2. Ομπι。分生孢子無色、光滑成鏈狀，梭形，大小為2.9-4.0 X 1.0-1.5μπι。
[0109] 2、菌株FA1603的18S rDNA序列如序列表的序列1所示。
[0110] 經(jīng)過形態(tài)學(xué)及18S rDNA鑒定，可以確定菌株FA1603屬于地頂孢霉，因此重新將其 命名為地頂孢霉FA1603。
[0111] 六、地頂孢霉FA1603的保藏
[0112] 地頂抱霉FA1603(Acremonium terricola FA1603)于2016年06月 15日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC;地址：中國武漢，武漢大學(xué)；郵編:430072)，保藏編號(hào)為 CCTCC N0:M2016331。地頂孢霉FA1603(Acremonium terricola FA1603)CCTCC N0: M2016331簡稱為地頂孢霉FA1603。
[0113] 七、地頂孢霉FA1603的遺傳穩(wěn)定性
[0114] 將地頂孢霉FA1603進(jìn)行傳代培養(yǎng)以考察其遺傳穩(wěn)定性，每3天傳代一次，傳代15 代，每隔一代進(jìn)行搖瓶發(fā)酵測定菌株的蟲草素含量及硒的轉(zhuǎn)化與富集能力，結(jié)果顯示地頂 孢霉FA1603傳代過程中，發(fā)酵合成蟲草素的含量及硒的轉(zhuǎn)化與富集能力基本維持穩(wěn)定，具 有良好的遺傳穩(wěn)定性。
[0115] 實(shí)施例2、地頂孢霉FA1603的應(yīng)用
[0116] 一、地頂孢霉FA1603的種子強(qiáng)化培養(yǎng)
[0117] 1、將地頂孢霉FA1603接種至PDA固體培養(yǎng)基斜面(18X180mm試管），25°C培養(yǎng)5天。
[0118] 2、將步驟1培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接至含20yg/mL亞硒酸鈉的PDA固體培養(yǎng)基斜面（18 X 180mm試管），25°C，培養(yǎng)3天。
[0119] 3、用20mL無菌的生理鹽水將步驟2得到的TOA固體培養(yǎng)基斜面上的孢子洗脫(得到 的洗脫液中的孢子濃度為0.5X10 5個(gè)/mL)，將洗脫液全部轉(zhuǎn)接至裝有100g含50yg/mL亞硒 酸鈉的種子強(qiáng)化培養(yǎng)基的茄子瓶中，于培養(yǎng)箱中25°C培養(yǎng)3天，得到強(qiáng)化種子培養(yǎng)物(培養(yǎng) 物孢子濃度可達(dá)到1〇 12個(gè)/克培養(yǎng)物）。
[0120] 二、地頂孢霉FA1603液體深層發(fā)酵培養(yǎng)
[0121] 1、取100g步驟一制備的強(qiáng)化種子培養(yǎng)物接種于含有15L液體發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā) 酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，得到液體發(fā)酵產(chǎn)物。
[0122] 試驗(yàn)組甲采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基甲。
[0123]試驗(yàn)組乙采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基乙。
[0124] 試驗(yàn)組丙采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基丙。
[0125] 試驗(yàn)組甲的培養(yǎng)過程:發(fā)酵周期為96小時(shí)。發(fā)酵起始時(shí)，培養(yǎng)體系的pH為7.0,在發(fā) 酵培養(yǎng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測培養(yǎng)體系中的還原糖濃度及PH，通過加入70%的葡萄糖水溶液控制 培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在〇 .5-1.0g/100mL(每當(dāng)培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.5g/ 100mL時(shí)，加入70%的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達(dá)到1.0g/100mL)，通過 流加氨水控制發(fā)酵全過程中pH為7.0。培養(yǎng)全程參數(shù)為:發(fā)酵罐通氣量為15L/min，攪拌控制 為200rpm，溫度控制在25°C，控制溶解氧(D0)為40%。
[0126] 試驗(yàn)組乙的培養(yǎng)過程:發(fā)酵周期為96小時(shí)。發(fā)酵起始時(shí)，培養(yǎng)體系的pH為6.5，在發(fā) 酵培養(yǎng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測培養(yǎng)體系中的還原糖濃度及PH，通過加入70%的葡萄糖水溶液控制 培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在〇 .5-1.0g/100mL(每當(dāng)培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.5g/ 100mL時(shí)，加入70%的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達(dá)到1.0g/100mL)，通過 流加氨水控制發(fā)酵全過程中pH為6.0。培養(yǎng)全程參數(shù)為:發(fā)酵罐通氣量為10L/min，攪拌控制 為150rpm，溫度控制在25°C，控制溶解氧(D0)為30%。
[0127] 試驗(yàn)組丙的培養(yǎng)過程:發(fā)酵周期為96小時(shí)。發(fā)酵起始時(shí)，培養(yǎng)體系的pH為7.5,在發(fā) 酵培養(yǎng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測培養(yǎng)體系中的還原糖濃度及pH，通過加入70%的葡萄糖水溶液控制 培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在〇 .5-1.0g/100mL(每當(dāng)培養(yǎng)體系中的還原糖濃度低于0.5g/ 100mL時(shí)，加入70%的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原糖濃度達(dá)到1.0g/100mL)，通過 流加氨水控制發(fā)酵全過程中pH為7.5。培養(yǎng)全程參數(shù)為:發(fā)酵罐通氣量為20L/min，攪拌控制 為250rpm，溫度控制在25°C，控制溶解氧(DO)為50%。
[0128] 2、取100g步驟一制備的強(qiáng)化種子培養(yǎng)物接種于含有15L液體發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā) 酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0129] 試驗(yàn)組甲采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基甲。
[0130]試驗(yàn)組乙采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基乙。
[0131 ]試驗(yàn)組丙采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基丙。
[0132] 試驗(yàn)組甲的培養(yǎng)過程:發(fā)酵周期為96小時(shí)。發(fā)酵起始時(shí)，培養(yǎng)體系中的還原糖濃度 為50g/L，培養(yǎng)體系的pH為7.0，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測培養(yǎng)體系中的還原糖濃度及pH， 通過加入70 %的葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.5-1.0g/100mL(每當(dāng)培養(yǎng) 體系中的還原糖濃度低于0.5g/100mL時(shí)，加入70 %的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原 糖濃度達(dá)到1. 〇g/l〇〇mL)，通過流加氨水控制發(fā)酵全過程中pH為7.0。培養(yǎng)全程參數(shù)為:發(fā)酵 罐通氣量為15L/min，攪拌控制為200rpm，溫度控制在25°C，控制溶解氧(D0)為40%。
[0133] 試驗(yàn)組乙的培養(yǎng)過程:發(fā)酵周期為96小時(shí)。發(fā)酵起始時(shí)，培養(yǎng)體系中的還原糖濃度 為30g/L，培養(yǎng)體系的pH為6.5,在發(fā)酵培養(yǎng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測培養(yǎng)體系中的還原糖濃度及pH， 通過加入70 %的葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.5-1.0g/100mL(每當(dāng)培養(yǎng) 體系中的還原糖濃度低于0.5g/100mL時(shí)，加入70 %的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原 糖濃度達(dá)到1. 〇g/l〇〇mL)，通過流加氨水控制發(fā)酵全過程中pH為6.0。培養(yǎng)全程參數(shù)為:發(fā)酵 罐通氣量為l〇L/min，攪拌控制為150rpm，溫度控制在25°C，控制溶解氧(D0)為30%。
[0134] 試驗(yàn)組丙的培養(yǎng)過程:發(fā)酵周期為96小時(shí)。發(fā)酵起始時(shí)，培養(yǎng)體系中的還原糖濃度 為70g/L，培養(yǎng)體系的pH為7.5,在發(fā)酵培養(yǎng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測培養(yǎng)體系中的還原糖濃度及pH， 通過加入70 %的葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的還原糖濃度在0.5-1.0g/100mL(每當(dāng)培養(yǎng) 體系中的還原糖濃度低于0.5g/100mL時(shí)，加入70 %的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的還原 糖濃度達(dá)到1. 〇g/l〇〇mL)，通過流加氨水控制發(fā)酵全過程中pH為7.5。培養(yǎng)全程參數(shù)為:發(fā)酵 罐通氣量為20L/min，攪拌控制為250rpm，溫度控制在25°C，控制溶解氧(D0)為50%。
[0135] 完成發(fā)酵培養(yǎng)后，取整個(gè)培養(yǎng)體系，通過3000rpm離心15min的方式收集地頂孢霉 FA1603液體發(fā)酵菌絲體。
[0136] 三、地頂孢霉FA1603的固體二次發(fā)酵
[0137] 取步驟二的1得到的液體發(fā)酵產(chǎn)物直接接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基上(每1L的液體發(fā) 酵產(chǎn)物接種至5kg的固體發(fā)酵培養(yǎng)基上），進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)，得到固體發(fā)酵培養(yǎng)物。
[0138] 試驗(yàn)組甲采用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基為固體發(fā)酵培養(yǎng)基甲。
[0139] 試驗(yàn)組乙采用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基為固體發(fā)酵培養(yǎng)基乙。
[0140] 試驗(yàn)組丙采用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基為固體發(fā)酵培養(yǎng)基丙。
[0141]試驗(yàn)組甲的固體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：固體發(fā)酵溫度25°C，濕度為70%，光照強(qiáng) 度為150Lx，發(fā)酵時(shí)間為4天，每天光照時(shí)間10小時(shí)、黑暗14小時(shí)。
[0142]試驗(yàn)組乙的固體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：固體發(fā)酵溫度25°C，濕度為60%，光照強(qiáng) 度為lOOLx，發(fā)酵時(shí)間為5天，每天光照時(shí)間10小時(shí)、黑暗14小時(shí)。
[0143] 試驗(yàn)組丙的固體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：固體發(fā)酵溫度25°C，濕度為80%，光照強(qiáng) 度為200Lx，發(fā)酵時(shí)間為3天，每天光照時(shí)間10小時(shí)、黑暗14小時(shí)。
[0144] 四、地頂孢霉FA1603固體培養(yǎng)物的收集
[0145] 完成步驟三的培養(yǎng)后，收集固體培養(yǎng)物，直接60-80°C烘干至水分< 10%，然后將 其粉碎并過使用40目篩網(wǎng)過濾，得到富硒地頂孢霉FA1603固體二次發(fā)酵培養(yǎng)物。
[0146] 五、對(duì)照菌株培養(yǎng)物的制備
[0147] 將出發(fā)菌株代替地頂孢霉FA1603按照步驟一、二、三、四進(jìn)行操作，收集出發(fā)菌株 液體發(fā)酵菌絲體及固體二次發(fā)酵培養(yǎng)物。
[0148] 六、富硒能力和蟲草素含量的測定
[0149] 1、液體發(fā)酵菌絲體中硒含量及富硒效率測定
[0150] 檢測步驟二的2收集的地頂孢霉FA1603液體發(fā)酵菌絲體和步驟五得到的出發(fā)菌株 液體發(fā)酵菌絲體的硒含量及富硒效率。
[0151 ]富硒效率(硒轉(zhuǎn)化率）=(液體發(fā)酵菌絲體中的硒含量/液體發(fā)酵培養(yǎng)基中總的硒 含量）Χ1〇〇%。
[0152] 檢測結(jié)果為如下：
[0153] 實(shí)驗(yàn)組甲的地頂孢霉FA1603液體發(fā)酵菌絲體的硒含量達(dá)1000mg/kg菌絲體干重， 每1L發(fā)酵液可獲得菌絲體干重20.5g，而每1L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中總的無機(jī)硒含量為 20.565mg，菌株的硒轉(zhuǎn)化率達(dá)99.68%。
[0154] 實(shí)驗(yàn)組乙的地頂孢霉FA1603液體發(fā)酵菌絲體的硒含量達(dá)800mg/kg菌絲體干重，每 1L發(fā)酵液可獲得菌絲體干重16.5g，而每1L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中總的無機(jī)硒含量為20.565mg， 菌株的硒轉(zhuǎn)化率達(dá)80.23%。
[0155] 實(shí)驗(yàn)組丙的地頂孢霉FA1603液體發(fā)酵菌絲體的硒含量達(dá)900mg/kg菌絲體干重，每 1L發(fā)酵液可獲得菌絲體干重18.5g，而每1L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中總的無機(jī)硒含量為20.565mg， 菌株的硒轉(zhuǎn)化率達(dá)89.96 %。
[0156] 出發(fā)菌株由于在含亞硒酸鈉濃度為45mg/L的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中菌絲體生長的不 好，每1L發(fā)酵液可獲得菌絲體干重2.5g，菌絲體中硒含量為5.0mg/kg菌絲體干重，而每1L液 體發(fā)酵培養(yǎng)基中總的無機(jī)硒濃度為20.565mg，硒轉(zhuǎn)化率為6.08 %。
[0157] 2、液體發(fā)酵菌絲體中硒蛋氨酸含量的測定
[0158] 檢測步驟二的2收集的地頂孢霉FA1603液體發(fā)酵菌絲體和步驟五得到的出發(fā)菌株 液體發(fā)酵菌絲體中的硒蛋氨酸含量。
[0159] 檢測結(jié)果為如下：
[0160] 實(shí)驗(yàn)組甲的地頂孢霉FA1603液體發(fā)酵菌絲體中的硒蛋氨酸的含量為600mg/kg菌 絲體干重，占富硒培養(yǎng)物產(chǎn)品有機(jī)硒含量的60%。
[0161] 實(shí)驗(yàn)組乙的地頂孢霉FA1603液體發(fā)酵菌絲體中的硒蛋氨酸的含量為400mg/kg菌 絲體干重，占富硒培養(yǎng)物產(chǎn)品有機(jī)硒含量的40%。
[0162] 實(shí)驗(yàn)組丙的地頂孢霉FA1603液體發(fā)酵菌絲體中的硒蛋氨酸的含量為500mg/kg菌 絲體干重，占富硒培養(yǎng)物產(chǎn)品有機(jī)硒含量的50%。
[0163] 出發(fā)菌株菌絲體中的硒蛋氨酸的含量為0.5 mg/kg菌絲體干重，占富硒培養(yǎng)物產(chǎn) 品有機(jī)砸含量的10 %。
[0164] 3、固體二次發(fā)酵培養(yǎng)物中蟲草素含量的測定
[0165] 檢測步驟四收集的地頂孢霉FA1603固體二次發(fā)酵培養(yǎng)物和步驟五得到的出發(fā)菌 株固體二次發(fā)酵培養(yǎng)物中的蟲草素含量。
[0166] 檢測結(jié)果為如下：
[0167] 實(shí)驗(yàn)組甲的地頂孢霉FA1603固體二次發(fā)酵培養(yǎng)物中的蟲草素含量達(dá)到8.0g/kg培 養(yǎng)物干重。
[0168] 實(shí)驗(yàn)組乙的地頂孢霉FA1603固體二次發(fā)酵培養(yǎng)物中的蟲草素含量達(dá)到6.0g/kg培 養(yǎng)物干重。
[0169] 實(shí)驗(yàn)組丙的地頂孢霉FA1603固體二次發(fā)酵培養(yǎng)物中的蟲草素含量達(dá)到7.0g/kg培 養(yǎng)物干重。
[0170]出發(fā)菌株固體二次發(fā)酵培養(yǎng)物中的蟲草素含量為0.25g/kg培養(yǎng)物干重。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 地頂孢霉FA1603(Acremonium terricola FA1603)，其保藏編號(hào)為CCTCC NO: M2016331。2. -種地頂孢霉培養(yǎng)物，是通過培養(yǎng)權(quán)利要求1所述地頂孢霉FA1603得到的。3. 權(quán)利要求1所述地頂孢霉FA1603或權(quán)利要求2所述地頂孢霉培養(yǎng)物的應(yīng)用，為如下 (1)或(2)或(3): (1) 制備富硒飼料添加劑； (2) 制備富砸保健品； (3) 制備富砸食品。4. 一種產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1所述地頂孢霉FA1603或權(quán)利要求2所述地頂孢霉 培養(yǎng)物。5. -種培養(yǎng)權(quán)利要求1所述地頂孢霉FA1603的方法，依次包括如下步驟(a)、步驟(b)和 步驟(c): 步驟(a):采用種子強(qiáng)化培養(yǎng)基培養(yǎng)地頂孢霉FA1603; 步驟(b):將步驟(a)的產(chǎn)物接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)； 步驟(c):將步驟(b)的產(chǎn)物接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)； 所述種子強(qiáng)化培養(yǎng)基的原料配比為：1L營養(yǎng)液:0.5-1.5kg小米;所述營養(yǎng)液由溶質(zhì)和 溶劑組成;所述溶質(zhì)及其在所述營養(yǎng)液中的濃度如下:黃豆粉l_3g/100ml、蔗糖0.5-1.5g/ 100ml、酵母膏 0 · 4-0 · 6g/100ml、蛋白胨0 · 2-0 · 4g/100ml、磷酸二氫鉀 0 · 04-0 · 06g/100ml、硫 酸鎂0.005-0.015g/100ml、硫酸亞鐵8-12mg/100ml、維生素 R1 l-3mg/100ml、維生素 B2 0 · 5-1 · 5mg/100ml、維生素 B6 0 · 5-1 · 5mg/100ml、維生素 R12 4-6yg/100ml;所述溶劑為水； 所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成;所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃 度如下：葡萄糖4-6g/100ml、大豆粉l-3g/100 ml、玉米粉0.6-1.0g/100ml、蛋白胨l-2g/ 100ml、酵母霄 0 · 6-1 · 0g/100ml、憐酸二氛鐘0 · 3-0 · 4g/l 00ml、硫酸儀 0 · 04-0 · 06g/100ml、亞 硒酸鈉4-5mg/100ml;所述溶劑為水； 所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基由豆柏粉、小麥粉和麩皮粉組成;所述豆柏粉、小麥粉和麩皮粉的 質(zhì)量配比為3-5:2-4:2-4。6. -種制備地頂孢霉培養(yǎng)物的方法，包括如下步驟：培養(yǎng)權(quán)利要求1所述地頂孢霉 FA1603。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述方法依次包括如下步驟(a)、步驟(b)和 步驟(c): 步驟(a):采用權(quán)利要求5中所述的種子強(qiáng)化培養(yǎng)基培養(yǎng)地頂孢霉FA1603; 步驟(b):將步驟(a)的產(chǎn)物接種至權(quán)利要求5中所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)； 步驟(c):將步驟(b)的產(chǎn)物接種至權(quán)利要求5中所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。8. -種用于培養(yǎng)權(quán)利要求1所述地頂孢霉FA1603的試劑盒，包括權(quán)利要求5中所述的種 子強(qiáng)化培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基和固體發(fā)酵培養(yǎng)基。9. 一種用于制備地頂孢霉培養(yǎng)物的試劑盒，包括權(quán)利要求5中所述的種子強(qiáng)化培養(yǎng)基、 液體發(fā)酵培養(yǎng)基和固體發(fā)酵培養(yǎng)基。10. 權(quán)利要求7或8所述試劑盒的應(yīng)用，為如下（1)或(2)或(3): (1)制備富硒飼料添加劑； (2) 制備富砸保健品； (3) 制備富砸食品
【文檔編號(hào)】A23K10/18GK105969674SQ201610571224
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年7月20日
【發(fā)明人】黃欽耿, 黃建忠, 蔣順進(jìn), 方文棋, 吳松剛
【申請(qǐng)人】福建師范大學(xué), 廣東容大生物股份有限公司